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문제 정의
- 예비 실험에서 복분자 완숙과와 미숙과 물 추출물에 의한 복분자의 콜레스테롤 억제효과를 알아본 결과 완숙과 물 추출물보다 미숙과 물 추출물에서 보다 높은 콜레스테롤 억제효과를 확인하였다(data not shown). 따라서, 본 연구에서는 미숙과 물 추출물을 이용하여 in vivo에서 지질대사와 관련 조절유전자 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.
- 본 연구는 복분자 미숙과 물 추출물이 in vivo에서 지질대사 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 살펴보고, 기능성 식품으로서의 가능성을 알아보기 위하여 수행되었다. 실험동물은 C57BL/6J mouse를 사용하였으며, 12주 동안 고지질 식이를 급이하면서, 복분자 미숙과 물 추출물을 경구 투여하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg 과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이를 급여한 후에 간 조직의 병리조직학적 검사를 위하여 통상적 병리 제작 후 hematoxylin & eosin 염색을 실시한 후 병리조직학 검사로 NASH score를 실시하였다(Fig. 4).
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이로 급여한 후 간조직 내에서 콜레스테롤 관련 유전자를 조사하였다. 콜레스테롤 합성은 많은 연구들에 의하면 최종산물에 의한 피드백으로 조절된다고 알려져 있으며, 이의 조절에 가장 중요한 인자로 LDL receptor와 HMG-CoA reductase가 있다.
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이로 급여한 후 실험동물의 체중증가량, 음수섭취량, 식이섭취량 및 식이효율은 Table 3과 같다. 증가량은 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 유의적인 증가를 보였으며, 고지질대조군에 비해 미숙과 첨가군과 양성대조군에서 체중이 유의적으로 감소하였다.
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이를 급여한 후에 간조직에서 산화적스트레스인 지질과산화물의 변화를 측정하였다.
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이를 급여한 후에 지방 조직의 병리학적 형태를 관찰하였다.
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이를 급여한 후에 혈장에서 LDL 산화 관련 유전자인 CD36의 변화를 관찰하였다.
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 저농도(62.5 mg/kg), 중농도(125 mg/kg), 고농도(250 mg/kg)로 12주간 실험 식이를 급여한 후에 혈장 지질 농도에 미치는 영향은 Table 2와 같다. 먼저 혈장 중의 중성지방은 콜레스테롤로 전환하는 비율이 높으며, 특히 중성지방은 콜레스테롤의 합성을 촉진시켜 혈중 콜레스테롤을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
- 5. Histopathologic findings of epididymal (A), retroperitoneal (B) and peri-renal (C) fat by the UBR-W treatment in HFD-fed mice for 12 weeks (n=10). H&E stain, ×100.
- 0 Instrument (Roche, Mannheim, Germany)를 사용하였고, 표준대조군(Internal house keeping gene)으로 β-actin을 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분동안 pre-running 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 10초, 72℃에서 10초, 60℃에서 60초의 간격으로 50회 반복하여 증폭하였다. 각각의 primer의 염기서열은 Table 1과 같다.
- RNA 농도(1 OD=40 µg/mL)는 spectrophotometer (DUR 730, Beckman, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 260 nm에서 측정하였다.
- Real-time PCR 수행은 Light Cycler 2.0 Instrument (Roche, Mannheim, Germany)를 사용하였고, 표준대조군(Internal house keeping gene)으로 β-actin을 사용하였다.
- 간의 총 지질은 간 조직을 Folch 법으로 추출한 후 정량하였으며, 추출한 간 지질을 시료로 하여 간의 총 콜레스테롤(Biovision Cholesterol Quantitation kit, Bio-Vision Inc, Militas, CA, USA)과 중성지방(Triglyceride Fluorometric Assay kit, Cayman, Ann Arbor, MI, USA) 양을 측정용 kit를 사용하여 측정하였다.
- 간조직 내 지방질의 축적을 확인하기 위해서 간을 적출하여 무게를 측정한 후 0.9% 생리식염수로 세척하여 물기를 제거한 다음 neutral buffered formalin (NBF)에 넣어 조직을 고정하였다. 적출하여 paraffin block을 제작하고 박절하여 4 µm의 두께로 절편을 만들고 슬라이드 제작한 후 일반적인 hematoxylin & eosin (H&E)염색을 실시하고 NASA score를 측정하였다.
- 간조직의 지질과산화물 함량은 thiobarbituric acid (TBA)와 반응하여 생성되는 thiobarbituric acid reacting substances (TBARS) 양을 측정하였다. 간조직 지질과산화물 함량은 Ohkawa의 방법(15)에 의해 반응시킨 혼합물에서 TBA 반응물질이 존재하는 n-butanol 분획층을 취한 다음, flurescence spectrophotometer (DU700, Beckman, Somerset, NJ, USA)를 사용하여, excitation 560 nm, emission 585 nm에서 흡광도를 산출하였다.
