황기 지상부로부터 장관면역 활성 다당체의 분리 및 단회 경구 투여 독성시험 Isolation of Polysaccharides Modulating Intestinal Immune System and Single Oral Dose Toxicity Test in Astragalus membranaceus Abovegroud Parts원문보기
The six polysaccharide fractions were prepared by chromatographic procedure from the hot water extracts of the aboveground parts of Astragalus membranaceus. These six polysaccharides from aboveground parts of Astragalus membranaceus Bunge were tested for gut-mucosal immune activity and acute toxicit...
The six polysaccharide fractions were prepared by chromatographic procedure from the hot water extracts of the aboveground parts of Astragalus membranaceus. These six polysaccharides from aboveground parts of Astragalus membranaceus Bunge were tested for gut-mucosal immune activity and acute toxicity. In a view of molecular weight, the six fractions were estimated to be 75000, 88000, 129000 and 345000 Da, respectively. Component sugar analysis indicated that these fractions were mainly consisted of galactose (46.3 ~ 11.8%) and arabinose (35.4 ~ 9.9%) in addition to glucose, rhamnose, fucose, arabinose, xylose, mannose, glucuronic acid and galacturonic acid. Among the six major purified polysaccharides, AMA-1-b-PS2 showed highest bone merrow cell proliferation and lymphocyte of Peyer's patch stimulating activity. It may be concluded that intestinal immune system modulating activity of aboveground parts from Astragalus membranaceus Bunge is caused by polysaccharides having a polygalacturonan moiety with neutral sugars such as arabinose and galactose. In single oral dose toxicity study, no differences were observed between control and treated groups in clinical signs. The results indicated that lethal dose 50 ($LD_{50}$) of water extracts from Astragalus membranaceus-aboveground parts was found to be higher than 5000 mg/kg/day in this experiment. From the above results, we may suggest that Astragalus membranaceus-aboveground parts might have useful as a safe material for functional food and pharmaceutics.
The six polysaccharide fractions were prepared by chromatographic procedure from the hot water extracts of the aboveground parts of Astragalus membranaceus. These six polysaccharides from aboveground parts of Astragalus membranaceus Bunge were tested for gut-mucosal immune activity and acute toxicity. In a view of molecular weight, the six fractions were estimated to be 75000, 88000, 129000 and 345000 Da, respectively. Component sugar analysis indicated that these fractions were mainly consisted of galactose (46.3 ~ 11.8%) and arabinose (35.4 ~ 9.9%) in addition to glucose, rhamnose, fucose, arabinose, xylose, mannose, glucuronic acid and galacturonic acid. Among the six major purified polysaccharides, AMA-1-b-PS2 showed highest bone merrow cell proliferation and lymphocyte of Peyer's patch stimulating activity. It may be concluded that intestinal immune system modulating activity of aboveground parts from Astragalus membranaceus Bunge is caused by polysaccharides having a polygalacturonan moiety with neutral sugars such as arabinose and galactose. In single oral dose toxicity study, no differences were observed between control and treated groups in clinical signs. The results indicated that lethal dose 50 ($LD_{50}$) of water extracts from Astragalus membranaceus-aboveground parts was found to be higher than 5000 mg/kg/day in this experiment. From the above results, we may suggest that Astragalus membranaceus-aboveground parts might have useful as a safe material for functional food and pharmaceutics.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 황기의 지상부의 열수 추출물로부터 장관 peyer’s patch 속의 면역담당세포의 기능을 부활시키고, 면역능 증강 작용을 가진 고분자 다당 성분을 탐색하여, 강력한 장관면역개선 효과를 보이는 다당체를 분리하고 그 활성을 평가하였다.
제안 방법
골수세포는 동일종 마우스의 대퇴부 뼈에서 회수하였는데, 즉 주사기를 이용하여 뼈 속으로 HBSS를 주입하여 시험관에 받은 후 상기와 같이 여과, 세척하여 2.5 × 105 cell/㎖ RPMI 1640-FBS로 세포농도를 조정하고 96-well plate에 100 ㎕ 씩 분주하였다.
1M TFA로 100℃에서 1시간 동안 가수분해 시킨 후 NaBD4를 이용하여 중성당의 경우와 유사한 조건으로 alditol acetate 유도체로 전환시켜 GLC를 실시하였다. 구성당의 분석을 위한 GLC의 온도조건은 injector 250℃, detector 250℃이었고 column은 60℃에서 1분이 경과하면 30℃/분의 속도로 220℃까지 상승시킨 후 12분간 유지하고 다시 8℃/분의 속도로 250℃까지 상승시켜 15분을 유지하는 조건이었으며, 표준 당류의 retention time과 비교하여 시료 중의 구성당을 분석하였고 구성당의 mol%는 각 peak들의 면적비와 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산한 후 molar ratio로 표기하였다.
5 × 105 cell/㎖ RPMI 1640-FBS로 세포농도를 조정하고 96-well plate에 100 ㎕ 씩 분주하였다. 다음으로 위에서 얻은 골수세포 증식활성 측정용 상등액과 RPMI 1640- FBS를 각각 50 ㎕씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일간 배양하였다. 직접적인 장관면역 활성도는 시료와 peyer’s patch 세포와의 반응 후 회수한 상등액을 골수세포와 반응시켜 골수세포가 증식되는 정도로서 나타내는데, 증식도 측정은 Alamar BlueTM의 형광시약이 살아 있는 골수세포의 전자전달계에서 방출되는 전자에 의해 환원되어 발색되는 측정법을 사용하였다 (Pag et al.
