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문제 정의
- 또한 본 연구에서는 마황 ethyl-acetate 추출물의 작용 경로를 확인하기 위해 유전자 발현을 분석하는데 있어 유용한 분자생물학적 기법으로 인정받고 있는 microarray 실험도 함께 수행하였다20,21).
- 본 연구는 예비 실험을 통해 생쥐에 고지방 식이를 제공함으로써 유발된 고지혈증에 마황 분획들을 투여하여 다양한 활성을 확인한 바 있으며 ethyl-acetate 분획(EEAF)이 혈청 중 지질 개선에 어떠한 과정을 거쳐 작용하는지 확인하기 위해 수행되었다.
- 위에서와 같은 내용으로 수행된 본 연구를 통해 마황 ethyl-acetate의 항 고지혈증을 효과와 관련된 경로를 확인하였으며 이를 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 예비 연구를 통해 마황 추출물의 활성도를 조사한 후 그 중 chloroform, ethyl-acetate, hexane의 순으로 활성도가 높음을 확인하였다. 이에 저자는 앞서 보고된 hexane과 chloroform에 이어 ethyl-acetate가 고지방식이로 유발된 고지혈증 생쥐의 혈청 중 지질 함량과 식욕 및 간 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.
가설 설정
- a) Typical analysis of cholesterol in lard = 0.95 mg/gram.
제안 방법
- 4 주간의 고지혈증 유발 기간이 끝나고, 시료의 투여가 시작되는 날 전자 저울을 이용하여 기준 체중을 측정하였으며, 이후 7일 간격으로 체중을 측정하였다. 2 주간의 시료 투여 기간 동안 주 1 회 사료 섭취량 (g) 및 음수량 (㎖)을 측정하였다. 측정 단위는 24 시간으로 전일 오후 4 시에 고형 사료와 음용수를 공급한 후, 다음 날 오후 4 시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 사료 섭취량 및 음수량으로 계산하였다.
- 2 주간의 약물 투여가 끝난 후, 생쥐의 복부 대동맥에서 혈액을 채취하였다. 얻어진 혈액을 5,000×g로 20 분간 원심 분리하여 상청액을 취하여 혈중 cholesterol 및 triglyceride 함량을 측정하였다.
- 4 주간의 고지혈증 유발 기간이 끝나고, 시료의 투여가 시작되는 날 전자 저울을 이용하여 기준 체중을 측정하였으며, 이후 7일 간격으로 체중을 측정하였다. 2 주간의 시료 투여 기간 동안 주 1 회 사료 섭취량 (g) 및 음수량 (㎖)을 측정하였다.
- 전 RNA를 agarose gel 상에서 전기영동한 후 28S/18S RNA의 비율을 측정하여 정도 관리하였다. 45K oligo-chip을 이용하여 실험을 수행하였으며, 탐침 준비와 혼성화 반응은 3DNA array detection system을 이용하여 수행하였다. 형광 표지된 cDNA 제작 시 20 ㎍의 RNA를 사용하였으며, array를 씻어낸 후 ScanArray scanner(Perkin-Elmer, Boston, MA)로 scan하였다.
- 고정된 조직은 paraffin 포매 과정을 거쳐서 조직 절편을 완성하였다. 5 ㎛ 두께로 절제된 조직을 슬라이드 글라스 위에 올리고 haematoxylin/eosin 기법으로 염색하고, 광학 현미경(Carl zeiss Co. Germany)을 이용하여 관찰하였다.
- 6 주간의 실험이 끝나고 생쥐를 희생시킨 후 간 조직을 적출하였는데, 간 조직 대엽의 첨부를 절제하여 인산 완충액에 헹군 후, 4% paraformaldehyde에 1일간 고정하였다. 고정된 조직은 paraffin 포매 과정을 거쳐서 조직 절편을 완성하였다.
- Effects of EEAF on Changes in Body Weights in Hyperlipidemic Mice. Body weights were measured on day which EEAF was firstly administered (day 0) and every 7 days. NOR, naive mice (n=8); CON, hyperlipidemic mice (n=8); EEAF, EEAF administered mice (n=8).
- 실험 5 주째부터 NOR군은 계속 일반 식이를 공급하면서, 1 차 증류수를 1 일 1 회 2 주간 경구 투여 하였고, 고지혈증 대조군인 CON군은 고지방 식이를 사료로 공급하면서 1 차 증류수를 1 일 1 회 2 주간 경구 투여하였다. Ethyl-acetate 분획 추출물 투여군인 EEAF군은 고지방 식이를 계속 공급하면서 EEAF를 2 ㎎/㎏ body weight/day 농도로 1 일 1 회 2 주간 경구 투여하였다. 실험 식이는 두열바이오텍(대전, 한국)에 주문제작하여 사용하였으며, 조성은 Table 1과 같다.
