[논문]애기땅빈대의 열수 추출 및 에탄올 추출물의 항산화 활성 비교

강란이; 최학주; 박지원; 심부용; 이해진; 김동희

애기땅빈대의 열수 추출 및 에탄올 추출물의 항산화 활성 비교
Comparison on the Antioxidative Activity of Ethanol and Hot Water Extracts of Euphorbia supina Rafinesque 원문보기

論文集 : 大田大學校韓醫學硏究所. 韓醫學編, v.23 no.1, 2014년, pp.105 - 114

강란이 (대전대학교 한의과대학) , 최학주 () , 박지원 (대전대학교 한의과대학) , 심부용 (대전대학교 한의과대학) , 이해진 () , 김동희 (대전대학교 한의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : In this study, the antioxidant activities of the 80% ethanol and hot water extracts of Euphorbia supina Rafinesque were investigated. Methods : We measured total phenol contents, flavonoid contents, 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radical scavenging assay. The production of reactive oxygen species was measured in LPS-induced RAW 264.7 cells using flow cytometry system. Results : The content of phenol in the hot water extract was $65.529{\pm}0.462mg/g$ and $126.932{\pm}1.894mg/g$ in the 80% ethanol extract, and that of flavonoid in the hot water extract was $16.063{\pm}0.471mg/g$ and $29.159{\pm}1.963mg/g$ in the ethanol extract. The 80% ethanol extract also showed higher DPPH and ABTS radical scavenging activities ($90.8{\pm}1.0%$ and $92.5{\pm}0.7%$) than the hot water extract ($81.5{\pm}0.5%$ and $91.5{\pm}0.2%$). The production of reactive oxygen species(ROS) was reduced dose-dependently by 80% ethanol and hot water extract at concentration of 1, 10 and $100{\mu}g/m{\ell}$ of RAW 264.7 cells. Conclusion : According to these results, the 80% ethanol extract of Euphorbia supina Rafinesque has a good anti-oxidative effects than the hot water extract. Thus, the 80% ethanol extract of Euphorbia supina Rafinesque may serve as useful natural antioxidants.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 우선적으로 현재 임상에서 활용되고 있는 열수 추출과 80% 에탄올 추출을 통해 애기땅빈대의 총 phenol 및 flavonoid 함량, DPPH와 ABTS 라디칼 소거능, reactive oxygen species (ROS) 등의 항산화 활성을 비교함으로써 신규 소재 개발과 임상에 활용 가능한 기초적 자료를 제공하고자 하였다.
애기땅빈대의 항산화 연구는 기존에 연구된 바 있으나, 본 연구에서는 현재 임상에서 주로 활용되고 있는 열수 추출과 80% 에탄올 추출을 통해 항산화 효능을 연구함으로써 신규 소재 개발과 임상에 활용 가능한 기초적 자료를 제공하고자 하였다.

제안 방법

을 응용하여 측정하였다. 각 샘플 0.1 ㎖와 80% 에탄올 0.9 mL을 혼합한 혼합물 0.5 ㎖에 10% aluminium niatate와 1M potassiumacetate 0.1 ㎖ 그리고 80% 에탄올 4.3 ㎖을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, quercetin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응 시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 ELISA reader기를 이용하여 흡광도의 변화를 측정한 후 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.
7 세포를 2×10⁵ cells/well이되게 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도와 LPS 1 ㎍/㎖의 농도를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 DCF-DA로 염색 한 후 유세포 분석기를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도와 LPS 1 ㎍/㎖의 농도를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 DCF-DA로 염색 한 후 유세포 분석기를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
7 세포에서 세포독성 평가를 위해 96 well plate에 2×10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 새로운 배양액으로 교체한 후 추출물을 각각 1, 10, 100, 200, 400, 1000 (㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응 시켰다.
5 ㎖ 증류수를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상청액을 취해 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 GAE (Gallic acid equivalent)/g을 사용하였다.
추출물의 농도를 1, 10, 100, 1,000 (㎍/㎖)의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS (2,2–azino–bis-(3- ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid))와 2.6 mM potassium persulphate를 제조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온 (ABTS·+)을 형성시킨 다음 734 ㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석하고, 희석된 ABTS·+ 용액 150 ㎕와 추출물을 각각 5 ㎕ 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
추출물의 농도를 1, 10, 100, 1,000 (㎍/㎖)의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 ㎕와 추출물을 각각 100 ㎕씩 혼합하여 37℃에서 30분간 반응 시켰다. 반응 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 애기땅빈대(Euphorbia supina Rafinesque)는 대전대학교 지역혁신센터 난치성 면역질환의 동서생명의학 연구센터(TBRC)에서 구입하여 정선 후 사용하였다(Fig. 1).
사용된 시약은 isopropanol (Sigma Co., U.S.A.), ether (Sigma Co., U.S.A.), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), Fetal bovine serum (FBS, Invitrogen Co., U.S.A.),penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab sevice, Korea), lipopolysaccharide (LPS : Sigma Co., U.S.A.), (2,7)-dichlorodihydrofluorescin diacettate (DCFH-DA : Sigma Co., U.S.A.), 2,4-dinitrochlorobenzene (Sigma Co., U.S.A.), ethanol (Merck Co., Germany), 1,1-diphenyl -2-picryl-hydrazyl (DPPH, Sigma Co., U.S.A.), 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma Co., U.S.A.), 2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA, Sigma Co., U.S.A), Folin-Ciocalteu's phenol reagent (Merck, Germany), gallic acid (Sigma Co., U.S.A), sodium carbonate (Sigma Co., U.S.A) 등을 사용하였으며, 기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), flow cytometry system (BD biosciences, U.S.A.) 등을 사용하였다.
실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 동결된 RAW 264.