독성시험은 식품의약품안전처 독성시험관리기준 (Ministry of Food and Drug Safety, 2013)과 OECD 검정기준 (Organization for Eeconomic Co-operation and Development, 2001) 및 GLP센터 표준작업 순서에 따라 진행된 독성 검정에서 임상증상 관찰은 모든 실험동물에 대하여 투여 당일은 투여 후 1시간부터 6시간까지 관찰하였고, 투여 다음날부터 투여 및 관찰기간 동안 매일 2회 모든 동물에 대해 일정한 시간에 사망여부, 일반증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 개별적으로 관찰하여 기록하였다. 또한 시험에 사용된 모든 실험동물에 대하여 시험물질 투여개시 전에 체중을 측정하였고 투여 후 3일, 7일, 14일째 체중을 측정하였다.
d × 30 m, Supelco, Bellefontem PA, USA)이 장착된 gas-liquid chromatography (HP-6890 II GLC, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA) 로 구성당을 분석하였다. 또한 산성당의 경우에 있어서는 0.1M TFA로 100℃에서 1시간 동안 가수분해 시킨 후 NaBD4를 이용하여 중성당의 경우와 유사한 조건으로 alditol acetate 유도체로 전환시켜 GLC를 실시하였다. 구성당의 분석을 위한 GLC의 온도조건은 injector 250℃, detector 250℃이었고 column은 60℃에서 1분이 경과하면 30℃/분의 속도로 220℃까지 상승시킨 후 12분간 유지하고 다시 8℃/분의 속도로 250℃까지 상승시켜 15분을 유지하는 조건이었으며, 표준 당류의 retention time과 비교하여 시료 중의 구성당을 분석하였고 구성당의 mol%는 각 peak들의 면적비와 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산한 후 molar ratio로 표기하였다.
독성시험은 식품의약품안전처 독성시험관리기준 (Ministry of Food and Drug Safety, 2013)과 OECD 검정기준 (Organization for Eeconomic Co-operation and Development, 2001) 및 GLP센터 표준작업 순서에 따라 진행된 독성 검정에서 임상증상 관찰은 모든 실험동물에 대하여 투여 당일은 투여 후 1시간부터 6시간까지 관찰하였고, 투여 다음날부터 투여 및 관찰기간 동안 매일 2회 모든 동물에 대해 일정한 시간에 사망여부, 일반증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 개별적으로 관찰하여 기록하였다. 또한 시험에 사용된 모든 실험동물에 대하여 시험물질 투여개시 전에 체중을 측정하였고 투여 후 3일, 7일, 14일째 체중을 측정하였다. 부검일의 체중은 부검 전일에 하루 밤 절식시킨 후에 측정하였다.
단회 경구 투여 독성시험에 있어서 용량설정은 암수 랫드 모두 일반적인 천연소재 추출물 적용의 한계용량으로 하여 5,000 ㎎/㎏/day을 투여한 결과 사망한 시험계가 없는 것으로 확인되어 대조군 (멸균증류수) 더불어 투여군은 5,000 ㎎/㎏/ day으로 설정되었다. 랫드를 투여 전날 절식시키고 황기지상부 추출물을 투여당일에 측정한 체중을 기준으로 10 ㎖/㎏의 농도로 조제하여 1회/1일로 투여하였으며 랫드의 경배부 피부를 고정하고 금속제 경구투여용 존데를 이용하여 강제 경구투여 한 후 14일 동안 관찰하였다.
또한 시험에 사용된 모든 실험동물에 대하여 시험물질 투여개시 전에 체중을 측정하였고 투여 후 3일, 7일, 14일째 체중을 측정하였다. 부검일의 체중은 부검 전일에 하루 밤 절식시킨 후에 측정하였다. 시험 종료 후 실험동물을 부검 당일에 isofluran으로 흡입하여 마취하고 복대동물 절단방법으로 치사 시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안적으로 관찰하였다.
사료는 실험 동물용 사료를, 물은 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며 환경은 항온, 항습 조건 (온도 22 ± 0.5℃, 상대습도 55 ± 5%) 및 인공조명에서 명암교대 1일 12시간씩 (오전 9시 ~ 오후9시) 을 유지하였다.
세포현탁액을 금속체 (No. 200)로 여과한 후 RPMI 1640-FBS (5% fetal bovine serum 함유된 RPMI-1640)로 세척하고 다시 RPMI 1640-FBS로 세포농도를 2 × 106 cell/㎖이 되도록 조정한 후 96-well plate에 180 ㎕씩 분주하고 활성을 측정하고자 하는 시료를 농도별로 희석하여 20 ㎕씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한 후 상등액을 회수하여 골수세포 증식 활성 측정에 사용하였다.
순화, 투여 및 관찰기간 중 Polysulfone 사육상자 (260W × 420L × 150H ㎜) 에 2 ~ 3 마리씩 수용하였으며 사육상자 및 급수병은 주 1회교환하였으며, 모든 사육기자재는 고압증기멸균기 (121℃, 20 min)로 멸균하여 사용하였다.
부검일의 체중은 부검 전일에 하루 밤 절식시킨 후에 측정하였다. 시험 종료 후 실험동물을 부검 당일에 isofluran으로 흡입하여 마취하고 복대동물 절단방법으로 치사 시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안적으로 관찰하였다.
5% 감소). 이러한 결과로 미루어 황기 지상부 조다당 획분 AMA-0에 포함된 여러 물질 중 황기 지상부에서 장관면역 활성에 중요하게 관여하는 고분자획분의 활성물질은 단백질보다는 다당체일 것으로 추정되며 이러한 활성물질을 밝히기 위하여 조다당 획분의 분리를 진행하였다.
