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문제 정의
- 본 연구는 이전에 거의 사용되지 않았던 강황 잎을 초고압 공정 및 저온을 이용하여 유용활성물질의 손실을 최소화하며 단 시간에 추출이 가능하도록 하였으며 강황 잎 추출물을 통하여 피부 면역에 대한 활성을 수행함으로서, 강황 잎의 화장품 원료로의 이용가치를 높이고자 연구를 수행하였다.
- , 2000)등 각 종 인체의 생리 활성 분야에서 다양한 연구가 보고되었으며, 진행 중이다. 본 연구는 현대사회에서 각 종 환경오염으로 인한 아토피 피부염, 건선 등 염증성 피부질환이 문제시 되고 있는 것에 착안하여 상기와 같은 강황의 효능 중 강황의 항염증 효능에 중점을 두어 이를 바탕으로한 피부면역 향장소재로서의 가능성을 확인하기 위해 피부면역에 관한 연구를 진행하였다.
- Hyaluronidase는 피부의 탄력 및 보습에 있어 영향을 끼치는 hyaluronic acid을 분해하는 효소이며, 피부면역을 저해하는 요소가 될 수 있다. 이 실험에서는 이러한 hyaluronidase의 억제 효과를 확인함으로써 강황 잎 추출물의 피부면역에 대한 효능을 알아보고자 하였다. 강황 잎 추출물의 hyaluronidase 억제 효과를 측정하여 Fig.
- , 2004). 이러한 추출방법의 단점을 극복하기위하여 본 연구에서는 보다 저온에서 추출하면서, 효율을 높이기 위하여 추출 전 전처리로 초고압 공정을 통해 피부면역에 대한 효능을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Hyaluronidase 억제효과는 N-acetylglucosamine의 양을 분광광도계로 측정하여 활성을 판단하였다. 0.1 M acetate buffer (pH 3.5)에 녹인 hyaluronidase (7900 unit/㎖) 50 ㎕에 시료를 최종 농도 0.2, 0.6, 1.0 ㎎/㎖가 되도록 하여 20 ㎕씩 가하고, 효소의 활성화를 위해 12.5 mM의 CaCl₂ 200 ㎕를 혼합한 후 37℃ 수욕상에서 20분간 배양시켰다. 대조군은 DMSO 용액을 넣고 수욕상에서 20분간 배양하였다.
- 3-(4,5-dimethythiazo-2-yl)-2,5-dipheny-tetrazoliumbromide (MTT)를 사용하여 Mosmann방법을 변형시켜 세포 독성을 측정하였다 (Mosmann, 1983). CCD-986sk 세포를 96 well plate에 1.
- 5 × 104 cells/well 농도로 접종한 후, 80% 정도의 배양시점에서 각 well에 시료를 투여하고 CO₂incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 5㎍/㎖ 농도의 MTT 용액을 각 well 에 첨가하고 4시간 후 상층액을 제거하고, 10㎕ 의 acidisopropanol (0.04N HCl in isopropanol)을 첨가한 다음 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)로 565 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- HDF (Human Dermal Fibroblast)인 CCD986sk를 10% FBS와 DMEM 배지에 2 × 105 cells/㎖만큼 주입하였다.
- Hyaluronidase 억제효과는 N-acetylglucosamine의 양을 분광광도계로 측정하여 활성을 판단하였다. 0.
- NO 생성량 측정을 위해 사용된 세포주는 마우스 유래 J774.1 대식세포를 사용하였으며, 세포를 10% FBS와 DMEM 배지에 배양하여 24 well plate에 4.5 × 104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가한 것과 첨가하지 않은 두 가지 군을 나누어 모두 37℃, 5% CO2 배양기에 48시간 동안 배양한 후 LPS (lipopolysaccharide)를 200 ng/well의 농도로 처리하여 48시간 동안 세포를 배양하였다.
- Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였으며, 농도는 32 µM에서부터 0.25 µM까지 RPMI 1640 배지로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다 (Choi et al., 2006).
