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제안 방법
- 본 연구에서는 2014년에서 2017년까지 전라남도 고흥, 제주의 해수에서 사육하고 있던 무지개송어에서 V. anguillarum의 감염이 확인되어 원인체를 분리·동정하였으며, 바다송어에서 분리한 V. anguillarum의 생화학적, 혈청학적, 유전적 특성을 분석하였다.
- 본 연구에서는 8종류의 항생제에 대한 14개의 V. anguillarum 균주의 MIC를 측정하였으며, 그 결과를 Table 3에 나타내었다. CLSI의 Vibrio spp.
- 세균 pellet은 promega genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 분리된 모든 균주는 16S rRNA (27F, AGAGTTTGATCMTGGCTCAG; 1,492R, TACGGYTACCTTGTTACGAC) (Kim et al., 2005), ompU gene (encoding outer membrane protein, ompU-F, ATGAACAAAACTCTGATTGCTT; ompU-R, TAGAAGTCGTAACGTAGACC) 분석을 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 16S rRNA는 95℃에서 pre-denaturation을 5분, 95℃ (30초)-55℃ (30초)-72℃ (30초)의 조건으로 30cycles을 반복한 뒤 72℃에서 5분간 post-extension을 실시하였다.
- 생화학적 특성을 분석하기 위해 V. anguillarum 균주를 1% NaCl이 첨가된 TSA배지에서 25℃, 24시간 배양한 후 API 20NE kit (BIOMERIEUX, France)와 API ZYM (for semi-quantitation of enzymatic activities) kit (BIOMERIEUX, France)를 사용하였으며, oxidase test를 실시하였다. 실험방법은 순수배양된 균 집락을 제조사의 방법에 따라 스트립에 접종하고, 25℃에서 24시간 동안 배양한 후 결과를 판정하였다.
- 유전적 특성 분석을 위하여 각 분리 균주를 1% NaCl이 첨가된 TSB배지에서 24시간 배양한 후 13,000 rpm에서 2분간 원심분리, 상층액을 제거하여 세균 pellet을 제작하였다. 세균 pellet은 promega genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 분리된 모든 균주는 16S rRNA (27F, AGAGTTTGATCMTGGCTCAG; 1,492R, TACGGYTACCTTGTTACGAC) (Kim et al.
- anguillarum 7균주 및 참조균주 7균주를 시험에 사용하였으며 이를 Table 1에 나타내었다. 세균의 배양은 1% NaCl을 첨가한 tryptic soy agar(TSA, Becton Dickinson, USA) 또는 brain heart infusion agar(BHIA, Becton Dickinson, USA)배지에 도말한 후, 25℃에서 24시간 배양하여 균의 성상을 확인하고 이를 계대배양하여 이후의 실험에 사용하였다.
- 슬라이드 응집반응으로 혈청형을 분석하였으며, 참조균주(V.anguillarum ATCC43305, serotype O1; KCTC2711, serotype O2; ATCC43309, serotype O3; ATCC43308, serotype O4 및 ATCC43311, serotype O7)에 대한 토끼항혈청을 제작하여 분석에 사용하였다. 슬라이드글라스에 V.
- 슬라이드글라스에 V. anguillarum에 대한 5종류의 토끼 항혈청을 각각 70 μL씩 떨어뜨리고 본 연구에서 시험한 무지개송어, 은어 및 숭어 유래 V. anguillarum 9 균주(RT1-7, SF, FM)를 McFarland no. 6 standard으로 멸균 생리식염수에 현탁한 균액을 각 10 μL 떨어뜨려 잘 섞어 30초 이내에 응집 형성 유무를 확인하였다.
- anguillarum 균주를 1% NaCl이 첨가된 TSA배지에서 25℃, 24시간 배양한 후 API 20NE kit (BIOMERIEUX, France)와 API ZYM (for semi-quantitation of enzymatic activities) kit (BIOMERIEUX, France)를 사용하였으며, oxidase test를 실시하였다. 실험방법은 순수배양된 균 집락을 제조사의 방법에 따라 스트립에 접종하고, 25℃에서 24시간 동안 배양한 후 결과를 판정하였다. 염분농도가 균의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 분리 균주(RT1, RT3) 및 참조균주(ATCC43305)를 대상으로 NaCl을 농도별로(0.