- 05% cholic acid)를 Purina 5001사료(Feedlab, Guri, Korea)에 첨가하였다. 고지질이 함유된 고형사료와 필터 및 자외선 살균기로 여과 살균된 정제수를 자유로이 섭취하도록 하였다. 매일 새로운 식이를 공급하였고, 체중은 일주일에 한 번 측정하였다.
- 예비실험으로 14마리씩 미숙과 물 추출물 저, 중, 고농도를 투여하고, 12주 째 혈액을 채취하여, 혈중 중성지방, 총-콜레스테롤, HDL 및 LDL 등을 측정하였다. 그런 다음 각 실험군마다 평균체중이 약 20-25 g이 되도록 각 군당 10마리씩 4개 군으로 나누어 stainless steel bottomed cage에 5마리씩 분리 사육하였다. 실험동물 사육실의 온도는 22±2℃, 상대습도는 50±5%로 유지하였으며 명암은 12시간 주기로 조절하였다.
- 한편, 혈관질환의 주요 병인으로 알려진 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤의 혈중농도는 미숙과 물 추출물에 의해 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다. 따라서, 복분자 미숙과 물 추출물은 LDL-콜레스테롤의 흡수, 합성, 대사 조절을 통해 동맥경화를 억제할 수 있음을 예시하며, 본 실험에서는 미숙과 물 추출물 250 mg/kg 농도로 실험을 진행하였다.
- 고지질이 함유된 고형사료와 필터 및 자외선 살균기로 여과 살균된 정제수를 자유로이 섭취하도록 하였다. 매일 새로운 식이를 공급하였고, 체중은 일주일에 한 번 측정하였다. 식이 섭취량은 매일 일정한 시각에 측정하였으며, 식이섭취효율을 실험 전 기간 동안의 체중증가량을 같은 기간 동안에 섭취한 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다.
- 복분자 미숙과는 6월에 고창군에서 채집하여 사용하였다. 미숙과에 10배 용량의 물을 첨가한 후 2시간 동안 농축 추출기(Cosmo 660, Kyungseo machine, Incheon, Korea)를 이용하여 2회 가열 추출하였다. 추출물은 여과하여 농축한 후 동결건조(PVTED10R, Ilsinbiobase, Dounducheon, Korea)하여 사용하였다.
- 본 동물실험에서 실험군의 분류는 그룹 1: 정상대조군(normal chow diet: CTL), 그룹 2: 고지질대조군(high-fat diet: HFD), 그룹 3: 미숙과 첨가군(high-fat diet+UBR-W 250 mg/kg), 그룹 4: 양성대조군(high-fat diet+simvastatin 10 mg/kg: P)군으로 나뉘며, 각 10마리씩 나누어 12주간 경구투여를 하였다. 실험에 사용한 simvastatin은 statin계의 기본약물로 간에서 콜레스테롤의 생성을 조절하며, HMG-CoA reductase inhibitor로 알려져 있는, 동맥경화 치료제로 시판중에 있는 약이다(11-14).
- 분리한 혈장에서 ox-LDL uptake 유전자인 CD36 (CD36 mouse ELISA kit, Abcam Inc, Cambridge, MA, USA)은 elisa Kit를 통해 확인하였다.
- 매일 새로운 식이를 공급하였고, 체중은 일주일에 한 번 측정하였다. 식이 섭취량은 매일 일정한 시각에 측정하였으며, 식이섭취효율을 실험 전 기간 동안의 체중증가량을 같은 기간 동안에 섭취한 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다.
- 실험동물 사육실의 온도는 22±2℃, 상대습도는 50±5%로 유지하였으며 명암은 12시간 주기로 조절하였다.
- 본 연구는 복분자 미숙과 물 추출물이 in vivo에서 지질대사 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 살펴보고, 기능성 식품으로서의 가능성을 알아보기 위하여 수행되었다. 실험동물은 C57BL/6J mouse를 사용하였으며, 12주 동안 고지질 식이를 급이하면서, 복분자 미숙과 물 추출물을 경구 투여하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 고지질대조군과 비교하였을 때, 복분자 미숙과 첨가군에서 체중증가량, 식이효율이 모두 감소되었고, 혈중 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤의 농도를 유의성 있게 감소시켰을 뿐만 아니라간 조직에서 총콜레스테롤의 함량이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
- 실험동물은 5주령된 C57BL/6J종 수컷 마우스를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)로부터 구입하여 1주일간 일반사료로 적응시켰다. 예비실험으로 14마리씩 미숙과 물 추출물 저, 중, 고농도를 투여하고, 12주 째 혈액을 채취하여, 혈중 중성지방, 총-콜레스테롤, HDL 및 LDL 등을 측정하였다. 그런 다음 각 실험군마다 평균체중이 약 20-25 g이 되도록 각 군당 10마리씩 4개 군으로 나누어 stainless steel bottomed cage에 5마리씩 분리 사육하였다.
