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문제 정의
- 건조과정을 거친 강황 잎 추출물을 human fibroblast CCD986sk에 투여해, 세포생존율을 측정하여 향장 및 기능성 소재로서의 사용이 적합한지에 대해 검토하였다. 실험결과, 각 시료의 농도별 세포 독성은 농도 의존적으로 증가하였으며, 최대 25%를 넘지 않았다 (Fig.
- 따라서 본 연구에서는 대량으로 폐기되는 강황 잎을 추출방법을 달리하여 활성물질의 손실이 적은 추출법을 확인하고자 하였고, 이를 통하여 기능성 향장소재로서의 활용될 수 있도록 하기 위하여 본 연구를 수행하였다.
- 강황은 일상생활에서 카레 등 항신료 및 건강식품으로 여러 방면에서 이용되고 있다. 본초학에서는 강황을 생약으로 사용할 시 혈액순환 촉진 및 통증완화 효과가 뛰어나다고 하였다. 최근 강황의 지표물질인 curcumin의 약리활성이 보고되면서 항혈전, 혈중지질강하, 항산화, 항염증, 항종양, 항균작용, 미백 등에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는 추세다 (Jayaprakasha et al.
- 이 결과로 보아, 건조수율의 경우에는 수분함량의 차이 의하여 측정된 수율이기 때문에 추출수율에 비하여 눈에 띄는 차이를 보이지 않는 것이라 사료되며, 건조된 강황 잎을 추출했을 때 건조 방법별로 큰 차이를 보이는 것은 건조과정 중 온도에 따른 유효물질의 손실에 의한 것으로 보여진다(Nam, 2005). 이에 보다 정확한 활성차이를 확인하고, 기능성 소재로서의 이용 가능성을 확인하고자 세포 독성 및 향장실험을 진행하였다.
- 피부 미백 효과와 함께 향장활성의 중요한 요소 중 하나인 피부보호 효과를 알아보기 위하여 hyaluronidase 억제활성을 확인하였다. Hyaluronidase는 피부 보습 및 탄력 유지에 기여하는 hyaluronic acid의 분해효소로 피부면역에 관련된 것으로 알려져 있다.
제안 방법
- Ethyl alcohol과 물을 추출 용매로 사용하였으며, ethyl alcohol의 경우 70℃, 물에 경우 100℃에서 24시간 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들을 감압농축장치 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축을 하였고, 동결건조를 한 후 분말로 제조하여 실험에 사용하였다.
- Hyaluronidase 활성 저해 효과는 0.1 M acetate buffer(pH 3.5)를 용매로 한 hyaluronidase (7900 unit/㎖) 50 ㎕에 시료를 농도 0.2, 0.6, 1.0 ㎎/㎖가 되도록 20 ㎕씩 첨가하였다. 효소의 활성을 위해 12.
- 각 건조과정을 거친 강황 잎의 조직 관찰을 위하여 저진공 주사현미경 (Low Vacuum-Scanning Electron × 400)으로 관찰하였다. Scanning Electron Microscope (SEM)은 금, 백금 등을 이용하여 입자를 3~4 ㎜ 정도 얇게 증착하는 전처리 과정을 거친 후, 강황 잎의 조직형태를 관찰하였다.
- Tyrosinase 억제활성 실험은 기초 향장 활성 실험 중 하나로 피부내의 미백 효과를 측정하는 실험으로서 실험은 dopachrome방법 (Pomerantz, 1963)을 이용하여 측정하였다. mushroom tyrosinase (150 unit) 150 ㎕, 2.5 mM 농도의 L-tyrosine 225 ㎕, 0.4 M hepes buffer (6.8) 225 ㎕, 그리고 300 ㎕의 ethanol 용액 혹은 시료 (1 ㎎/㎖)용액을 섞은 후 배양 전과 15분간 배양을 한 후 475 ㎚에서 흡광도를 각각 측정하였다.
- 각 건조과정을 거친 강황 잎의 조직 관찰을 위하여 저진공 주사현미경 (Low Vacuum-Scanning Electron × 400)으로 관찰하였다.