- 강황 잎 추출물의 피부면역에 대한 효과를 측정하기 위하여 UV를 이용한 PGE₂ 생성량을 확인하였다. PGE₂ 생성량 측정에는 섬유아세포인 CCD-986sk를 사용하였으며, UV조사를 통하여 섬유아세포에 영향을 주었다. UV를 통한 섬유아세포에 강황 잎 추출물을 처리하여 PGE₂ 생성량을 측정한 결과를 Fig.
- PGE₂ 생성량은 Prostaglandin E₂ Express EIA Short kit (ACETM, 155019)를 이용하여 측정하였다 (Cui et al., 2005). 항 PGE₂ 항체가 부착되어있는 plate의 각 well에 회수한 상층액과 함께 PGE₂-acetylcholinesterase tracer를 넣어 상온에서 18시간 배양한 후, 각 well에 남아있는 용액을 말끔히 털어낸 후, 0.
- 05% tween 20-phosphate buffer solution으로각 well을 5회 세척하고 Ellman 시약 200 ㎕를 각 well에 넣은 후 7시간 배양하여 405 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. PGE₂를 표준품으로 검량선을 작성하여 각 시료를 처리한 배양액 중의 PGE₂ 생성량을 구하였다.
- 강황 잎 추출물의 초고압 공정을 통한 피부 면역 활성 증진 효과를 확인하기 위해 hyaluronidase 억제 활성을 확인하였다. Hyaluronidase는 피부의 탄력 및 보습에 있어 영향을 끼치는 hyaluronic acid을 분해하는 효소이며, 피부면역을 저해하는 요소가 될 수 있다.
- 강황 잎 추출물의 피부면역에 대한 효과를 측정하기 위하여 UV를 이용한 PGE₂ 생성량을 확인하였다. PGE₂ 생성량 측정에는 섬유아세포인 CCD-986sk를 사용하였으며, UV조사를 통하여 섬유아세포에 영향을 주었다.
- )은 전북지역에서 2011년 3월부터 재배한 것을 수확 직전 2011년 9월 강황잎 부분만 채취하였으며, 실험실로 동결건조기 (PVTFD 100R, ILSHINLAB, Yangju, Korea)를 이용하여 진공도 10 ㎜ Torr, −50℃ 조건에서 동결건조하였다. 건조수율은 건조 전 시료에 대하여 건조 후 시료의 무게백분율로 계산하였다.
- HDF (Human Dermal Fibroblast)인 CCD986sk를 10% FBS와 DMEM 배지에 2 × 105 cells/㎖만큼 주입하였다. 그 뒤 50 M의 aspirin을 넣고 HDF에 존재하는 COX 효소의 활성을 억제시켜 동일한 PGE₂의 양이 되도록 하였다. 그 뒤 세포배양액과 시료를 96-wel-plate에 20 ㎕씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 incubator 에서 2시간 동안 UV 등 필터를 통하여 UVA (6.
- 그 뒤 50 M의 aspirin을 넣고 HDF에 존재하는 COX 효소의 활성을 억제시켜 동일한 PGE₂의 양이 되도록 하였다. 그 뒤 세포배양액과 시료를 96-wel-plate에 20 ㎕씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 incubator 에서 2시간 동안 UV 등 필터를 통하여 UVA (6.3J/㎠)를 조사하였다. 배양한 뒤 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하고, 남은 세포를 통하여 실험을 진행하였다 (Han et al.
- 실험에 사용된 sample의 농도는 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖로 조절하여 인간섬유아세포인 CCD-986sk에 대한 세포독성을 측정하였다. 실험 결과 대부분의 추출조건에서 농도 의존적으로 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, HPE15가 거의 모든 농도에서 매우 낮은 세포독성을 나타내었다 (Fig.
- 초고압 추출이 끝난 강황 잎을 수직 환류냉각기가 부착된 flask에 10배의 증류수를 이용하여 60℃에서 12시간동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 추출물을 감압여과장치로 여과하여 농축한 후 72시간 동안 동결건조 하여 실험에 사용하였다.