- 고콜레스테롤 햄스터에 복분자 음료를 투여하면 혈중지질, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤을 낮추는 효과(17)가 있으며, 고지질사료와 함께 복분자 미숙과 추출물을 섭취하였더니, 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤이 감소하였다는 보고(18)와 유사하게, 본 연구에서도 미숙과 첨가군에서 혈액 내 콜레스테롤 함량이 감소하는 효과를 보였다. 위의 결과를 토대로 동맥경화지수(atherogenic index of plasma, AIP)를 산출하였다. 동맥경화지수는 TG/5+LDL을 HDL-콜레스테롤로 나눈 값이다(AIP=((TG/5)+LDL)/HDL).
- 특히 고농도 미숙과 첨가군에서 가장 큰 동맥경화지수 억제 효과를 나타내었다. 이상의 연구결과를 통하여, 미숙과 물 추출물을 농도별로 투여하였을 때, 고용량에서 고지질식이에 의한 동맥경화 억제가 가장 유의성 있게 억제되었음을 바탕으로 본 실험에서는 미숙과 고용량을 가지고 실험을 진행하였다.
- 적출하여 paraffin block을 제작하고 박절하여 4 µm의 두께로 절편을 만들고 슬라이드 제작한 후 일반적인 hematoxylin & eosin (H&E)염색을 실시하고 NASA score를 측정하였다.
- 채취한 지방조직의 무게를 조사하기 위해 부고환지방(epididymal fat), 복막후지방(retroperitoneal fat), 신장주위지방(peri-renal fat)을 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거한 후 지방조직의 중량을 측정한 후, 병리조직학적 검사를 위하여 적출된 조직의 일부를 10% 중성 포르말린에 고정하고, 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 µm 두께로 절편하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색 후 광학현미경으로 100배의 배율에서 지방세포 크기를 비교하였다.
- 미숙과에 10배 용량의 물을 첨가한 후 2시간 동안 농축 추출기(Cosmo 660, Kyungseo machine, Incheon, Korea)를 이용하여 2회 가열 추출하였다. 추출물은 여과하여 농축한 후 동결건조(PVTED10R, Ilsinbiobase, Dounducheon, Korea)하여 사용하였다.
- 희생전 12시간 절식시킨 후 diethyl ether로 마취시켜 개복한 즉시 복대정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액은 해파린 튜브에 받아, 3,000 rpm에서 15분간 원심하여 상층액을 분리하는 방법으로 혈장(plasma)을 분리하여 분석하였다. 채취한 간조직의 일부는 10% 중성 포르말린에 고정하여 병리조직 제작과정을 거쳐 H&E stain 후, 지방조직(신장주위 지방, 부신지방 및 복막하 지방)의 세포크기 및 간조직의 지질 침착 정도를 확인하였고, 나머지 조직은 –70℃에 냉동 보관하였다가 분석에 사용하였다.
- 혈청 내 중성지방(Asan Pharmaceutical, Korea), 총 콜레스테롤(Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea), HDL-콜레스테롤(Asan Pharmaceutical)의 각각의 농도를 각각의 elisa kit를 이용하여 분석하였고, LDL-콜레스테롤의 농도는 혈액 자동분석기를 이용하여 분석하였다.
- 희생전 12시간 절식시킨 후 diethyl ether로 마취시켜 개복한 즉시 복대정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액은 해파린 튜브에 받아, 3,000 rpm에서 15분간 원심하여 상층액을 분리하는 방법으로 혈장(plasma)을 분리하여 분석하였다.
대상 데이터
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이로 급여한 후 간조직의 지질 함량에 미치는 영향은 Table 4와 같다. 간조직 중 총 지질함량은 고지질대조군에서 정상대조군에 비해 37% 유의적으로 높았다.
- 복분자 미숙과는 6월에 고창군에서 채집하여 사용하였다. 미숙과에 10배 용량의 물을 첨가한 후 2시간 동안 농축 추출기(Cosmo 660, Kyungseo machine, Incheon, Korea)를 이용하여 2회 가열 추출하였다.
- 실험동물은 5주령된 C57BL/6J종 수컷 마우스를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)로부터 구입하여 1주일간 일반사료로 적응시켰다. 예비실험으로 14마리씩 미숙과 물 추출물 저, 중, 고농도를 투여하고, 12주 째 혈액을 채취하여, 혈중 중성지방, 총-콜레스테롤, HDL 및 LDL 등을 측정하였다.
- 채취한 간조직의 일부는 10% 중성 포르말린에 고정하여 병리조직 제작과정을 거쳐 H&E stain 후, 지방조직(신장주위 지방, 부신지방 및 복막하 지방)의 세포크기 및 간조직의 지질 침착 정도를 확인하였고, 나머지 조직은 –70℃에 냉동 보관하였다가 분석에 사용하였다.
데이터처리
- a,bDifferent superscripts in the same column indicate significant differences between groups at p<0.05 by Duncan’s multiple comparison test.