- 건조방법 및 추출 용매 별 강황 잎 추출물이 Clone M-3 세포주로부터 melanin 생성량에 미치는 영향을 알아보기 위해서 추출물들의 농도를 각각 0.2, 0.6, 1.0 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 멜라닌 생성 저해율을 측정하였다.
- 열풍건조 강황 잎의 경우 열풍건조기 (CF-21WF, JEIOTECH, Daejeon, Korea)로 5 m/h의 유속으로 공기순환하여, 70 ~ 80℃의 온도를 유지시키며 8시간동안 건조시켰으며, 동결건조 강황 잎의 경우 동결건조기 (PVTFD 100R, ILSHINLAB, Yangju, Korea)를 이용하여 진공도 10 ㎜ Torr, −70℃ 조건에서 72시간 동안 동결건조하였고, 감압건조 강황 잎의 경우 감압건조기 (VS-1202V5, Vision Scientific, Bucheon, Korea)로 800 hPa로 60℃에서 감압 건조하여 사용하였다. 건조수율은 건조 전 시료에 대한 건조 후 무게백분율로 계산하였다.
- Clone M-3 세포를 96 well plate에 접종을 한 후 3일동안 시료를 처리하고 배지를 제거한다. 그 후 각 well을 PBS로 세척하고, 1 N NaOH 1 ㎖을 첨가한 뒤 교반하여 Clone M-3 세포의 세포막을 융해함으로써 melanin을 용출되게 하여, 400 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다.
- 4 M potassium tetraborate 100 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하여 끓는 수조에서 3분간 배양시킨 후 냉각시켰다. 반응물에 dimethyl aminobenzaldehyde 용액 (p-dimethyl amino-benzaldehyde 4 g, 100% acetic acid 350 ㎖, 및 10 HCl 50 ㎖ 혼합액) 3.28 ㎖를 반응 혼합물에 첨가하고 37℃ water-bath에서 20분간 배양한 후 585 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 저해율은 다음과 같이 계산하였다.
- Ethyl alcohol과 물을 추출 용매로 사용하였으며, ethyl alcohol의 경우 70℃, 물에 경우 100℃에서 24시간 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들을 감압농축장치 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축을 하였고, 동결건조를 한 후 분말로 제조하여 실험에 사용하였다.
- 여러 건조방법에 의한 강황 잎 조직의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 저진공 주사전자현미경 (SEM, Scanning Electron Microscope)을 이용하여 강황 잎 시료의 표면을 확대하여 관찰하였다 (Fig. 4). (a)는 아무런 건조과정을 거치지 않은 강황 잎의 표면으로 손상이 없는 것을 확인할 수 있으며, 다른 건조과정을 거친 강황 잎의 조직과 비교하기 위하여 촬영하였다.
- 열풍건조 강황 잎의 경우 열풍건조기 (CF-21WF, JEIOTECH, Daejeon, Korea)로 5 m/h의 유속으로 공기순환하여, 70 ~ 80℃의 온도를 유지시키며 8시간동안 건조시켰으며, 동결건조 강황 잎의 경우 동결건조기 (PVTFD 100R, ILSHINLAB, Yangju, Korea)를 이용하여 진공도 10 ㎜ Torr, −70℃ 조건에서 72시간 동안 동결건조하였고, 감압건조 강황 잎의 경우 감압건조기 (VS-1202V5, Vision Scientific, Bucheon, Korea)로 800 hPa로 60℃에서 감압 건조하여 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 강황 (Curcuma longa L.)은 전북지역에 자생하고 있는 것을 2011년 9월 중 잎 부분만 채취하였으며, 실험실로 옮겨 각각 열풍건조, 동결건조, 감압건조시켰다. 열풍건조 강황 잎의 경우 열풍건조기 (CF-21WF, JEIOTECH, Daejeon, Korea)로 5 m/h의 유속으로 공기순환하여, 70 ~ 80℃의 온도를 유지시키며 8시간동안 건조시켰으며, 동결건조 강황 잎의 경우 동결건조기 (PVTFD 100R, ILSHINLAB, Yangju, Korea)를 이용하여 진공도 10 ㎜ Torr, −70℃ 조건에서 72시간 동안 동결건조하였고, 감압건조 강황 잎의 경우 감압건조기 (VS-1202V5, Vision Scientific, Bucheon, Korea)로 800 hPa로 60℃에서 감압 건조하여 사용하였다.