5) 50 ㎖를 첨가하고 암실, 4℃에서 96시간 교반하였다. 잔여 periodate를 제거하기 위해 ethylene glycol을 첨가하고 투석을 행하여 얻은 비투석액에 NaBH4를 첨가하여 환원시키고 초산으로 중화 후 투석, 동결 건조하여 AMA-0의 NaIO4 산화물 (periodate-oxidized AMA-0, 수율; 56.2%)을 조제하였다. Pronase 효소에 의한 가수분해 처리는 조다당 획분 (AMA-0) 20 ㎎을 10 ㎎ CaCl2가 함유된 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
, 1993). 즉, 골수세포와 위에서 얻은 배양 상등액과의 배양종료 12시간 전에 Alamar BlueTM 20 ㎕를 첨가한 다음 형광도를 SpectroFluor Plus (Tecan, Durham, NC, USA)를 이용해 excitation 544 ㎚와 emission 590 ㎚에서 측정하여, 생리식염수를 시료 대신 사용한 대조구와 골수 세포의 증식도를 비교하여 정량화하였다.
한약재로부터 추출한 면역 활성성분에 의해 peyer's patch의 T cell 을 활성화 시켜 IL-6 및 GM-CSF와 같은 조혈계 세포의 성숙 및 분화에 필요한 cytokine을 생산함으로써 골수세포를 증식시킨다는 연구결과 (Hong et al., 1998)에 근거하여 황기지상부에서 분리된 다당체의 장관면역 활성을 통한 전신 면역계 활성 증대에 대한 가능성 예측과 골수세포 증식 활성의 원인을 구명하기 위하여 6종의 황기 지상부 기원의 다당체 처리에 따른 장관 peyer’s patch 면역담당세포에서 interlekin-6 (IL-6) 등의 골수세포증식촉진인자의 생성 촉진 여부를 검정하였다.
황기 지상부 열수 추출물로부터 제조된 황기 지상부 조다당 획분이 당구조를 가진 고분자 화합물인지의 여부와 이들이 실제 장관면역활성을 물질을 포함하고 있는지의 여부를 판단하기 위하여 황기 지상부 조다당 획분을 대상으로 하여 NaIO4에 의한 산화 처리와 pronase에 의한 가수분해 처리를 수행하고 처리 전 · 후의 장관면역 활성을 검정하였다.
황기 지상부로부터 분리된 6개의 다당체를 대상으로 장관면역 활성을 peyer’s patch를 매개로 하는 기작을 이용하는 지를 동시에 확인할 수 있는 활성 측정방법을 통하여 비교하였다.
황기 지상부를 대상으로 열수추출과 에탄올 침전을 통해 얻어지는 조다당 획분인 AMA-0에 포함된 활성물질을 검토하기 위하여 AMA-0를 periodate (NaIO4) 산화 및 단백질 분해효소인 pronase로 가수분해한 이후 그 반응산물들에 대하여 골수세포 증식능을 통한 장관면역 활성을 비교 검토하였다. Table 1에서 보이는 것처럼 periodate 산화 및 pronase에 의한 가수분해로 처리군에서 모든 농도의 AMA-0의 장관면역 활성이 감소하였으나 황기 지상부 조다당 획분 100 ㎍/㎖ 에 pronase를 처리한 경우에의 장관면역 활성 감소는 통계적으로 유의한 수준이 아니었다.
황기 지상부의 조다당 획분의 제조에서는 분말화된 황기 지상부 시료 1 ㎏에 대해 20배 부피의 증류수를 첨가하고 교반 후 처음 첨가된 증류수의 절반이 되는 양까지 가열하였다. 다시 동일한 양의 증류수를 이용해 2회 반복 추출하고 추출액을 합하여 흡인 여과한 후 여과액을 합하여 감압농축하고 농축된 양의 5배의 EtOH을 첨가하여 침전시키고 4℃에서 30분간 7,000 rpm으로 원심분리하여 상등액과 잔사로 분리하였다.
획득된 다당체 (AMA-1-a-PS1 ~ AMA-1-d-PS6)의 순도를 확인하기 위하여 Shodex OHpak SB-805 (8 × 300 ㎜, Showa Denko, Tokyo, Japan) column이 장착된 Waters 2690 HPLC (Waters, Miliford, MA, USA)를 0.2 M NaCl 용액으로 용출 시키면서 (0.5 ㎖/min) RI (refractive index) detector를 이용 하여 실행하였으며, 정제 다당의 분자량 측정을 위해 표준물질로 dextran T-2000 (2 × 106), T-500, T-70 및 포도당을 사용하여 구한 표준곡선과 Kav값을 비교하여 측정하였다.
, Tokyo, Japan)를 가하여 37℃에서 48시간 가수분해 시켰다. 효소반응은 0.1 N HCl로 중지시키고 투석 후 동결 건조하여 AMA-0의 단백질 분해물 (pronase-digested AMA-0, 수율; 64.3%)로 조제하였다.
5 ℓ를 사용하여 세정해서 미흡착 분획을 제거하였다. 흡착 분획을 0.068 M, 0.115 M, 0.159 M 및 0.582 M의 Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) 용액으로 차례로 용출시켜 각 획분을 투석 (Spectra/por4 with MWCO 3500, 12000-14000 Da), 농축 및 동결 건조하여 4개의 획분 즉, AMA-1-a 용출분획 (2.0 ℓ NH4HCO3, 4.8%), AMA-1-b 용출분획 (1.8 ℓ NH4HCO3, 3.2%), AMA-1-c 용출분획 (2.0 ℓ NH4CO3, 3.3%), AMA1-d 용출분획 (8.0 ℓ NH4CO3, 33.4%)을 획득하였다.