- a,bDifferent superscripts indicate significant differences between groups at p<0.05 by Duncan’s multiple comparison test.
- a-cDifferent superscripts in the same column indicate significant differences between groups at p<0.05 by Duncan’s multiple comparison test.
- a-cDifferent superscripts indicate significant differences between groups at p<0.05 by Duncan’s multiple comparison test.
- 모든 분석 자료는 평균±표준오차로 나타내었으며 실험결과는 SPSS (SPSS Inc., version 12.0, Chicago, IL, USA)를 이용하여 p<0.05 수준에서 통계처리 하였고, Duncan’s multiple range test로 검증하였다.
이론/모형
- 간조직의 지질과산화물 함량은 thiobarbituric acid (TBA)와 반응하여 생성되는 thiobarbituric acid reacting substances (TBARS) 양을 측정하였다. 간조직 지질과산화물 함량은 Ohkawa의 방법(15)에 의해 반응시킨 혼합물에서 TBA 반응물질이 존재하는 n-butanol 분획층을 취한 다음, flurescence spectrophotometer (DU700, Beckman, Somerset, NJ, USA)를 사용하여, excitation 560 nm, emission 585 nm에서 흡광도를 산출하였다.
성능/효과
- LDL 콜레스테롤을 정상 대조군과 비교하였을 때, 고지질대조군에서 4.7배로 유의적으로 증가하였고, 미숙과 첨가군(저농도36.1%L, 중농도-57.6%, 고농도-61.7%)에서 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였으며, 특히 미숙과 고농도 투여군에서 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었다. 이 결과는 LDL-콜레스테롤의 양을 Friedewald에 의해 제창된 계산법을 이용하여 계산한 결과와 유의성을 보였다.
- 4). NASH score는 비알콜성지방간염을 말하며 알코올성 간질환에서 보이는 병리학적인 특징을 채점해 그래프로 나타내 본 결과 정상대조군에 비해서 고 지질대조군이 29.3배 비알콜성 지방간염의 점수가 높았으나, 고지방 사료 급이 후 미숙과 첨가군, 양성대조군은 각각 47.8, 63.7%로 고지질대조군에 비교하여 점수가 유의적으로 낮게 나타났다. 외형적인 간의 형태학적인 변화를 관찰한 결과, 육안으로 보았을 때 정상대조군은 초콜렛 색을 띄었으며, 고지질대조군에서는 간 색깔이 황색으로 변하고 간이 종창된 것을 확인할 수 있었다.
- 또한, 간조직의 지질산화수준(TBARS)을 유의적으로 감소시켰으며, ox-LDL관련 유전자인 CD36을 억제함으로써, 동맥경화를 예방할 것으로 기대한다. 간의 형태학적 변화를 관찰해본 결과, 고지질대조군에 비하여 지방형성이 현저히 줄어들었음을 확인하였다. 결과적으로 복분자 미숙과 물 추출물이 콜레스테롤의 생합성과 배출 및 산화적 스트레스를 조절하여 고지질 및 동맥경화 질환 예방에 긍정적인 효과를 미치는 것으로 사료된다.
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이로 급여한 후 간조직의 지질 함량에 미치는 영향은 Table 4와 같다. 간조직 중 총 지질함량은 고지질대조군에서 정상대조군에 비해 37% 유의적으로 높았다. 그러나 고지방식이를 먹인 그룹들 중에서 양성대조군이 고지질대조군에 비해 26.
- 간조직에서 미숙과 물 추출물이 LDL관련 유전자에 미치는 영향을 알아본 결과(Fig. 1), 고지질대조군과 비교하였을 때, HMGCoA reductase와 LDL receptor의 mRNA발현이 각각 1.3배, 1.5배 유의성 있게 증가했고, 이에 관여하는 SREBP2의 발현 역시 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 식물유래 성분들이 일으키는 혈중지질함량 감소효과가 지방축적을 억제하고, LDL receptor을 증가한다고 보고와 일치하였으며(28), 간암 세포주에서 미숙과 물 추출물 100 µg/mL을 24, 48, 72시간별로 투여한 결과, 시간 의존적으로 LDL receptor, SREBP2 및 HMG-CoA reductase 유전자 발현의 증가에 기인한다는 보고(10)와 일치함을 확인하였다.
- 일반적으로 고지방식이는 정상식이와의 비교 시 혈장과 간조직에서 콜레스테롤의 양을 증가시킨다고 알려져 있으며(19), 콜레스테롤은 인체의 여러 조직에서 만들어지나 주로 간에서 생성된다. 간조직의 총콜레스테롤 함량을 확인해본 결과, 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 90.9% 유의성 있게 증가되었음을 확인하였고, 고지질대조군과 비교하였을 때, 미숙과 첨가군, 양성대조군 각각 17.6, 40% 유의적인 감소를 나타내었다. 간조직의 콜레스테롤 함량은 혈장에서 나타난 결과와 같은 양상으로 나타났으며, 중성지방의 함량은 고지질대조군과 비교하였을 때, 양성대조군에서 31% 유의적인 감소를 확인하였고, 미숙과 첨가군에서 감소되는 경향을 보였으나, 유의적인 차이는 확인되지 않았다.