- 실험방법은 순수배양된 균 집락을 제조사의 방법에 따라 스트립에 접종하고, 25℃에서 24시간 동안 배양한 후 결과를 판정하였다. 염분농도가 균의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 분리 균주(RT1, RT3) 및 참조균주(ATCC43305)를 대상으로 NaCl을 농도별로(0.5-7%) 첨가한 tryptic soy broth (TSB, Becton Dickinson, USA)배지에 24-72시간 배양하여 균의 성장유무를 확인하였다.
- 5% agarose gel (Bioneer, Korea)을 사용하여 전기영동 한 후 UV transilluminator(Alpha Innotech, USA)이용해 band를 확인하였고, 염기서열을 분석하였다. 유전자 염기서열분석은 MEGA6 program과 GENETYX Ver. 8.0 (SDC Software Development, Japan)를 사용하였으며, 결정된 각 염기서열은 national center for biotechnology institute (NCBI)에서 제공하는 basic local alignment search tool (BLAST)을 이용하여 기존에 보고된 V. anguillarum의 유전자와 비교 분석하였다. Blast search의 염기서열 정보를 바탕으로 bioedit Ver.
- 유전적 특성 분석을 위하여 각 분리 균주를 1% NaCl이 첨가된 TSB배지에서 24시간 배양한 후 13,000 rpm에서 2분간 원심분리, 상층액을 제거하여 세균 pellet을 제작하였다. 세균 pellet은 promega genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
- 6 standard으로 멸균 생리식염수에 현탁한 균액을 각 10 μL 떨어뜨려 잘 섞어 30초 이내에 응집 형성 유무를 확인하였다. 응집은 어두운 배경에서 슬라이드를 측면에서 관찰하였으며, 대조군은 균을 현탁하지 않은 멸균 생리식염수를 사용하였다.
- ompU gene은 95℃에서 pre-denaturation을 5분간, 95℃ (30초)-50℃ (30초)-72℃ (60초)의 조건으로 25cycles을 반복한 뒤 72℃에서 5분간 post-extension을 실시하여 해당 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 EtBr이 포함된 1.5% agarose gel (Bioneer, Korea)을 사용하여 전기영동 한 후 UV transilluminator(Alpha Innotech, USA)이용해 band를 확인하였고, 염기서열을 분석하였다. 유전자 염기서열분석은 MEGA6 program과 GENETYX Ver.
대상 데이터
- 본 연구에서는 2014-2017년까지 전라남도 고흥 및 제주지역 해수에서 사육하던 무지개송어에서 분리한 V. anguillarum 7균주 및 참조균주 7균주를 시험에 사용하였으며 이를 Table 1에 나타내었다. 세균의 배양은 1% NaCl을 첨가한 tryptic soy agar(TSA, Becton Dickinson, USA) 또는 brain heart infusion agar(BHIA, Becton Dickinson, USA)배지에 도말한 후, 25℃에서 24시간 배양하여 균의 성상을 확인하고 이를 계대배양하여 이후의 실험에 사용하였다.
데이터처리
- anguillarum의 유전자와 비교 분석하였다. Blast search의 염기서열 정보를 바탕으로 bioedit Ver.7.2.1를 사용하여 multiple alignments를 실시하였고, MEGA6 program(http://www.megasoftware.net; Tamura et al., 2013)을 사용한 근린결합분석 (NJ, neighbor-joining analysis; 1,000 rounds of boostrap)을 통하여 각 염기서열간 유전적 거리와 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다.
이론/모형
- 8개의 항생제(gentamicin, tetracycline, doxycycline, amoxicillin, erythromycin, ciprofloxacin, chloramphenicol 및 clindamycin)에 대한 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration; MIC)는 E-test (AB Biodisk) disk diffusion 방법으로 측정하였다. 그 결과는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2005, 2011)의 Vibrio spp.
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