- , 1990). 이를 통해 본 연구에서는 NO, PGE₂ 생성량 확인등 염증인자 저해평가를 통해 강황 잎의 피부 면역 효능 평가를 실시하였다.
- 초고압 추출은 동결건조하여 분쇄 된 강황 잎 시료 10 g을 비닐 팩에 물과 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압 추출장치 (ILSHIN autoclave, Daejeon, Korea)를 이용하여 5000 bar의 압력으로 각각 5분, 15분간 초고압 전처리 추출공정을 시행하였다. 초고압 추출이 끝난 강황 잎을 수직 환류냉각기가 부착된 flask에 10배의 증류수를 이용하여 60℃에서 12시간동안 2회 반복 추출하였다.
- 초고압 추출은 동결건조하여 분쇄 된 강황 잎 시료 10 g을 비닐 팩에 물과 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압 추출장치 (ILSHIN autoclave, Daejeon, Korea)를 이용하여 5000 bar의 압력으로 각각 5분, 15분간 초고압 전처리 추출공정을 시행하였다. 초고압 추출이 끝난 강황 잎을 수직 환류냉각기가 부착된 flask에 10배의 증류수를 이용하여 60℃에서 12시간동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 추출물을 감압여과장치로 여과하여 농축한 후 72시간 동안 동결건조 하여 실험에 사용하였다.
- , 2005). 항 PGE₂ 항체가 부착되어있는 plate의 각 well에 회수한 상층액과 함께 PGE₂-acetylcholinesterase tracer를 넣어 상온에서 18시간 배양한 후, 각 well에 남아있는 용액을 말끔히 털어낸 후, 0.05% tween 20-phosphate buffer solution으로각 well을 5회 세척하고 Ellman 시약 200 ㎕를 각 well에 넣은 후 7시간 배양하여 405 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. PGE₂를 표준품으로 검량선을 작성하여 각 시료를 처리한 배양액 중의 PGE₂ 생성량을 구하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 강황 (Curcuma longa L.)은 전북지역에서 2011년 3월부터 재배한 것을 수확 직전 2011년 9월 강황잎 부분만 채취하였으며, 실험실로 동결건조기 (PVTFD 100R, ILSHINLAB, Yangju, Korea)를 이용하여 진공도 10 ㎜ Torr, −50℃ 조건에서 동결건조하였다.
- 실험에 사용된 세포는 Dulbeco’s Modified Eagle's Medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지 90%에 FBS를 10%로 적용시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
- 실험에 이용된 세포주로 Human fibroblast CCD-986sk (KCLB 21947, Seoul, Korea)를 사용하였으며, 세포배양에 필요한 배지로 Dulbeco's Modified Eagle’s Medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였고 그 밖의 세포 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), gentamycin sulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), trysin-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
데이터처리
- 데이터 통계처리는 3회 반복으로 시행하였으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램을 통하여 two-way ANOVA 방법 에 의하여 처리하였다. 처리구간의 최소 유의 수준의 차 (p < 0.
- 처리구간의 최소 유의 수준의 차 (p < 0.05)로 통계처리 하였다.
성능/효과
- 98 pg/㎖ 생성량을 확인하였다. HPE15에서 다른 추출물과 비교하여 유의적인 차이를 보였지만 열수추출물, 에탄올 추출물 그리고 초고압 공정을 5분만 실시하였을 때는 각각 생성량의 유의적인 차이가 확인 되지 않았다. UV 조사 시 PGE₂ 생성량은 UV조사 전과 유사한 양상을 보였으며, 마찬가지로 HPE15이 최대 농도 1.