데이터처리

실험 결과는 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test를 사용하여 통계처리 하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.

이론/모형

시료의 flavonoid 함량은 Nieva Moreno 등의 방법²¹⁾을 응용하여 측정하였다. 각 샘플 0.
총 페놀 함량은 Gutfinger의 방법²⁰⁾을 응용하여 측정하였다. 추출 시료용액 1 ㎖에 50% Foiln-Ciocalteu's phenol reagent 0.

성능/효과

1. 세포 독성 측정 결과, 80% 에탄올 추출물과열수 추출물은 1, 10, 100, 200, 400, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 95% 이상의 생존율을 나타내었다.
2. 총 페놀 및 플라보노이드 측정 결과, 80% 에탄올 추출물이 열수 추출물 보다 더 높은 함량을 나타내었다.
3. DPPH 라디칼 소거능 측정 결과, 두 추출물 모두 농도 의존적으로 높은 결과 값을 나타내었으나 100 ㎍/㎖ 농도에서 80% 에탄올 추출물이 더 우수한 효능을 나타내었다.
4. ABTS 라디칼 소거능 측정 결과, 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물 모두 농도 의존적으로 우수한 효능을 나타내었다.
5. ROS 생성량을 측정한 결과, 두 추출물 모두 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었으나 80% 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비해 더 우수한 효능을 나타내었다.
RAW 264.7 세포주 세포 생존율을 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 열수추출물은 1, 10, 100, 200, 400, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 113.0±3.7%, 110.5±2.4%, 107.6±5.1%, 109.1±4.8%, 105.1±1.9%, 107.6±5.0%의 세포 생존율을 나타내었으며, 80% 에탄올 추출물은 1, 10, 100, 200, 400, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 112.5±1.4%, 105.5±3.8%, 101.7±4.9%, 98.4±2.5%, 98.1±2.3%, 96.4±3.8%의 세포 생존율을 나타내었다(Fig. 2).
결과적으로, 애기땅빈대는 항산화력이 뛰어난 천연물이며 임상에서 사용되어지는 80% 에탄올과 열수추출의 연구결과, 80% 에탄올 추출물은 열수 추출물보다 총 phenol 및 flavonid 함량, DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능, ROS 생성량의 측정 결과가 유사하거나 우수한 효능을 나타내었고, 100 ㎍/㎖의 농도가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 애기땅빈대 아세트산에틸(ethyl acetate) 추출물의 항산화 연구결과와 비교하였을 때, 본 연구의 80% 에탄올 추출물에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서 우수한 결과가 나타났으나, 메탄올 추출의 100 ㎍/㎖ 농도와 DPPH radical 소거능 효과를 비교하였을 때는 낮은 결과를 나타내었다.
7% 로 나타나, 두 추출물 모두 농도 의존적으로 ABTS 라디칼 소거능이 증가함을 보였다. 두 추출물간의 결과는 큰 차이를 보이지 않았으며 두 추출물 모두 100 ㎍/㎖ 농도에서부터 매우 우수한 ABTS 라디칼 소거능을 나타냈다(Fig. 4).
결과적으로, 애기땅빈대는 항산화력이 뛰어난 천연물이며 임상에서 사용되어지는 80% 에탄올과 열수추출의 연구결과, 80% 에탄올 추출물은 열수 추출물보다 총 phenol 및 flavonid 함량, DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능, ROS 생성량의 측정 결과가 유사하거나 우수한 효능을 나타내었고, 100 ㎍/㎖의 농도가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 애기땅빈대 아세트산에틸(ethyl acetate) 추출물의 항산화 연구결과와 비교하였을 때, 본 연구의 80% 에탄올 추출물에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서 우수한 결과가 나타났으나, 메탄올 추출의 100 ㎍/㎖ 농도와 DPPH radical 소거능 효과를 비교하였을 때는 낮은 결과를 나타내었다. 향 후, 동일한 약재, 실험과정과 농도를 설정하여 다양한 용매에 따른 항산화 효과 비교를 통해 정확한 항산화 활성의 확인 및 생리 활성을 확인할 필요가 있어야 할 것으로 생각된다.
본 연구에 앞서 실험에 대한 안전성을 확인하기 위해 세포독성을 평가한 결과, 애기땅빈대의 열수추출물 및 80% 에탄올 추출물 모두 1, 10,100, 200, 400, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 95% 이상의 세포 생존율을 나타내어 안전한 것으로 나타났다.
또한 항암, 항고혈압, 항염증, 항당뇨, 항노화 및 항산화 효능이 있는 것으로 알려져 있고 주로 액포 및 세포막에서 유리형, 에스테르형 또는 결합형으로 존재하고 있다^24-28). 본 연구에서 gallic acid를 표준물질로 하여 애기땅빈대의 총 phenol을 측정한 결과, 80% 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비해 높은 함량을 나타냈다.