- 고지혈증 유발을 위하여 4 주간 30 마리의 고지방식이군에는 고지방 식이를 공급하였으며, 8 마리의 정상 식이군(Normal, 이하 NOR군)에는 일반 사료를 공급하였다. 실험 5주째의 체중을 기준으로 대조군(Control, 이하 CON군) 및 ethyl-acetate 분획 추출물(Ephedra Herba ethyl-acetate fraction, 이하 EEAF) 투여군(이하 EEAF군)을 각각 8 마리 씩 선별하여 실험에 사용하였다.
- 마황 ethyl-acetate 분획(EEAF)이 고지혈증 생쥐에서 혈청 중 지질 함량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 고지방 식이를 투여하여 고지혈증을 유발하고, 2주간 EEAF을 투여한 다음 혈청 중 지질 함량을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험 5 주째부터 NOR군은 계속 일반 식이를 공급하면서, 1 차 증류수를 1 일 1 회 2 주간 경구 투여 하였고, 고지혈증 대조군인 CON군은 고지방 식이를 사료로 공급하면서 1 차 증류수를 1 일 1 회 2 주간 경구 투여하였다. Ethyl-acetate 분획 추출물 투여군인 EEAF군은 고지방 식이를 계속 공급하면서 EEAF를 2 ㎎/㎏ body weight/day 농도로 1 일 1 회 2 주간 경구 투여하였다.
- 얻어진 혈액을 5,000×g로 20 분간 원심 분리하여 상청액을 취하여 혈중 cholesterol 및 triglyceride 함량을 측정하였다.
- 유전자 발현 비율은 CLUSTER를 이용하여 순차적 clustering 한 후 TREEVIEW(M.B. Eisen, http://rabam.lbl.gov)를 이용하여 시각화하였다.
- 이미지 파일에서 IMAGENE 4.0(Bio-discovery, Marina del Rey, CA)를 사용하여 1 차 데이터를 얻은 후 Lowess method를 사용하여 표준화하였고, 모든 chip 상의 spot에서, 각 채널의 형광 강도가 배경의 형광 강도 보다 1.4 배 더 큰 경우에 한해 제대로 측정된 것으로 판단하여 선별하였다. 시료에서 제대로 측정되지 않은 것은 제외시켰다.
- (USA)에서 제시한 방법에 따라 이루어졌다. 전 RNA를 agarose gel 상에서 전기영동한 후 28S/18S RNA의 비율을 측정하여 정도 관리하였다. 45K oligo-chip을 이용하여 실험을 수행하였으며, 탐침 준비와 혼성화 반응은 3DNA array detection system을 이용하여 수행하였다.
- 2 주간의 시료 투여 기간 동안 주 1 회 사료 섭취량 (g) 및 음수량 (㎖)을 측정하였다. 측정 단위는 24 시간으로 전일 오후 4 시에 고형 사료와 음용수를 공급한 후, 다음 날 오후 4 시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여 그 차이를 하루 동안의 사료 섭취량 및 음수량으로 계산하였다.
- 얻어진 혈액을 5,000×g로 20 분간 원심 분리하여 상청액을 취하여 혈중 cholesterol 및 triglyceride 함량을 측정하였다. 혈청 중 total cholesterol, HDL-cholesterol 및 triglyceride, glucose, AST, ALT의 함량 각각의 측정용 kit(FUJI, 일본)을 사용하였다.
- 45K oligo-chip을 이용하여 실험을 수행하였으며, 탐침 준비와 혼성화 반응은 3DNA array detection system을 이용하여 수행하였다. 형광 표지된 cDNA 제작 시 20 ㎍의 RNA를 사용하였으며, array를 씻어낸 후 ScanArray scanner(Perkin-Elmer, Boston, MA)로 scan하였다. 정상 RNA를 reference로 사용하여 DNA chip상의 대다수 cDNA spots(85% 이상)이 검출됨을 확인하였다.
대상 데이터
- NOR군에 비해 CON군에서 발현의 변화가 관찰된 유전자를 대상으로 유전자 ontology 분석을 수행하였으며 이 중 유의한 변화가 큰 20개의 항목을 선별하였다(Table 4). Sterol metabolic process, cholesterol metabolic process, fatty acid metabolic process 등 지질 대사와 관련 있는 항목이 상위에 랭크되어 있으므로 고지방 식이가 이러한 종류들의 유전자 발현에 변화를 유도함을 알 수 있다.