- 본 연구의 세포배양 시 필요한 배지로 RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였고, 그 밖에 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), gentamycin sulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Trypsin-EDTA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
- Louis, MO, USA)를 사용하였다. 실험에 사용된 세포는 RPMI 1640배지 90%에 FBS를 10%로 적용시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
- 실험에 이용된 세포주로 Clone M-3 (Cloudman S91 melanoma, mouse, KCLB 10053.1, Seoul, Korea)를 사용하였으며, 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 (Gibco,Carlsbad, CA, USA)을 사용하였고 그 밖의 세포 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), gentamycin sulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 실험에 사용된 세포는 RPMI 1640배지 90%에 FBS를 10%로 적용시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
데이터처리
- 데이터의 통계처리는 각 시료를 3회 반복으로 행해졌으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하여 two-way ANOVA방법으로 처리하였으며, 실험값은 평균 ± 표준오차 (Mean ± Standard Error)로 표시한 뒤, 처리구간의 최소 유의 수준의 차 (p < 0.05)로 통계처리 하였다.
이론/모형
- 3-(4,5-dimethythiazo-2-yl)-2,5-dipheny-tetrazoliumbromide(MTT)를 이용한 Mosmann방법 (Mosmann, 1983)을 달리하여 세포의 독성을 측정하였다. 먼저 CCD-986sk 세포를 96 well plate에 각 well당 1.
- Tyrosinase 억제활성 실험은 기초 향장 활성 실험 중 하나로 피부내의 미백 효과를 측정하는 실험으로서 실험은 dopachrome방법 (Pomerantz, 1963)을 이용하여 측정하였다. mushroom tyrosinase (150 unit) 150 ㎕, 2.
- 건조과정에 있어서 가장 기본적으로 열풍건조가 대표적이나, 오랜 건조시간과 일정 이상의 높은 온도를 필요로 하므로 강황 내에 존재하는 많은 활성성분의 손실과 품질저하를 가져올 수 있다. 이에 본 연구에서는 탄소배출량을 감소시키면서 활성성분의 손실을 줄이기 위하여 감압건조나 동결건조의 방법을 사용하였다.
성능/효과
- Fig. 3에서 볼 수 있듯이 강황 잎 추출물은 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 모든 실험군이 가장 높은 멜라닌 생성 저해율을 보였으며, 건조방법과는 상관없이 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 활성을 보였다. 증숙 및 초고압 증숙 공정을 통한 더덕의 향장활성 증진에 관한 논문에서 살펴보면 (Kim et al.
- 각 건조방법을 거친 강황 잎 추출물 모두 일반 강황 생잎 추출물의 세포독성보다 낮은 세포독성을 나타내었으며, 그 중 감압 건조를 거친 강황 잎 추출물이 가장 낮은 세포독성을 가지는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과로, 강황 잎은 건조과정을 거치게 되어도 독성물질이 생성되지 않는 것으로 확인되었고, 이것으로 건조된 강황 잎의 향장소재로서의 사용이 가능할 것으로 사료된다.
- 1). 각각의 시료 세포독성을 살펴보면 생잎의 경우 모든 농도에서 세포독성이 가장 높게 나타내었으며, 그 중 감압 건조과정을 거친 강황 잎 추출물에 대한 세포독성이 모든 농도에서 20%를 넘지 않았다.
