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문제 정의
- 국내에서는 무지개송어 해수순치 과정 중에 발생하는 질병에 대해서는 보고된바 없으나 2013년 제주도에 위치한 육상수조식 양식장에서 해수순치 과정중인 무지개송어에서 대량폐사 (누적폐사율: 약 30%)가 발생하였다. 본 연구에서는 폐사 원인을 조사한 결과 Vibrio anguillarum이 관련되어 있음이 확인되어 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- (1997)와 Miller et al. (1998)의 방법에 준해 IPNV (P1: 5' AGAGATCACTGACTTCACAAGTGAC-3', P2: 5' TGTGCACCACAGGAAAGATGACTC-3'), IHNV (IG1: 5' ATGATCACCACTCCGCTCATT-3', ID3: 5'-GATTGGAGATTTTATCAACA-3') 및 VHSV (VG1: 5'-ATGGAATGGAACACTTTTTTC-3’, VD3: 5'-TGTGATCATGGGTCCTGGTG-3') 검출 primer를 사용하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 실시하였다.
- 2. Comparison of the partial 16S rDNA sequence of isolated bacterium in this study and Vibrio anguillarum isolated from salmonids (Genbank number: DQ247926), olive flounder (CP006699), turbot (KF770027), seabass (GU573927) and carp (FJ824662).
- Florfenicol, enrofloxacin, doxycycline, oxytetracycline, oxolinic acid, sulfamethoxazole + trimethoprim, erythromycin, clindamycin, amoxycillin, neomycin 및 ampicillin 11종의 항균제 감수성 시험은 Sensi disk (BBL, USA)를 이용한 디스크 확산법으로 무지개송어로부터 분리한 세균의 약제 감수성 검사를 실시하였다. PBS buffer에 현탁된 세균은 TSA 배지에 도말하여 15℃에서 48시간 배양한 후, 감수성 여부를 판정하였다.
- (1998)의 방법에 준해 63F (5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3')와 1406R (5'-ACGGGCGGTGTGTRCAA-3') primer를 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% agarose gel을 이용하여 확인하였고, gel purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제 후 ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 GenBank의 Blast 분석을 실시하여 동정하였다.
- 5% agarose gel을 이용하여 확인하였고, gel purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제 후 ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 GenBank의 Blast 분석을 실시하여 동정하였다.
- 채집된 시료는 외부 및 내부 증상을 육안적으로 관찰하였고, 피부 궤양 부위를 비롯한 각종 장기를 대상으로 광학현미경을 사용하여 기생충 및 진균 검사를 실시하였다. 세균 검사는 간, 비장 및 신장 조직을 무균적으로 채취하여 tryptic soy agar (TSA; Difco, USA)와 marine agar (MA; Difco, USA)에 도말한 후, 15℃에서 5일간 배양하여 세균을 분리하였다. 바이러스 검사는 신장과 비장 조직을 Hanks’ balanced salt solution (HBSS; Gibco, USA)으로 1:9 (0.
- 세균 배양법으로 분리된 세균은 16S rDNA 염기 서열을 분석하여 동정하였다. 염기서열 분석을 위한 PCR은 Suzuki and Giovannoni (1996)와 Marchesi et al.
- 시료는 2013년 4월 제주도의 육상 수조식 양식장에서 해수순치 과정중인 무지개송어 치어 (체중: 20±5 g, 체장: 11±2 cm)로 힘없이 유영하다 폐사되는 개체 10마리를 채집하여 실험에 사용하였다. 채집된 시료는 외부 및 내부 증상을 육안적으로 관찰하였고, 피부 궤양 부위를 비롯한 각종 장기를 대상으로 광학현미경을 사용하여 기생충 및 진균 검사를 실시하였다. 세균 검사는 간, 비장 및 신장 조직을 무균적으로 채취하여 tryptic soy agar (TSA; Difco, USA)와 marine agar (MA; Difco, USA)에 도말한 후, 15℃에서 5일간 배양하여 세균을 분리하였다.