대상 데이터
2%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 확인되었다. AMA-1-b-PS3 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-2를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 분자량 87000 Da의 다당체 획분을 획득하였다, AMA-1-b-PS3는 당표준물질인 arabinose, galactose mol 비가 1.3 : 1로 나타났고 산성당은 3.0%, 단백질은 4.6%, 우론산 함량은 3.6%로 구성된 다당류가 주 구성성분으로 나타났다.
0%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다. AMA-1-d-PS6 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-5를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 분자량 88000 Da의 PS-6를 획득하였다. AMA-1-d-PS6의 galactose, galacturonic acid mol 비는 5.
본 실험에 사용한 황기 (Astragalus membranaceus Bunge) 는 막협황기 (膜莢黃耆)로서 태백수집종을 선발하여 1999년 작물과학원에서 육성한 품종인 “풍성황기”이며 정선군농업기술센터에서 2년 동안 재배된 것의 전초를 채취하였다 (2012. 7. 23).
생후 5주령의 건강상태가 양호한 C3H/He의 암컷 마우스를 (주)대한실험동물센터로부터 구입하여 사용하였다. 사료는 실험 동물용 사료를, 물은 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며 환경은 항온, 항습 조건 (온도 22 ± 0.
순화 후 각 군의 평균체중이 균등하도록 무작위로 암수 각 2군, 군당 5마리로 군을 구성하였고 총 20마리를 시험에 사용하였다. 단회 경구 투여 독성시험에 있어서 용량설정은 암수 랫드 모두 일반적인 천연소재 추출물 적용의 한계용량으로 하여 5,000 ㎎/㎏/day을 투여한 결과 사망한 시험계가 없는 것으로 확인되어 대조군 (멸균증류수) 더불어 투여군은 5,000 ㎎/㎏/ day으로 설정되었다.
시험동물은 미국 Taconic 사에서 생산 및 제공하고 있는 특정병원체 부재 (specific pathogen-free, SPF) Sprague-Dawley 계통의 랫드를 사용하였고 단회 경구 투여 독성시험을 위해서 암·수 7주령 44마리를 대한바이오링크로부터 입수하였다.
순화, 투여 및 관찰기간 중 Polysulfone 사육상자 (260W × 420L × 150H ㎜) 에 2 ~ 3 마리씩 수용하였으며 사육상자 및 급수병은 주 1회교환하였으며, 모든 사육기자재는 고압증기멸균기 (121℃, 20 min)로 멸균하여 사용하였다. 실험동물용 고형사료는 방사선 멸균사료 (Zeigler Bros., Inc., Gardners, PA, USA)를 자유로 섭취시켰으며 여과살균된 정제수를 자유섭취 시켰다.
입수 및 검수 후 7일간의 검역과 순화 과정을 거쳐 건강한 동물 암 · 수 각각 20마리를 선발하여 암 · 수 4군에 군 당 5마리를 시험에 사용하였다.
23). 황기 지상부로부터 다당체를 획득하고 이들의 장관면역 증강활성 및 단회 경구 투여 독성시험을 위하여 지상부 (AMA, 잎과 줄기)의 시료를 잘게 잘라 50℃의 dry oven에서 5시간 동안 건조하여 분쇄한 후 40 mesh 이하의 체에 통과시켜 분말시료로 준비하였다.
데이터처리
본 시험 결과는 평균값과 표준편차로 표기하였으며 통계학적 분석은 SPSS 14.0K를 이용하였고 측정 항목 중 황기 지상부 열수 추출물로부터 획득된 다당체의 장관면역 활성관련 결과 및 단회 경구 투여 독성시험 중 체중 결과에 대하여 oneway analysis of variance (ANOVA) 검정법을 사용하였고, 이때 p-value가 0.05 이하일 경우 유의한 것으로 판정하였다. 단회 경구 투여 독성시험에서 사망동물이 관찰되지 않아 반수 치사량 (LD50)의 산출을 위한 통계는 실시하지 않았다.
이론/모형
† The proliferation of bone marrow cells was measured by a fluorometric method, using the Alamar BlueTM reduction assay.
각각의 분리 및 정제단계에서 얻은 시료에 대하여 중성당의 경우 Jones와 Albersheim의 방법 (1972)으로 2.0 M TFA (trifluoroacetic acid)로 121℃에서 1.5시간 동안 시료를 가수분해시킨 후 NaBH4를 이용하여 중성당을 alditol로 환원시키고, (CH3CO)2O를 이용하여 alditol acetate 유도체로 전환시켜 SP-2380 column (0.2 ㎛ film, 0.25 ㎜ i.d × 30 m, Supelco, Bellefontem PA, USA)이 장착된 gas-liquid chromatography (HP-6890 II GLC, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA) 로 구성당을 분석하였다.
따라서 본 연구에서는 황기의 지상부의 열수 추출물로부터 장관 peyer’s patch 속의 면역담당세포의 기능을 부활시키고, 면역능 증강 작용을 가진 고분자 다당 성분을 탐색하여, 강력한 장관면역개선 효과를 보이는 다당체를 분리하고 그 활성을 평가하였다. 또한 황기의 지상부을 식품원료로 사용하거나 식품공전이나 기능성식품공전에 등록하기 위한 안정성 평가의 일환으로 황기 지상부 추출물의 단회 경구 투여 시 나타날 수있는 독성의 질적, 양적인 평가는 의약품 등에 관한 식품의약품안전처 독성시험관리기준 (Ministry of Food and Drug Safety, 2013)과 OECD 검정기준 (Organization for Eeconomic Co-operation and Development, 2001)에 준하여 실시하였다.