- HPE15에서 다른 추출물과 비교하여 유의적인 차이를 보였지만 열수추출물, 에탄올 추출물 그리고 초고압 공정을 5분만 실시하였을 때는 각각 생성량의 유의적인 차이가 확인 되지 않았다. UV 조사 시 PGE₂ 생성량은 UV조사 전과 유사한 양상을 보였으며, 마찬가지로 HPE15이 최대 농도 1.0 ㎎/㎖에서 649.44 pg/㎖으로 전체 강황 잎의 추출물 중 낮은 PGE₂ 값을 나타내었다. 전체 샘플이 UV조사 시에 농도 별로 확연한 차이를 보였으나, 동일 농도에서 추출물별로 비교하였을 때, UV 조사 전과 마찬가지로 HPE 15를 제외하고 샘플간의 차이는 매우 미미 하였다.
- 2에 나타내었다. 결과를 통해 모든 샘플에서 hyaluronidase가 억제되는 것을 확인하였다. 저해 수준은 농도에 비례하여 증가하는 경향을 나타내었으며, 실험을 통해 시료에 따라 약 20 ~ 45%의 저해 활성을 나타내었다.
- 상기의 결과를 살펴보면 UV로 인하여 자극을 받은 세포가 염증을 유발 시에 IL-1이나 종양괴사인자 (TNF)등 Cytokine의 생성에 대하여 강황 잎 추출물이 이들을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다. 또한, 강황 잎 추출물이 초고압 공정을 거침으로써 기존의 추출방법보다 PGE₂ 생성량이 감소되어 피부면역에 대한 효능이 증진됨을 확인하였다.
- 그러므로 저온고압 추출을 통해 이러한 결합들이 분리되어 새로운 물질의 용출이 가능한 것으로 보인다. 본 연구의 추출물중 HPE15인 초고압을 15분 동안 가하여 추출한 강황 잎 추출물이 25.53%로 두 번째인 HPE5 추출물보다 높은 수율을, 그 뒤로 HPE5 추출물이 23.20%, 70% 에탄올 추출물은 20.03%의 수율을 보였으며, 열수추출물이 18.35%의 낮은 수율을 보였다. 이를 통하여 초고압 추출공정이 강황 잎 추출 수율 증가에 효과적인 것을 확인하였다.
- , 2011), 마찬가지로 초고압 공정을 실시하였을 때 세포독성이 감소한 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 결과를 토대로 초고압 공정을 처리함으로서 세포 독성이 감소하는 것을 확인 하였다.
- , 2010), 같은 농도에서 스피룰리나의 경우는 UV 조사시에 1,010 pg/㎖의 PGE₂ 생성량이 확인 되어 강황 잎 추출물의 PGE₂ 생성량이 300 pg/㎖이상 더 낮게 발현되었다. 상기의 결과를 살펴보면 UV로 인하여 자극을 받은 세포가 염증을 유발 시에 IL-1이나 종양괴사인자 (TNF)등 Cytokine의 생성에 대하여 강황 잎 추출물이 이들을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다. 또한, 강황 잎 추출물이 초고압 공정을 거침으로써 기존의 추출방법보다 PGE₂ 생성량이 감소되어 피부면역에 대한 효능이 증진됨을 확인하였다.
- 0 ㎎/㎖로 조절하여 인간섬유아세포인 CCD-986sk에 대한 세포독성을 측정하였다. 실험 결과 대부분의 추출조건에서 농도 의존적으로 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, HPE15가 거의 모든 농도에서 매우 낮은 세포독성을 나타내었다 (Fig. 1). 열수 추출물이 1.
- 1). 열수 추출물이 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 15.24%의 세포독성을 보였으며, 에탄올 추출물, 초고압 5분 추출물및 초고압 15분 추출물은 같은 농도에서 각각 16.83%, 12.46%, 11.97%의 세포독성을 보였다. 이는 피부면역 활성 실험을 진행 한 불가사리 유래 콜라겐 펩타이드의 피부 면역 증진 연구에서 같은 1 ㎎/㎖ 농도의 불가사리 유래 펩타이드 콜라겐이 18.
- 35%의 낮은 수율을 보였다. 이를 통하여 초고압 추출공정이 강황 잎 추출 수율 증가에 효과적인 것을 확인하였다.