- 45 μm syringe filter로 여과하여 바이러스 분리용 시료로 사용하였다. 해당 시료는 fathead minnow caudal trunk cell line (FHM)과 Chinook salmon embryo cell line (CHSE-214)에 접종하여 15℃에 배양하면서 세포변성효과 (Cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 연어과 어류의 주요 바이러스인 infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) 및 VHS virus (VHSV)의 감염유무를 확인하기 위하여, 신장과 비장 조직으로부터 RNA extraction kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 RNA를 분리한 후, Suzuki et al.
- 본 연구에서는 해수순치 과정에서 대량 폐사되는 무지개송어를 대상으로 질병검사를 실시하였다. 해수순치 과정은 충청북도에 위치한 종묘장에서 생산된 무지개송어 치어 총 4만 마리를 지하수가 들어 있는 수조 (사육수온: 17℃)에 수용한 후 해수의 유입을 점차적으로 늘리는 방법으로 (염분의 농도: 1일에 약 1 practical salinity units (PSU)씩 상승시킴) 실시하였다. 사육수의 염분 농도가 5 PSU가 되었을 때, 힘없이 수면 위를 유영을 보이는 개체가 관찰되기 시작하였고, 폐사체가 발생한 후 7일 동안 약 5,000 마리가 폐사되었다 (폐사율: 13%).
대상 데이터
- 바이러스 검사는 신장과 비장 조직을 Hanks’ balanced salt solution (HBSS; Gibco, USA)으로 1:9 (0.5 g/ 4.5 mL)가 되게 처리하여 마쇄하고, 그 마쇄액을 0.45 μm syringe filter로 여과하여 바이러스 분리용 시료로 사용하였다.
- 본 연구에서는 해수순치 과정에서 대량 폐사되는 무지개송어를 대상으로 질병검사를 실시하였다. 해수순치 과정은 충청북도에 위치한 종묘장에서 생산된 무지개송어 치어 총 4만 마리를 지하수가 들어 있는 수조 (사육수온: 17℃)에 수용한 후 해수의 유입을 점차적으로 늘리는 방법으로 (염분의 농도: 1일에 약 1 practical salinity units (PSU)씩 상승시킴) 실시하였다.
- 시료는 2013년 4월 제주도의 육상 수조식 양식장에서 해수순치 과정중인 무지개송어 치어 (체중: 20±5 g, 체장: 11±2 cm)로 힘없이 유영하다 폐사되는 개체 10마리를 채집하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 염기서열 분석을 위한 PCR은 Suzuki and Giovannoni (1996)와 Marchesi et al. (1998)의 방법에 준해 63F (5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3')와 1406R (5'-ACGGGCGGTGTGTRCAA-3') primer를 사용하여 PCR을 실시하였다.
성능/효과
- V. anguillarum에 대한 약제 감수성 결과, florfenicol, enrofloxacin, doxycycline, oxytetracycline, oxolinic acid 및 sulfamethoxazole + trimethoprim에서 inhibition zone이 35-44 mm로 감수성이 높게 나타났다 (Table 1). 약제 감수성 결과를 토대로 양식 현장에서 oxytetracycline 약욕과 enrofloxacin을 경구 투여한 결과, 폐사율은 1일 800마리에서 10마리 이하로 급격하게 감소하였다 (data not shown).
- 병어를 대상으로 병원체 검사를 실시한 결과, 피부 궤양 부위와 내부 장기로부터 기생충과 진균은 검출되지 않았고, 바이러스 검사에 사용된 신장과 비장 조직에서도 CPE는 관찰되지 않았다. 또한 연어과 어류의 주요 바이러스인 IPNV, IHNV 및 VHSV에 대한 RT-PCR을 실시한 결과에서도 모두 음성 반응이 확인되었다 (data not shown). 세균 검사 결과에서는 검사 개체 5마리에서 간, 비장 및 신장조직에서 동일한 형태의 colony가 시료 당 200개 이상 분리되었다.