일반적으로 골수세포 증식 촉진인자로 알려져 있는 IL-6의 함량 측정은 sandwich ELISA법을 이용하였다. 분석 하루 전 ELISA용 plate (Immunoplate, Maxisorp, NUNC, Basel, Switzerland)에 50 mM의 carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.
에 의한 산화 처리와 pronase에 의한 가수분해 처리를 수행하고 처리 전 · 후의 장관면역 활성을 검정하였다. 장관면역 활성검정은 하기 기술하는 분리된 장관면역 활성 다당체 활성검정과 동일한 방법을 적용하였으며 NaIO4에 의한 산화 처리와 pronase 효소에 의한 가수분해 처리는 Yamada 등 (1990)의 방법에 의거하여 실시하였다. 즉 조다당 획분 (AMA-0) 50 ㎎ 에 25 mM NaIO4가 함유된 50 mM acetate buffer (pH 4.
직접적인 장관면역 활성도는 시료와 peyer’s patch 세포와의 반응 후 회수한 상등액을 골수세포와 반응시켜 골수세포가 증식되는 정도로서 나타내는데, 증식도 측정은 Alamar BlueTM의 형광시약이 살아 있는 골수세포의 전자전달계에서 방출되는 전자에 의해 환원되어 발색되는 측정법을 사용하였다 (Pag et al., 1993).
총 6개 획분 다당체의 총당, 산성당 및 단백질 함량은 각각 galactose, galacturonic acid 및 bovine serum albumin (BSA) 을 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법, m-hydroxybiphenyl 법, Lowry법으로 정량하였다.
황기 지상부로부터 획득한 다당체 (AMA-1-a-PS1 ~ AMA1-d-PS6)의 장관면역 활성 검정은 Hong 등 (1998)의 방법에 의거하여 측정하였다. 즉, CH
성능/효과
4개의 분획 중 AMA-1-a에 대하여 0.2 M NaCl 용액으로 평행화된 Sepharose CL-6B column (2.5 × 94 ㎝)에서 gel filtration chromatography를 실행하여 1개의 획분을 얻었으며 (AMA-1-a-PS1, 0.54%), AMA-1-b 분획은 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sephacryl S-200 (1.7 × 82 ㎝)에서 gel filtration chromatography를 행하여 2개의 획분 (AMA-1-bPS2, 0.13%; AMA-1-b-PS3, 0.52%)를 얻었고 AMA-1-c에서도 Sephacryl S-300 (2.6 × 85 ㎝)을 이용하여 1개의 획분 (AMA-1-c-PS4, 0.04%)을 얻었다.
AMA-1-b-PS2 다당체는 총당 92.1%와 산성당 3.9%, 단백질 4.7%로 구성되어있으며 중성당으로는 arabinose, mannnose, galactose, glucose mol 비가 0.5 : 1.1 : 1.1 : 1.0로 포함되었고, glucuronic acid와 galacturonic acid로 구성된 산성당이 2.9%로 구성되어 중성당이 주 구성물질인 반면 AMA-1-d-PS5과 AMA-1-d-PS6는 총당이 각각 72.6%, 54.1%, 단백질이 2.4, 2.6%, 우론산 함량이 25.3, 43.2로 구성되어 있고 산성당이 28.4, 61.7%로 구성되어 주로 산성당이 활성에 관여하는 물질로서 함유되어진 다당체인 것으로 추정된다.
AMA-1-c-PS4의 분자량은 345000 Da, 당표준물질 arabinose, mannnose, galactose, glucose mol 비가 0.9 : 1.6 : 1.4 : 1로 나타났고 산성당은 4.9%, 단백질은 5.2%, 우론산 함량은 3.3%로 구성된 다당류가 주 구성성분으로 확인되었다.
AMA-1-d-PS6 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-5를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 분자량 88000 Da의 PS-6를 획득하였다. AMA-1-d-PS6의 galactose, galacturonic acid mol 비는 5.0:1.0으로 나타났고 산성당은 61.7%, 단백질은 2.6%, 우론산 함량은 43.2%로 구성된 다당류가 주 구성성분인획분으로 나타났다.
DEAE-Sepharose FF의 0.115 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-b 분획에서 gel filtration chromatogrphay 를 행하여 얻은 2개의 획분 (AMA-1-b-PS2, AMA-1-b-PS3) 중 AMA-1-b-PS2의 분자량은 345000 Da, 당함량은 92.1%, 당표준 물질 당표준물질인 arabinose, mannnose, galactose, gucose의 mol 비가 0.5 : 1.1 : 1.1 : 1.0로 나타났고 산성당은 2.9%, 단백질은 4.7%, 우론산 함량은 3.2%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 확인되었다. AMA-1-b-PS3 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-2를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 분자량 87000 Da의 다당체 획분을 획득하였다, AMA-1-b-PS3는 당표준물질인 arabinose, galactose mol 비가 1.
DEAE-Sepharose FF의 0.582 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-d 분획으로부터 gel filtration chromatogrphay를 행하여 얻은 2개의 획분 (AMA-1-d-PS5, AMA-1-d-PS6) 중 AMA-1-d-PS5의 분자량은 129000 Da, 당표준물질 arabinose, galactose, glalacturonic acid mol 비가 1.0 : 1.0: 1.0로 나타났고 산성당은 28.4%, 단백질은 2.4%, 우론산 함량은 25.0%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다. AMA-1-d-PS6 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-5를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 분자량 88000 Da의 PS-6를 획득하였다.
Peyer’s patch를 매개로 하는 림프구 활성 측정에서 AMA1-b-PS2가 AMA-1-c-PS4 보다 높은 활성을 나타낸 반면 세포증식촉진인자 중 IL-6의 생성에 있어서는 AMA-1-c-PS4가 AMA-1-b-PS2 보다 더 높은 효과를 나타내었다.