- 6, 40% 유의적인 감소를 나타내었다. 간조직의 콜레스테롤 함량은 혈장에서 나타난 결과와 같은 양상으로 나타났으며, 중성지방의 함량은 고지질대조군과 비교하였을 때, 양성대조군에서 31% 유의적인 감소를 확인하였고, 미숙과 첨가군에서 감소되는 경향을 보였으나, 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 최근 고지혈증 모델에서 삼칠근이 혈장 지질 농도를 저하시키고, 간세포 내 콜레스테롤 합성을 억제(20,21)하여 동맥경화를 예방하고, 특히 복분자에 많이 함유되어 있는 폴리페놀성 성분인 ellagic acid는 산화된 LDL의 세포내 유입으로 인한 콜레스테롤을 세포 밖으로 배출시켜, 세포내 콜레스테롤의 양을 조절하며(22), 복분자가 함유하고 있는 또 다른 성분인 caffeic acid는 대사성질환 당뇨모델에서 혈중 내 glucose의 함량을 저하시킬 뿐만 아니라, 지질대사에도 효과가 있는 것으로 보고되었다(23).
- 간의 형태학적 변화를 관찰해본 결과, 고지질대조군에 비하여 지방형성이 현저히 줄어들었음을 확인하였다. 결과적으로 복분자 미숙과 물 추출물이 콜레스테롤의 생합성과 배출 및 산화적 스트레스를 조절하여 고지질 및 동맥경화 질환 예방에 긍정적인 효과를 미치는 것으로 사료된다.
- Choi 등(10)은 대식세포에서 복분자 미숙과 물 추출물이 CD36, SR-A 수용체를 억제시킴으로 인해 세포 내의 ox-LDL의 흡수를 차단시키고, 세포 안에서는 macrophage에 있는 PPAR-를 억제시킴으로 인해 LDL 산화가 억제되었다고 보고하였다. 결과적으로, 동물실험에서도 미숙과 물 추출물은 CD36을 억제시킴으로써 LDL산화를 억제하고, 동맥경화를 완화시킬 수 있다고 사료된다.
- 8%로 유의하게 지방세포의 크기가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 고지방 사료 급이 후 미숙과 첨가군 및 양성대조군에서 세포크기가 감소됨을 확인 하였다. 마지막으로, 신장주위지방의 지방세포 크기 변화는 (Fig.
- 1배로 유의하게 지방세포의 크기가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 고지방 사료 급이와 미숙과 첨가군, 양성대조군은 각각 44.3, 41.2%로 고지질대조군과 비교하여 유의하게 지방세포 크기의 감소를 관찰할 수 있었다.
- 3% 유의성 있게 CD36의 발현이 증가함을 확인하였다. 고지방식이를 섭취한 군들에서 미숙과 첨가군, 양성대조군은 각각 53.1, 44.6% 유의성 있게 억제됨을 확인하였다. Choi 등(10)은 대식세포에서 복분자 미숙과 물 추출물이 CD36, SR-A 수용체를 억제시킴으로 인해 세포 내의 ox-LDL의 흡수를 차단시키고, 세포 안에서는 macrophage에 있는 PPAR-를 억제시킴으로 인해 LDL 산화가 억제되었다고 보고하였다.
- 실험동물은 C57BL/6J mouse를 사용하였으며, 12주 동안 고지질 식이를 급이하면서, 복분자 미숙과 물 추출물을 경구 투여하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 고지질대조군과 비교하였을 때, 복분자 미숙과 첨가군에서 체중증가량, 식이효율이 모두 감소되었고, 혈중 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤의 농도를 유의성 있게 감소시켰을 뿐만 아니라간 조직에서 총콜레스테롤의 함량이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 콜레스테롤 합성의 가장 중요한 기작인 LDL receptor와 SREBP2의 활성을 증가시킴으로써, 세포 안으로의 LDL 흡수를 촉진하였고, HMG-CoA reductase의 유전자 발현이 증가되면서 체내 콜레스테롤을 조절하며, ABCA1의 활성화로 인해, 콜레스테롤의 배출을 증가시키는 결과를 도출하였다.
- 고지방식이는 지방을 체내에 축적시켜 비만을 유도하는 연구에 많이 사용되고 있고(35), 본 연구에서도 사용되었다. 고지질대조군에서는 정상대조군에 비해 복막후지방, 부고환지방 및 신장주위지방의 무게가 증가하였고, 체중증가를 동반하는 비만이 유도되었으며, 미숙과 첨가군과 양성대조군은 고지질대조군에 비해 지방무게는 유의적으로 감소 효과를 보여 항비만 효과를 보였고, 결과적으로 항고지혈증 효과를 동반한다고 해석할 수 있다. 고지방식이에 의하여 비만이 유도되면서 지방세포들의 수와 크기는 현저하게 증가한다(36,37).