- 지치의 NO 생성량과 비교하였을 때, 강황 잎은 훨씬 낮은 NO 생성량을 보였으며, 강황 잎 추출물의 낮은 NO 생성량에 따라 항염증 효능이 높은 것으로 사료되며 특히 낮은 NO 생성량이 확인 된 15분 동안 초고압공정을 거친 강황 잎 추출물이 항염증 효과가 높은 것은 초고압공정을 함으로써 항염증 효능이 증대 된 것으로 판단할 수 있다. 이에 더해 초고압 공정을 거친 시간이 길수록 항염증 효과가 우수하여 피부면역에 대한 효능이 뛰어남을 확인 할 수 있었다.
- 결과를 통해 모든 샘플에서 hyaluronidase가 억제되는 것을 확인하였다. 저해 수준은 농도에 비례하여 증가하는 경향을 나타내었으며, 실험을 통해 시료에 따라 약 20 ~ 45%의 저해 활성을 나타내었다. HPE15는 최대 시료 투여농도인 1.
- 44 pg/㎖으로 전체 강황 잎의 추출물 중 낮은 PGE₂ 값을 나타내었다. 전체 샘플이 UV조사 시에 농도 별로 확연한 차이를 보였으나, 동일 농도에서 추출물별로 비교하였을 때, UV 조사 전과 마찬가지로 HPE 15를 제외하고 샘플간의 차이는 매우 미미 하였다. 이를 통해 초고압 공정이 면역활성 증진에 도움이 될 수 있지만, 초고압 공정 처리 시간이 매우 중요 한 것을 알 수 있다.
- , 2013). 지치의 NO 생성량과 비교하였을 때, 강황 잎은 훨씬 낮은 NO 생성량을 보였으며, 강황 잎 추출물의 낮은 NO 생성량에 따라 항염증 효능이 높은 것으로 사료되며 특히 낮은 NO 생성량이 확인 된 15분 동안 초고압공정을 거친 강황 잎 추출물이 항염증 효과가 높은 것은 초고압공정을 함으로써 항염증 효능이 증대 된 것으로 판단할 수 있다. 이에 더해 초고압 공정을 거친 시간이 길수록 항염증 효과가 우수하여 피부면역에 대한 효능이 뛰어남을 확인 할 수 있었다.
- Table 1에 강황 잎 추출물의 추출 방법별 수율을 나타내었다. 추출 수율 측정을 통해 저온 고압 공정을 이용한 강황잎 추출물이 일반 추출 공정을 이용한 추출물에 비해 약 1.5배 수율이 향상된 것을 확인하였다. 이와 같은 초고압 공정을 이용한 복분자의 면역 활성에 관한 연구에서 초고압 추출물의 수율이 일반 열수 추출물에 비해 1.
후속연구
- 기존에 항염 효능에 대해 알려진 강황을 초고압 공정을 처리함으로서 독성 및 Hyaluronidase 저해 평가, NO 생성량 확인 및 PGE₂ 생성량을 측정하여 초고압 처리 추출물이 종래 공정법보다 염증 유발 인자들을 저감시켜 피부 면역에 대한 효능이 증진 됨을 확인하였으나, 염증 유발을 담당하는 중요한 인자인 cytokine의 생성량을 측정하여 초고압 추출물이 cytokine 생성량 또한 저감시킬 수 있는지에 대한 추가 연구가 필요하다.
- , 2008). 상기 결과를 통하여, 초고압 공정으로 인해 강황 잎에 함유되어 있던 세포독성에 영향을 주는 물질이 저감 된 것과 동시에 독성에 저항할 수 있는 면역 관련 물질이 용출 된 것으로 보이며, 어떠한 물질인지는 추가 연구가 필요 하지만 앞서 초고압 공정에 관련된 연구들을 살펴보면 (Kim et al., 2007; Seo et al., 2011), 마찬가지로 초고압 공정을 실시하였을 때 세포독성이 감소한 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 결과를 토대로 초고압 공정을 처리함으로서 세포 독성이 감소하는 것을 확인 하였다.
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