- )의 건조 및 추출 수율은 Table 1에 나타내었다. 강황 생잎에 대한 각 건조방법 별 건조수율을 측정한 결과 감압 건조시킨 강황 잎의 건조수율이 약 19.4%로 가장 높았으며, 동결 건조시킨 강황 잎의 건조수율이 18.8%, 열풍건조 된 강황 잎의 수율이 17.8%로서 가장 낮은 것으로 관찰되었으나 건조방법 간에 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그러나 건조 후 추출과정을 거쳐 얻은 강황 잎 추출물의 추출 수율에 대하여 비교한 결과, 건조 방법 중 감압 건조시킨 강황 잎의 추출 수율이 열수 추출의 경우 26.
- 결과를 통해 모든 시료 조건에서 hyaluronidase 억제활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 최소 18%에서 최대 43%까지 저해 효과는 나타내는 것을 알 수 있었다. 건조 방법 별로는 열풍 건조 강황 잎 추출물이 동결건조 추출물과 감압 건조 추출물에 비하여 비교적 낮은 활성을 나타내었으며, 감압 건조 추출물에 경우 동결 건조 추출물에 비해 미미하게나마 높은 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 보아 가공 공정 시 강황 잎에 함유되어 있는 항염증 및 항균작용이 뛰어난 curcumin 성분 (Jayaprakasha et al.
- 추출 용매를 기준으로 비교했을 때에는 물을 용매로 하여 추출한 추출물보다 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물의 수율이 높은 것으로 측정되었다. 건조방법과 추출용매를 종합적으로 비교 관찰하였을 때 감압 건조하여 에탄올 추출과정을 거친 강황 추출물의 수율이 가장 높았다. 이 결과로 보아, 건조수율의 경우에는 수분함량의 차이 의하여 측정된 수율이기 때문에 추출수율에 비하여 눈에 띄는 차이를 보이지 않는 것이라 사료되며, 건조된 강황 잎을 추출했을 때 건조 방법별로 큰 차이를 보이는 것은 건조과정 중 온도에 따른 유효물질의 손실에 의한 것으로 보여진다(Nam, 2005).
- 따라서 hyaluronidase 억제 활성을 측정하여 Table 2에 나타내었다. 결과를 통해 모든 시료 조건에서 hyaluronidase 억제활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 최소 18%에서 최대 43%까지 저해 효과는 나타내는 것을 알 수 있었다. 건조 방법 별로는 열풍 건조 강황 잎 추출물이 동결건조 추출물과 감압 건조 추출물에 비하여 비교적 낮은 활성을 나타내었으며, 감압 건조 추출물에 경우 동결 건조 추출물에 비해 미미하게나마 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 8%로서 가장 낮은 것으로 관찰되었으나 건조방법 간에 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그러나 건조 후 추출과정을 거쳐 얻은 강황 잎 추출물의 추출 수율에 대하여 비교한 결과, 건조 방법 중 감압 건조시킨 강황 잎의 추출 수율이 열수 추출의 경우 26.5%, 에탄올 추출의 경우 29.4%로 가장 높았으며, 동결 건조시킨 강황 잎의 경우 열수 추출의 수율이 25%, 에탄올 추출의 수율이 29.2%로 감압건조 강황 잎 보다 근소하게 수율이 낮았고, 열풍 건조시킨 강황 잎의 경우 열수 추출이 22%, 에탄올 추출이 25.3%로 가장 낮았다. 추출 용매를 기준으로 비교했을 때에는 물을 용매로 하여 추출한 추출물보다 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물의 수율이 높은 것으로 측정되었다.
- 2에 나타내었다. 실험 결과를 보면 모든 추출물에서 추출물의 농도가 증가함에 따라 tyrosinase의 저해 활성도 증가하는 경향을 보였으며, 그 중 동결 건조 및 감압 건조과정을 거친 에탄올 추출물이 모든 조건의 농도에서 가장 높은 저해 활성을 나타냈다.
- 건조과정을 거친 강황 잎 추출물을 human fibroblast CCD986sk에 투여해, 세포생존율을 측정하여 향장 및 기능성 소재로서의 사용이 적합한지에 대해 검토하였다. 실험결과, 각 시료의 농도별 세포 독성은 농도 의존적으로 증가하였으며, 최대 25%를 넘지 않았다 (Fig. 1). 각각의 시료 세포독성을 살펴보면 생잎의 경우 모든 농도에서 세포독성이 가장 높게 나타내었으며, 그 중 감압 건조과정을 거친 강황 잎 추출물에 대한 세포독성이 모든 농도에서 20%를 넘지 않았다.