- 간조직 중 총 지질함량은 고지질대조군에서 정상대조군에 비해 37% 유의적으로 높았다. 그러나 고지방식이를 먹인 그룹들 중에서 양성대조군이 고지질대조군에 비해 26.4% 유의적인 감소를 보였다. 일반적으로 고지방식이는 정상식이와의 비교 시 혈장과 간조직에서 콜레스테롤의 양을 증가시킨다고 알려져 있으며(19), 콜레스테롤은 인체의 여러 조직에서 만들어지나 주로 간에서 생성된다.
- 3%)에 의해 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었다. 그리고 혈장 중 HDL-콜레스테롤은 고지질대조군에서 정상대조군에 비해 18.9% 증가함을 보였고, 미숙과 첨가군(저농도-5.6%, 중농도-2.3%, 고농도-11.9%)에서도 증가함을 보였으나, 통계학적인 유의성은 확인되지 않았다.
- 또한, 혈장 중 총콜레스테롤의 함량은 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 89% 유의성 있게 증가됨을 확인하였고, 복분자 미숙과 첨가군(저농도-2.7%, 중농도-12.4%, 고농도-21.3%)에 의해 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었다. 그리고 혈장 중 HDL-콜레스테롤은 고지질대조군에서 정상대조군에 비해 18.
- 6%로 유의하게 지방세포의 크기가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 미숙과 첨가군, 양성대조군은 각각 32.6, 24.2%로 고지질식이군에 비교하여 유의하게 지방세포 크기의 감소를 관찰할 수 있었다. 복막후지방의 지방세포 크기 변화는 Fig.
- 실험군들을 광학현미경으로 간조직의 형태를 확인한 결과에서도 고지질대조군에서는 간세포 내 크고 작은 공포모양의 지방구가 침착되어 간 손상과 지방간 소견이 관찰되었다. 미숙과 첨가군에서는 정상대조군과 비교하였을 때, 간 손상의 정도가 현저히 감소되었으며, 양성대조군에서는 간세포 내 크고 작은 공포 모양의 지방구가 현저히 줄어들었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 미숙과 물 추출물이 간조직에서 지방축적을 억제 시키는 효과가 있다고 보여진다.
- Lee 등(9)의 연구에 의하면 위장관 세포주에 미숙과 추출물을 100 µg/mL 처리한 결과, ABCA1의 발현이 농도 의존적으로 증가됨을 보고하였다. 본 연구에서 미숙과 물 추출물이 ABCA1 유전자 발현을 2.9배 유의성 있게 증가시키는 것으로 나타나 혈중 콜레스테롤을 배출시키고, 혈중에서 free ApoA-1에 콜레스테롤을 전달하는 기전에 중요한 역할을 하리라고 생각된다.
- 본 연구에서 미숙과 물 추출물이 CD36을 억제하는지 확인해본 결과(Fig. 3) 정상 대조군에 비해 고지질대조군에서 50.3% 유의성 있게 CD36의 발현이 증가함을 확인하였다. 고지방식이를 섭취한 군들에서 미숙과 첨가군, 양성대조군은 각각 53.
- 최근 고지혈증 모델에서 삼칠근이 혈장 지질 농도를 저하시키고, 간세포 내 콜레스테롤 합성을 억제(20,21)하여 동맥경화를 예방하고, 특히 복분자에 많이 함유되어 있는 폴리페놀성 성분인 ellagic acid는 산화된 LDL의 세포내 유입으로 인한 콜레스테롤을 세포 밖으로 배출시켜, 세포내 콜레스테롤의 양을 조절하며(22), 복분자가 함유하고 있는 또 다른 성분인 caffeic acid는 대사성질환 당뇨모델에서 혈중 내 glucose의 함량을 저하시킬 뿐만 아니라, 지질대사에도 효과가 있는 것으로 보고되었다(23). 본 연구에서 미숙과 첨가군이 고지질대조군과 비교하였을 때, 간조직 내 총지질, 총콜레스테롤 값이 현저히 감소되고, 콜레스테롤 축적을 억제하는 효과를 가져온 이유는, 미숙과 물 추출물에 함유되어 있는 폴리페놀성 성분들이 간조직 내 지질 함량 개선효과를 나타내었음을 추정해 볼 수 있다.
- 또한, 복분자 미숙과 물 추출물이 인간 간암세포주(HepG2)와 위장관세포주(Caco-2)에서 콜레스테롤 억제효과 및 그와 관련된 HMG-CoA reductase 활성 억제효과를 확인하였다(9,10). 예비 실험에서 복분자 완숙과와 미숙과 물 추출물에 의한 복분자의 콜레스테롤 억제효과를 알아본 결과 완숙과 물 추출물보다 미숙과 물 추출물에서 보다 높은 콜레스테롤 억제효과를 확인하였다(data not shown). 따라서, 본 연구에서는 미숙과 물 추출물을 이용하여 in vivo에서 지질대사와 관련 조절유전자 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.