- 병어를 대상으로 병원체 검사를 실시한 결과, 피부 궤양 부위와 내부 장기로부터 기생충과 진균은 검출되지 않았고, 바이러스 검사에 사용된 신장과 비장 조직에서도 CPE는 관찰되지 않았다. 또한 연어과 어류의 주요 바이러스인 IPNV, IHNV 및 VHSV에 대한 RT-PCR을 실시한 결과에서도 모두 음성 반응이 확인되었다 (data not shown).
- , 2011). 본 연구에서는 분리된 V. anguillarum를 사용하여 해수순치중의 무지개송어를 대상으로 감염실험을 실시하지는 못하였으나 병어로부터 V. anguillarum이 다수 분리되며, 기존에 무지개송어에서 보고된 V. anguillarum 감염증과 병변이 유사한 것으로 보아 해수순치 과정 중에서 폐사된 무지개송어는 V. anguillarum 감염에 의한 것으로 사료된다. V.
- TSA와 MA 배지에서 배양된 세균은 미색의 원형 집락을 형성하였다 (data not shown). 분리된 세균의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과, 기수와 해수사육 연어과 어류, 넙치(Paralichthys olivaceus), 터봇 (Scophthalmus maximus), 농어 (Lates calcarifer) 및 잉어 (Cyprinus car-pio)에서 보고된 Vibrio anguillarum과 100% (875/875 bp) 일치하는 것으로 확인되었다 (Fig. 2).
- 해수순치 과정은 충청북도에 위치한 종묘장에서 생산된 무지개송어 치어 총 4만 마리를 지하수가 들어 있는 수조 (사육수온: 17℃)에 수용한 후 해수의 유입을 점차적으로 늘리는 방법으로 (염분의 농도: 1일에 약 1 practical salinity units (PSU)씩 상승시킴) 실시하였다. 사육수의 염분 농도가 5 PSU가 되었을 때, 힘없이 수면 위를 유영을 보이는 개체가 관찰되기 시작하였고, 폐사체가 발생한 후 7일 동안 약 5,000 마리가 폐사되었다 (폐사율: 13%). 병어의 대부분은 체표에 궤양이 형성되어 있었고 (Fig.
- 또한 연어과 어류의 주요 바이러스인 IPNV, IHNV 및 VHSV에 대한 RT-PCR을 실시한 결과에서도 모두 음성 반응이 확인되었다 (data not shown). 세균 검사 결과에서는 검사 개체 5마리에서 간, 비장 및 신장조직에서 동일한 형태의 colony가 시료 당 200개 이상 분리되었다. TSA와 MA 배지에서 배양된 세균은 미색의 원형 집락을 형성하였다 (data not shown).
- anguillarum에 대한 약제 감수성 결과, florfenicol, enrofloxacin, doxycycline, oxytetracycline, oxolinic acid 및 sulfamethoxazole + trimethoprim에서 inhibition zone이 35-44 mm로 감수성이 높게 나타났다 (Table 1). 약제 감수성 결과를 토대로 양식 현장에서 oxytetracycline 약욕과 enrofloxacin을 경구 투여한 결과, 폐사율은 1일 800마리에서 10마리 이하로 급격하게 감소하였다 (data not shown). 이상의 결과, 항생제 투여를 통하여 무지개송어의 V.
- 약제 감수성 결과를 토대로 양식 현장에서 oxytetracycline 약욕과 enrofloxacin을 경구 투여한 결과, 폐사율은 1일 800마리에서 10마리 이하로 급격하게 감소하였다 (data not shown). 이상의 결과, 항생제 투여를 통하여 무지개송어의 V.anguillarum 감염증 제어는 가능할 것으로 사료된다.
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