- 감압건조의 경우, 동결건조와 매우 흡사한 이점을 가지고 있는 동시에 동결건조와 달리 낮은 압력에서 건조시키므로 원료의 변형이 최소화되는 이점을 가지고 있는 동시에 동결건조와 달리 낮은 압력에서 건조시키므로 원료의 변형이 최소화되는 이점을 가지고 있으며 대기압보다 낮은 기압으로 감압시켜 건조함으로써 건조시간을 단축시키는 기술로 열풍 건조의 문제점인 높은 온도에 의한 유효성분의 변성을 막고 동결건조의 문제점인 건조시간과 비용의 소비를 절약할 수 있는 건조 기술이다. 열풍건조에 비하여 낮은 온도에서 건조할 수 있는 이점을 가진 감압 건조방법을 이용하여 강황 잎을 건조 시, 활성성분들이 높은 온도에 의하여 불활성화 되는 것을 최소화 시킬 수 있으며, 건조시간을 단축시켜 경제적으로도 효율성을 가진다.
- 건조 방법 별로는 열풍 건조 강황 잎 추출물이 동결건조 추출물과 감압 건조 추출물에 비하여 비교적 낮은 활성을 나타내었으며, 감압 건조 추출물에 경우 동결 건조 추출물에 비해 미미하게나마 높은 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 보아 가공 공정 시 강황 잎에 함유되어 있는 항염증 및 항균작용이 뛰어난 curcumin 성분 (Jayaprakasha et al., 2005) 및 항산화물질 (Ahn et al., 2012)에 대한 강황 잎의 피부면역 활성이 있는 것으로 보이며, 이는 향장소재로서 적합함으로 사료된다.
- 3%로 가장 낮았다. 추출 용매를 기준으로 비교했을 때에는 물을 용매로 하여 추출한 추출물보다 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물의 수율이 높은 것으로 측정되었다. 건조방법과 추출용매를 종합적으로 비교 관찰하였을 때 감압 건조하여 에탄올 추출과정을 거친 강황 추출물의 수율이 가장 높았다.
후속연구
- 각 건조방법을 거친 강황 잎 추출물 모두 일반 강황 생잎 추출물의 세포독성보다 낮은 세포독성을 나타내었으며, 그 중 감압 건조를 거친 강황 잎 추출물이 가장 낮은 세포독성을 가지는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과로, 강황 잎은 건조과정을 거치게 되어도 독성물질이 생성되지 않는 것으로 확인되었고, 이것으로 건조된 강황 잎의 향장소재로서의 사용이 가능할 것으로 사료된다.
- 이것으로 보아 추출 공정 시 강황 잎에 함유되어 있는 항산화 및 미백효과에 우수한 curcumin (Jayaprakasha et al., 2005)이 멜라닌 생성 억제 물질로 사료되는 바이며, 또한 강황 지상부의 항산화 성분 (Ahn et al., 2012)에 대한 연구에서 살펴보면 기타 항산화 물질들에 의해 멜라닌 생성 억제에 도움될 것을 보이며, 이들의 손상을 줄일 수 있는 구체적인 감압건조 조건이 확립된다면 멜라닌 생합성 억제제로서 기능성 화장품의 미백제로도 쓰일 수 있는 가능성을 가질 수 있다고 사료된다.
- 이러한 이유로 최근 강황 잎에 대한 연구가 활발하게 진행중이며, 현재 밝혀진 연구결과로 강황의 뿌리뿐만 아니라 강황 잎에도 항산화 및 미백 효과가 뛰어나다고 알려진 curcumin 성분이 존재하며, 기타 항산화에 효능이 있는 성분들이 함유되어 있어 향장활성의 소재로 매우 가치가 있을 것으로 기대된다 (Ahn et al., 2012).
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