. 본 연구에서 quercetin을 표준물질로 하여 애기땅빈대의 flavonoid 함량을 측정한 결과, 80% 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 결과를 나타냈다. 이는 총 phenol 측정 결과가 반영된 것이라 할 수 있다.
. 본 연구에서 애기땅빈대의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물 모두 농도 의존적으로 높은 결과 값을 나타내었으며 두 추출물 모두 100 ㎍/㎖의 농도부터 우수한 효능이 나타났다.
여러 연구에서 DPPH 라디칼 소거능은 총 폴리페놀 함량과 상호 관련성이 매우 높은 것으로 보고되고 있다^34-35). 본 연구에서 애기땅빈대의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물은 농도 의존적으로 높은 결과 값을 나타냈으나 100 ㎍/㎖ 농도에서 80% 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 우수한 효능이 나타났다. 이는 폴리페놀 함량과의 상관 관계로 인해 이와같은 연구 결과가 나타난 것이라 할 수 있다.
생체 내에는 이러한 활성 산소종으로부터 신체를 보호하기 위한 다양한 항산화 체계를 갖추고 있지만, 과도한 활성산소종의 증가는 항산화계의 활성을 감소시킨다³²⁾. 본 연구에서 애기땅빈대의 ROS 생성량을 측정한 결과, 80% 에탄올 추출물과 열수 추출물은 모든 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었다. 이와 같은 결과는 in vitro 상에서의 항산화 활성이 세포 내에서도 유효함을 확인할 수 있었다.
이상의 연구 결과를 통해 애기땅빈대가 뛰어난 항산화력을 지니고 있는 천연물임이며 80% 에탄올 추출이 더 효과적인 것이 실험적으로 규명되었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 향 후 보다 유의성 있는 신규 소재로서의 가능성과 다양한 가공식품의 제조에 도움이 될 것으로 판단된다.
추출 용매에 따른 애기땅빈대의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 열수추출물은 1, 10, 100, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 1.0±0.7%, 19.7±0.6%, 90.3±1.7%, 91.5±0.2% 로 나타났으며, 80% 에탄올 추출물은 1, 10, 100, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 5.9±0.9%, 21.1±0.9%, 90.1±1.4%, 92.5±0.7% 로 나타나, 두 추출물 모두 농도 의존적으로 ABTS 라디칼 소거능이 증가함을 보였다.
추출 용매에 따른 애기땅빈대의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 열수추출물은 1, 10, 100, 1000 (㎍/㎖) 농도에서 19.9±0.3%, 26.8±3.4%, 49.0±1.2%, 81.5±0.5% 로 나타났으며, 80% 에탄올 추출물은 1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖ 농도에서 20.1±1.4%, 30.7±2.5%, 74.7±4.4%, 90.8±1.0% 로 나타나, 두 추출물 모두 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가함을 보였다.
추출 용매에 따른 애기땅빈대의 ROS 생성량을 측정한 결과, 열수추출물은 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 정상군은 17.0±3.4%, 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 82.9±4.4%, 84.9±3.0%, 77.20±3.7%로 나타났으며, 80% 에탄올 추출물은 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 정상군은 19.3±7.1%, 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 82.9±5.2%, 76.5±3.8%, 70.6±3.3%로 나타나 두 추출물 모두 대조군에 비해 모든 농도에서 유의성 있는 (** : p <0.01, *** : p <0.001) 감소를 나타냈다(Fig. 5).
추출 용매에 따른 애기땅빈대의 총 페놀 및 flavonoid 함량을 측정한 결과, 열수추출물은 65.529±0.462 ㎎/g, 80% 에탄올 추출물은 126.932±1.894 ㎎/g의 총 phenol 함량을 나타냈으며, 총 flavonoid 함량은 열수 추출물에서 16.063±0.471 ㎎/g, 80% 에탄올 추출물에서 29.159±1.963 ㎎/g으로 나타나 80% 에탄올 추출물에서 phenol과 flavonoid의 함량이 더 많은 것으로 나타났다(Table 1).
0% 로 나타나, 두 추출물 모두 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가함을 보였다. 특히, 100 ㎍/㎖ 농도에서 80% 에탄올 추출물이 열수추출물에 비해 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다(Fig. 3).