Table 1에서 보이는 것처럼 periodate 산화 및 pronase에 의한 가수분해로 처리군에서 모든 농도의 AMA-0의 장관면역 활성이 감소하였으나 황기 지상부 조다당 획분 100 ㎍/㎖ 에 pronase를 처리한 경우에의 장관면역 활성 감소는 통계적으로 유의한 수준이 아니었다. periodate 산화 및 pronase에 의한 가수분해에 의한 황기 지상부 조다당 획분의 장관면역 활성 감소 비율 중 특히 periodate에 의한 산화가 가장 많은 활성 감소 비율을 나타내었다 (시료농도 100 ㎍/㎖, AMA-0 활성의 47.4% 감소). Periodate는 당의 구조에서 인접한 hydroxyl기를 갖는 탄소와 탄소 사이를 산화시키는 특성을 갖는다고 보고되고 있으므로 (Goldstein et al.
그 결과 peyer’s patch를 매개로 하는 골수세포증식 효과를 나타내었던 AMA-1-b-PS2와 AMA-1-c-PS4 처리구에서 IL-6의 세포증식 촉진인자를 높은 수준으로 생성하였다.
그 결과, AMA-1-b-PS2에서 peyer’s patch 를 매개로 한 기작을 통하여 가장 높은 활성 (시료농도 10 ㎍/㎖, 대조군의 11배, 시료농도 50 ㎍/㎖ 이상의 경우, 대조군의 60배)을 나타내었으므로 AMA-1-b-PS2의 경우 직접적으로 다당체가 골수세포의 증식에 직접적으로 영향을 미칠 뿐만 아니라 peyer’s patch의 세포를 자극하고 활성화 시켜 세포로 하여금 cytokine 및 lymphokine류의 생산을 증대시킴으로 골수세포 증식에 영향을 미칠 수도 있음을 나타내었다 (Fig. 2).
순화 후 각 군의 평균체중이 균등하도록 무작위로 암수 각 2군, 군당 5마리로 군을 구성하였고 총 20마리를 시험에 사용하였다. 단회 경구 투여 독성시험에 있어서 용량설정은 암수 랫드 모두 일반적인 천연소재 추출물 적용의 한계용량으로 하여 5,000 ㎎/㎏/day을 투여한 결과 사망한 시험계가 없는 것으로 확인되어 대조군 (멸균증류수) 더불어 투여군은 5,000 ㎎/㎏/ day으로 설정되었다. 랫드를 투여 전날 절식시키고 황기지상부 추출물을 투여당일에 측정한 체중을 기준으로 10 ㎖/㎏의 농도로 조제하여 1회/1일로 투여하였으며 랫드의 경배부 피부를 고정하고 금속제 경구투여용 존데를 이용하여 강제 경구투여 한 후 14일 동안 관찰하였다.
따라서 황기 지상부 추출물을 단회 경구 투여 하였을 때 랫드의 최소치사량은 암컷과 수컷 모두에서 5,000 ㎎/㎏을 상회함을 알 수 있었고 한약재로 널리 알려진 도라지의 뿌리로부터 분리 • 정제된 platycodin D의 단회 경구 투여 독성평가에서 LD50이 2,000 ㎎/㎏ 이상이었음을 보고한결과 (Lee et al., 2011)와 랫드에서 장수버섯으로 발효시킨 옻나무 추출물의 단회 경구 독성시험 결과, 5,000 ㎎/㎏ 투여군에서도 사망이 관찰되지 않아 안전한 동물사료첨가제 및 기능성 식품 개발에 소재임을 확인한 연구 결과 (Choi et al., 2010)를 비교하여 볼 때 단회 경구 투여 시 랫드의 최소치사량이 암컷과 수컷 모두에서 5,000 ㎎/㎏을 상회하는 황기 지상부 추출물은 안전한 추출물로 산업적으로 응용이 가능할 것으로 생각된다.
반면 AMA-1-c-PS4 의 경우, 상기 기술한 바와 같이 직접적인 골수세포에 미치는 영향은 크지 않으나 peyer’s patch를 매개로 하는 골수세포 증식비율이 시료농도 10 ㎍/㎖에서는 대조군의 11배, 시료농도 50 ㎍/㎖ 이상의 경우, 대조 군의 45배로 높게 나타났기 때문에 장관면역의 활성기작이 직접적으로 활성획분이 골수세포의 증식에 영향을 미치는 것이 아닌 장관점막림프조직 peyer’s patch의 세포만을 경유하여 골수세포 증식에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다 (Fig. 2).
, 1965) 황기 지상부 조다당 획분이 장관면역 활성을 나타내는데 있어 중요하게 관여하는 물질이 당류일 가능성을 높게 해주고 있으며, 결과적으로 periodate 처리에 의한 산화에 따라 황기 지상부 조다당 획분의 장관면역 활성이 감소한 것은 황기 지상부에 포함되어진 장관면역 활성 다당체의 다당류의 당 구조가 파괴되어 활성이 감소된 것으로 생각된다. 반면, pronase 처리에 의한 장관면역활성 감소의 변화가 periodate 산화와 비교하여 상대적으로 크지 않았고 통계적으로도 유의한 수준이 아니었다 (시료농도 100 ㎍/㎖, AMA-0 활성의 10.5% 감소). 이러한 결과로 미루어 황기 지상부 조다당 획분 AMA-0에 포함된 여러 물질 중 황기 지상부에서 장관면역 활성에 중요하게 관여하는 고분자획분의 활성물질은 단백질보다는 다당체일 것으로 추정되며 이러한 활성물질을 밝히기 위하여 조다당 획분의 분리를 진행하였다.