- 7%로 고지질대조군에 비교하여 점수가 유의적으로 낮게 나타났다. 외형적인 간의 형태학적인 변화를 관찰한 결과, 육안으로 보았을 때 정상대조군은 초콜렛 색을 띄었으며, 고지질대조군에서는 간 색깔이 황색으로 변하고 간이 종창된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 고지방 식이와 함께 미숙과 첨가군, 양성대조군 그룹의 동물 들의 간은 정상대조군과 달리 황갈색이었으며, 종창의 정도도 적었다.
- 증가량은 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 유의적인 증가를 보였으며, 고지질대조군에 비해 미숙과 첨가군과 양성대조군에서 체중이 유의적으로 감소하였다. 음수 섭취량 및 식이섭취량에서는 모든 군에서 유의적인 변화를 보이지 않았지만, 식이효율은 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 유의적인 증가를 보였으며, 고지질대조군에 비해 미숙과 첨가군이 33% 감소하여 항비만 효과를 보였다.
- 7%)에서 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였으며, 특히 미숙과 고농도 투여군에서 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었다. 이 결과는 LDL-콜레스테롤의 양을 Friedewald에 의해 제창된 계산법을 이용하여 계산한 결과와 유의성을 보였다. 고콜레스테롤 햄스터에 복분자 음료를 투여하면 혈중지질, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤을 낮추는 효과(17)가 있으며, 고지질사료와 함께 복분자 미숙과 추출물을 섭취하였더니, 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤이 감소하였다는 보고(18)와 유사하게, 본 연구에서도 미숙과 첨가군에서 혈액 내 콜레스테롤 함량이 감소하는 효과를 보였다.
- Yoon 등(31)은 복분자에 함유되어 있는 폴리페놀 화합물이 지질과산화 활성을 억제한다고 보고하였고, Kwon 등(7)은 생체막 구성 지방산의 일종이며, 다양한 식품에 포함되어 세포 손상을 유도하고(32), 영양소 파괴 및 변질을 유발(33) 시키는 지질과산화물의 일종인 linoleic acid의 함량을 보고자 복분자를 다양한 방법으로 추출한 결과, 추출방법에 따라 지질과산화물의 억제 활성에 차이가 나타남을 확인하였다. 이는 복분자에 함유되어 있는 폴리페놀 성분이 자유라디칼(free radical)에 의한 산화적인 손상을 억제함으로써, 산화적 스트레스로 인한 부산물인 지질과산화 방지에 효과가 있음을 연구를 통해 확인하였다. 더 구체적이고 작용기전적인 측면의 많은 연구를 추구할 필요가 있다고 사료된다.
- 미숙과 첨가군에서는 정상대조군과 비교하였을 때, 간 손상의 정도가 현저히 감소되었으며, 양성대조군에서는 간세포 내 크고 작은 공포 모양의 지방구가 현저히 줄어들었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 미숙과 물 추출물이 간조직에서 지방축적을 억제 시키는 효과가 있다고 보여진다.
- 이상의 연구결과를 종합해 보면 혈중에서 중성지방의 양은 각군에서 유의적인 변화는 없었고, HDL-콜레스테롤의 혈중 변화에는 영향을 주지 못했다. 한편, 혈관질환의 주요 병인으로 알려진 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤의 혈중농도는 미숙과 물 추출물에 의해 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다.
- 5C)와 같다. 정상대조군과 비교하였을 때, 고지질대조군의 부고환 주위 지방세포의 평균 크기는 1.1배로 유의하게 지방세포의 크기가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 고지방 사료 급이와 미숙과 첨가군, 양성대조군은 각각 44.
- 5B와 같다. 정상대조군에 비해 고지질대조군의 부고환 주위 지방세포의 평균 크기는 75.8%로 유의하게 지방세포의 크기가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 고지방 사료 급이 후 미숙과 첨가군 및 양성대조군에서 세포크기가 감소됨을 확인 하였다.
- 2)와 같다. 정상대조군에 비해 고지질대조군이 1.7배 유의성 있게 지질과산화 물이 증가함을 확인하였다. 고지방 식이를 섭취한 군들에서 미숙과 첨가군은 고지질대조군과 비교했을 때 52.
- 5A)와 같다. 정상대조군의 부고환 주위 지방세포에 비해, 고지질대조군의 부고환 주위 지방세포의 평균 크기는 49.6%로 유의하게 지방세포의 크기가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 미숙과 첨가군, 양성대조군은 각각 32.