후속연구

또한, 최근 합성 의약품들의 부작용과 독성의 많은 사례가 보고됨에 따라 합성 의약품을 대체할 수 있는 보다 안전한 의약품을 개발하기 위해 천연물 연구가 활발히 진행되고 있다^22-23). 따라서 항산화활성이 있는 천연물 소재의 기능성 식품이나 이런 천연물 소재를 이용한 가공 식품을 섭취함으로써 활성 산소에 의해 무너진 체내 생리활성의 균형을 개선 유지할 수 있는 연구가 필요하다.
이상의 연구 결과를 통해 애기땅빈대가 뛰어난 항산화력을 지니고 있는 천연물임이며 80% 에탄올 추출이 더 효과적인 것이 실험적으로 규명되었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 향 후 보다 유의성 있는 신규 소재로서의 가능성과 다양한 가공식품의 제조에 도움이 될 것으로 판단된다.
또한, 애기땅빈대 아세트산에틸(ethyl acetate) 추출물의 항산화 연구결과와 비교하였을 때, 본 연구의 80% 에탄올 추출물에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서 우수한 결과가 나타났으나, 메탄올 추출의 100 ㎍/㎖ 농도와 DPPH radical 소거능 효과를 비교하였을 때는 낮은 결과를 나타내었다. 향 후, 동일한 약재, 실험과정과 농도를 설정하여 다양한 용매에 따른 항산화 효과 비교를 통해 정확한 항산화 활성의 확인 및 생리 활성을 확인할 필요가 있어야 할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	애기땅빈대는 어떤 효능이 있는가?	애기땅빈대(Euphorbia supina Rafinesque)는 밭이나 들에서 자라는 대극과(Euphorbiaceae)에 속하는 일년생 초본으로, 중약에서 전초를 반지금(斑地錦)이라 하여 止血, 利尿, 通乳汁, 健胃, 活血, 解毒의 효능으로 黃疸, 泄瀉, 赤痢, 血尿, 血崩, 外傷出血, 母乳不足, 擁腫瘡毒 등의 치료에 사용된다고 알려져 있다11-12).
	애기땅빈대는 어디에 치료로 쓰이는가?	애기땅빈대(Euphorbia supina Rafinesque)는 밭이나 들에서 자라는 대극과(Euphorbiaceae)에 속하는 일년생 초본으로, 중약에서 전초를 반지금(斑地錦)이라 하여 止血, 利尿, 通乳汁, 健胃, 活血, 解毒의 효능으로 黃疸, 泄瀉, 赤痢, 血尿, 血崩, 外傷出血, 母乳不足, 擁腫瘡毒 등의 치료에 사용된다고 알려져 있다11-12).
	천연물 유래 약용, 기능성 식품 및 의약품 탐색에 관한 연구 결과는 어떠한가?	이러한 이유로 최근에는 다양한 유용식물을 이용하여 전 세계적으로 식물자원에서 항암, 항알러지, 항비만, 항산화 및 항염 등에 효과가 있는 기능성 물질을 다량 함유하는 자원을 선발하여 천연물 유래 약용, 기능성 식품 및 의약품 탐색에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다6-7). 그 결과, 항산화제에 의해 산화적 스트레스가 차단될 경우 염증반응이 효과적으로 억제된다는 여러 연구결과들이 보고되고 있으며, 이로 인해 활성산소를 방어하는 항산화물질은 질병 치료의 가능성 때문에 주목 받고 있다8-10).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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