분말화된 황기 지상부 시료로부터 얻은 조다당 분획을 대상으로 하여 장관면역 활성을 검정한 결과 AMA-0 획분은 10 ㎍/㎖를 처리한 경우 F. I. 값이 786.5 ± 28.8를 나타내어 대조구 [F. I. (Fluorescence intensity): 602.0 ± 12.4]보다 높은 활성을 나타내었으며 100 ㎍/㎖를 처리한 경우 F. I. 값이 1145.8 ± 62.6를 나타내어 대조구에 비하여 1.9배 이상 증가된 활성을 나타내었다 (Table 1).
상기 결과를 통하여 뿌리만 활용하던 황기의 지상부로부터 장관면역 활성 성분으로 분리 정제된 다당류가 분자량 345000 Da의 arabinogalactan 계열임을 확인할 수 있었고 황기 지상부 다당체 추출물은 단회 경구 투여 시 투여 가능 최대 용량에서도 독성이 없는 안전한 천연물이라는 것을 확인하였다.
이상의 결과를 통하여 황기 지상부 추출물의 랫드에 있어서 단회 경구 투여에 의한 독성지표인 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰한 결과, 대조군과 시험군의 유의한 차이는 발견되지 않았으며 따라서 본 단회 경구 투여 독성시험에서 시험물질이 랫드에서의 개략치사량 (ALD)은 한계량인 5,000㎎/㎏을 상회하는 것으로 추정된다고 하겠다. 이러한 결과는 황기의 지상부 추출물을 랫드를 대상으로 90일 반복 경구투여하고 독성 검정을 수행한 결과 수컷의경우 NOEL (no observed effect level)은 5,000 ㎎/㎏/day으로 추정되고, 암컷의 경우 NOAEL (no observed adverse effect level)이 5,000 ㎎/㎏/day로 추정된다고 보고한 결과 (Park et al., 2013)와 유의한 상관관계가 있음을 확인할 수 있었고 황기 지상부 추출물이 천연물의 투여가능 최대 용량에서도 독성이 없는 안전한 천연물임을 입증하였다.
또한 간, 신장, 비장의 무게를 관찰한 결과 유의적인 변화가 관찰되지 않았다 (자료 미제시). 이상의 결과를 통하여 황기 지상부 추출물의 랫드에 있어서 단회 경구 투여에 의한 독성지표인 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰한 결과, 대조군과 시험군의 유의한 차이는 발견되지 않았으며 따라서 본 단회 경구 투여 독성시험에서 시험물질이 랫드에서의 개략치사량 (ALD)은 한계량인 5,000㎎/㎏을 상회하는 것으로 추정된다고 하겠다. 이러한 결과는 황기의 지상부 추출물을 랫드를 대상으로 90일 반복 경구투여하고 독성 검정을 수행한 결과 수컷의경우 NOEL (no observed effect level)은 5,000 ㎎/㎏/day으로 추정되고, 암컷의 경우 NOAEL (no observed adverse effect level)이 5,000 ㎎/㎏/day로 추정된다고 보고한 결과 (Park et al.
황기 지상부 추출물 (AMA) 투여에 의해 실험기간 중 대조 군을 포함한 모든 시험군에서 사망동물은 관찰되지 않았으며 (Table 3) 시험물질에 의한 독성증상과 특이적 임상소견도 나타나지 않았다. 따라서 황기 지상부 추출물을 단회 경구 투여 하였을 때 랫드의 최소치사량은 암컷과 수컷 모두에서 5,000 ㎎/㎏을 상회함을 알 수 있었고 한약재로 널리 알려진 도라지의 뿌리로부터 분리 • 정제된 platycodin D의 단회 경구 투여 독성평가에서 LD50이 2,000 ㎎/㎏ 이상이었음을 보고한결과 (Lee et al.
황기 지상부 추출물 단회 경구 투여에 의한 14일간 암수 랫드의 체중 변화 (body weight changes)와 증체량 (weight gains)를 검정하여 본 결과 암수 시험물질 투여군에서 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중변화는 없었다. 증체중 (weight gain)의 경우 수컷 대조군과 황기 지상부 추출물 투여군은 각각 132.
황기 지상부로부터 분리된 6개의 다당체 중 AMA-1-a-PS1의 분자량은 75,000 Da으로 당함량은 96.2%를 나타내었고 당표준물질인 arabinose, mannnose, galactose, glucose의 mol 비가 1.4 : 1.3 : 2.6 : 1.0 (Ara : Man : Gal : Glc = 1.4 : 1.3 : 2.6 :1.0)을 나타내었으며 산성당은 1.3% 단백질은 0.3%, 우론산 함량은 3.5%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분이었다.
후속연구
그러므로 peyer’s patch에 작용하여 면역세포의 기능을 증강하거나 저하된 면역세포를 부활시킬 수 있는 물질은 국소 점막의 생체방어기구를 증강시킬 수 있을 뿐만 아니라 전신성 염증 (systemic inflammation)을 조절하여 결과적으로 알레르기반응, 자가 면역질환 등을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 보고되고 (James and Zeitz, 1994) 있어 peyer’s patch의 면역담당세포의 기능을 부활시키는 것을 지표로 하여 생체방어기구를 부활할 수 있는 물질을 선발할 수 있을 것으로 생각된다.