- 중년 비만여성을 대상으로 복분자 분말을 단기투여 한 결과, 체중감소 및 혈중지질이 감소하는 변화를 보였으며(38), 3T3-L1 세포에 복분자를 투여하였더니, 지방세포분화 및 지방축적을 억제하고, energy sensor인 AMPK의 활성을 증가시킨다고 보고하였다(39). 즉, 미숙과 물 추출물의 섭취로 비만에 의한 체중 증가 및 고지혈증 등의 병적상태가 완화되어 결과적으로 항고지혈증 효과가 있다고 판단되고, 미숙과 물 추출물은 항고지혈증 예방에 도움이 될 것으로 사료된다.
- C57BL/6J 5주령 마우스에 복분자 미숙과 물 추출물 250 mg/kg과 양성대조군인 simvastatin (10 mg/kg)을 12주간 실험 식이로 급여한 후 실험동물의 체중증가량, 음수섭취량, 식이섭취량 및 식이효율은 Table 3과 같다. 증가량은 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 유의적인 증가를 보였으며, 고지질대조군에 비해 미숙과 첨가군과 양성대조군에서 체중이 유의적으로 감소하였다. 음수 섭취량 및 식이섭취량에서는 모든 군에서 유의적인 변화를 보이지 않았지만, 식이효율은 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 유의적인 증가를 보였으며, 고지질대조군에 비해 미숙과 첨가군이 33% 감소하여 항비만 효과를 보였다.
- 고지질대조군과 비교하였을 때, 복분자 미숙과 첨가군에서 체중증가량, 식이효율이 모두 감소되었고, 혈중 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤의 농도를 유의성 있게 감소시켰을 뿐만 아니라간 조직에서 총콜레스테롤의 함량이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 콜레스테롤 합성의 가장 중요한 기작인 LDL receptor와 SREBP2의 활성을 증가시킴으로써, 세포 안으로의 LDL 흡수를 촉진하였고, HMG-CoA reductase의 유전자 발현이 증가되면서 체내 콜레스테롤을 조절하며, ABCA1의 활성화로 인해, 콜레스테롤의 배출을 증가시키는 결과를 도출하였다. 또한, 간조직의 지질산화수준(TBARS)을 유의적으로 감소시켰으며, ox-LDL관련 유전자인 CD36을 억제함으로써, 동맥경화를 예방할 것으로 기대한다.
- 9%)에서 농도 의존적으로 억제효과를 보였다. 특히 고농도 미숙과 첨가군에서 가장 큰 동맥경화지수 억제 효과를 나타내었다. 이상의 연구결과를 통하여, 미숙과 물 추출물을 농도별로 투여하였을 때, 고용량에서 고지질식이에 의한 동맥경화 억제가 가장 유의성 있게 억제되었음을 바탕으로 본 실험에서는 미숙과 고용량을 가지고 실험을 진행하였다.
- 이상의 연구결과를 종합해 보면 혈중에서 중성지방의 양은 각군에서 유의적인 변화는 없었고, HDL-콜레스테롤의 혈중 변화에는 영향을 주지 못했다. 한편, 혈관질환의 주요 병인으로 알려진 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤의 혈중농도는 미숙과 물 추출물에 의해 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다. 따라서, 복분자 미숙과 물 추출물은 LDL-콜레스테롤의 흡수, 합성, 대사 조절을 통해 동맥경화를 억제할 수 있음을 예시하며, 본 실험에서는 미숙과 물 추출물 250 mg/kg 농도로 실험을 진행하였다.
- 먼저 혈장 중의 중성지방은 콜레스테롤로 전환하는 비율이 높으며, 특히 중성지방은 콜레스테롤의 합성을 촉진시켜 혈중 콜레스테롤을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 혈중 중성지방의 농도는 정상대조군에 비해 고지질대조군에서 6.9% 증가함을 보였으며, 이 같은 증가는 미숙과 첨가군(저농도-2.9%, 중농도-9.9%, 고농도-12.9%)에 의해 감소함을 확인하였다.
후속연구
- 이는 복분자에 함유되어 있는 폴리페놀 성분이 자유라디칼(free radical)에 의한 산화적인 손상을 억제함으로써, 산화적 스트레스로 인한 부산물인 지질과산화 방지에 효과가 있음을 연구를 통해 확인하였다. 더 구체적이고 작용기전적인 측면의 많은 연구를 추구할 필요가 있다고 사료된다.
- 콜레스테롤 합성의 가장 중요한 기작인 LDL receptor와 SREBP2의 활성을 증가시킴으로써, 세포 안으로의 LDL 흡수를 촉진하였고, HMG-CoA reductase의 유전자 발현이 증가되면서 체내 콜레스테롤을 조절하며, ABCA1의 활성화로 인해, 콜레스테롤의 배출을 증가시키는 결과를 도출하였다. 또한, 간조직의 지질산화수준(TBARS)을 유의적으로 감소시켰으며, ox-LDL관련 유전자인 CD36을 억제함으로써, 동맥경화를 예방할 것으로 기대한다. 간의 형태학적 변화를 관찰해본 결과, 고지질대조군에 비하여 지방형성이 현저히 줄어들었음을 확인하였다.
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