황기 지상부로 분리된 다당체는 한약 및 국내 약용작물 산업에서 전신면역계를 활성화할 수 있는 장관 면역활성 또는 항암제 치료 시 나타날 수 있는 부작용인 골수세포의 증식억제를 완화시킬 수 있는 기능성소재로서 식품 등에 이용가치가 클 것으로 예상될 뿐 아니라 이러한 뿌리 생산을 위한 황기재배 시 부산물로 발생하는 지상부의 활용은 다년근 재배 시 발생할 수밖에 없는 재배기간 동안의 경제적 손실로부터 농가 소득 보존의 효과와 함께 유용소재 발굴을 통한 소비 촉진 효과도 기대할 수 있을 것으로 사료되어진다. 또한 황기 지상부로부터 분리되어지고 장관면역 증강 작용 효과가 확인된 다당체의 정확한 구조해석 및 활성과 작용기구와의 상관관계에 관한 연구가 필요할 것으로 생각되어지며 이는 3차 기능성 식품 내지 신약개발로의 발전에 중요한 정보를 제공하리라 사료된다.
, 2001). 이런 점에서 한방제제에 포함되어진 식물성 생약에서 기원하는 고분자 다당 성분이 생체방어기구의 저하와 면역능 감소에 의해 유도되는 감염증 치료와 예방에 사용되어질 수 있을 것으로 생각된다.
황기 지상부 다당체 중 peyer’s patch를 매개로 하는 골수 세포증식 기작이 예상되어지는 AMA-1-b-PS2와 AMA-1-cPS4의 경우 단백질 함량은 매우 낮았고, 중성당을 주 구성당으로서 하고 있으며 arabinose와, galactose 간의 교호적인 결합으로 이루어진 주쇄에 다양한 종류의 중성당이 측쇄로 결합 되어 있는 형태의 갈락탄 계통의 다당류일 것으로 추정되나, 보다 확실한 활성 획분의 구조를 밝히기 위한 구조분석이 필요할 것으로 생각된다.
황기 지상부로 분리된 다당체는 한약 및 국내 약용작물 산업에서 전신면역계를 활성화할 수 있는 장관 면역활성 또는 항암제 치료 시 나타날 수 있는 부작용인 골수세포의 증식억제를 완화시킬 수 있는 기능성소재로서 식품 등에 이용가치가 클 것으로 예상될 뿐 아니라 이러한 뿌리 생산을 위한 황기재배 시 부산물로 발생하는 지상부의 활용은 다년근 재배 시 발생할 수밖에 없는 재배기간 동안의 경제적 손실로부터 농가 소득 보존의 효과와 함께 유용소재 발굴을 통한 소비 촉진 효과도 기대할 수 있을 것으로 사료되어진다. 또한 황기 지상부로부터 분리되어지고 장관면역 증강 작용 효과가 확인된 다당체의 정확한 구조해석 및 활성과 작용기구와의 상관관계에 관한 연구가 필요할 것으로 생각되어지며 이는 3차 기능성 식품 내지 신약개발로의 발전에 중요한 정보를 제공하리라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
장관림프상 조직은 어떤 역할을 담당하는가?
장관림프상 조직 (Gut Associatied Lymphoid Tissue, GALT)은 수많은 영양소의 소화와 흡수의 장소이면서 유해한 이물질과 미생물들에 대한 물리적 장벽역할을 수행할 뿐 아니라 면역반응을 이용한 생체방어에 중요한 역할을 담당하고 있다 (Mowat and Viney, 1997). GALT에서의 여러 면역기관중 peyer's patch (파이엘판)는 장관 내 핵심적인 림프기관일뿐만 아니라 IgA 생산을 위한 중요한 유도부위 (inductive site)로서 기능을 하고 있고 (Sminia et al.
생약제재들은 어떻게 치료효과를 나타내는가?
생약제재들은 신체의 항상성 (homeostasis)을 유지시키고 면역계 내 분비계, 신경계 및 순환계에 조절 역할을 담당하는 biological response modifier (BRM)로서 작용할 뿐만 아니라 여러 종류의 세포들의 receptor 기능을 조절함으로써 치료효과를 나타낸다. 그럼에도 불구하고 이러한 생약제제들의 사용은 아직도 과학적 입증 없이 경험적으로 처방 사용되고 있으므로 이들의 치료효과 및 작용기구의 과학적 해석과 구조의 판명 등은 시급히 연구되어야 할 과제 중의 하나라고 생각된다.
천연 유래 다당체를 면역조절제로서 임상적 적용에 활용한 연구의 예시에는 어떤 것들이 있는가?
천연에서 유래한 다당체는 면역시스템이 영향을 미치는 거대분자로서 면역조절제로서의 잠재성을 가지고 있어 광범위한 임상적 적용이 이루어지고 있다. 예를 들면 버섯류로부터 분리되어진 다당체인 베타글루칸은 대식세포의 활성화를 통한 항암활성을 가지는 것으로 보고되고 있고 (Wasser, 2002; Ooi and Liu, 2000) 식물체의 세포벽이나 담자균류 박테리아로부터 분리 되어진 베타글루칸은 포도당중합체로서 항암활성과 항감염활성을 가지고 있다고 한다 (Kataoka et al., 2002; Ohno et al., 2001). 또한 현재까지 처방되는 한방제제 중, 「보제(補劑)」로 분류된 십전대보탕과 소자호탕 등에 대한 활성검정에서, 이런 한방방제가 각종 면역세포를 부활시키는 효능을 나타내는데 그 효능이 제제에 포함되어진 고분자성 다당 성분에 기인한다는 것이 증명되고 있으며 (Yamada, 1999; Borchers et al., 2000) 또, 십전대보탕에서 구성 약재 중 「창출 (Atractylpdes lances DC.의 근경)」에 포함되어진 다당 성분에 의해 Candida albicans 감염된 마우스에 대해 감염 방어와 억제 활성이 보고되고 있다 (Inagaki et al., 2001).
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