- 고지혈증 유발을 위하여 6주령 정도로 체중 약 22 g 내외의 수컷 ICR 마우스(샘타코, 한국)를 사용하였다. 실험에 사용된 동물은 항온 및 항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경(실내 온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12 시간 dark/light)에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 약재 마황(Ephedra Herba)은 화림제약(부산, 한국)에서 구입하였으며, 관능 검사를 통해 초마황(Ephedra sinica Stapf.)에서 기원한 정품 마황인 것을 확인한 후 정선하여 사용하였다.
- 고지혈증 유발을 위하여 4 주간 30 마리의 고지방식이군에는 고지방 식이를 공급하였으며, 8 마리의 정상 식이군(Normal, 이하 NOR군)에는 일반 사료를 공급하였다. 실험 5주째의 체중을 기준으로 대조군(Control, 이하 CON군) 및 ethyl-acetate 분획 추출물(Ephedra Herba ethyl-acetate fraction, 이하 EEAF) 투여군(이하 EEAF군)을 각각 8 마리 씩 선별하여 실험에 사용하였다.
- Ethyl-acetate 분획 추출물 투여군인 EEAF군은 고지방 식이를 계속 공급하면서 EEAF를 2 ㎎/㎏ body weight/day 농도로 1 일 1 회 2 주간 경구 투여하였다. 실험 식이는 두열바이오텍(대전, 한국)에 주문제작하여 사용하였으며, 조성은 Table 1과 같다.
- 실험에 사용된 동물은 항온 및 항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경(실내 온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12 시간 dark/light)에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 one way-ANOVA test를 시행하였고 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였으며, 사후 검정은 Tukey를 이용하였다.
이론/모형
- 실험에 사용된 동물은 항온 및 항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경(실내 온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12 시간 dark/light)에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다. 동물을 재료로 한 실험 과정은 동의대학교 한의학연구소 중앙공동실험실에 의해 제시된 원칙을 따랐으며, 동물보호법(2014년 3월 24일 일부 개정) 제23조에 명시된 동물 실험의 원칙을 성실히 준수하여 수행되었다.
- 유전자 발현 결과는 유사도가 높은 유전자 군끼리 서로 뭉치도록 하는 순차적 clustering 기법을 이용하였다. 붉은 색은 발현이 증가된 유전자를, 녹색은 발현이 감소된 유전자를 나타내며, 그 색의 강도는 발현 비율과 비례함을 나타낸다(Fig.
성능/효과
- 1. EEAF는 생쥐의 체중 증감에 영향을 미치지 못하였다.
- 2. EEAF는 고지혈증 유발에 의하여 상승된 혈청 중 total cholesterol 함량을 유의하게 감소시켰다.
- 3. EEAF는 혈청 중 AST 및 ALT 함량과 간 조직 지방의 분포에 영향을 미치지 않았다.
- 4 주간의 고지방 식이 기간 이후 2주간의 약물 투여가 진행되었던 실험 기간 동안 혈청 중 total cholesterol 함량은 변화가 나타났음에도 불구하고 체중 변화에는 유의한 차이가 없었는데 이는 고지방 식이에 의해 체중의 변화 없이도 혈중 total cholesterol의 변화가 유도되는 결과를 보였다(Fig. 2, 3A). 이후 실험 기간을 연장하여 결과를 관찰한다면 조금 더 명확한 체중의 변화가 나타날 수도 있을 것으로 추정된다.
- 4. EEAF는 고지혈증에 의해 상승된 혈청 중 glucose 함량을 유의하게 감소시켰다.
- 5. EEAF는 고지혈증 유발에 의해 발현이 변화된 간 조직 유전자의 변화를 약 49% 정도 억제하였다.
- 6 주간의 실험이 끝난 후, 간 조직을 적출하여 지방 분포를 관찰한 결과 각 실험군 간에 흰색 방울 모양의 지방 축적 현상인 간지방증이 관찰되지는 않았다(Fig. 4).
- 의 연구가 있는데 여기에선 각각 hexane 분획과 chloroform 분획을 이용하였으며 본 연구의 결과와 비교를 해보면, total cholesterol과 glucose는 세 용매 분획에서 모두 유의한 감소를 보였고, triglyceride는 hexane 분획과 chloroform 분획에서 유의한 감소를 보였다. AST 수치는 chloroform 분획에서 유의한 증가를 보인 반면, hexane 분획과 ethyl-acetate 분획에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 고지혈증 유발에 의해 발현이 변화된 간 조직 유전자의 변화 억제율은 본 연구에서는 49%이고 chloroform 분획에서는 47%로 나타났다.
- EEAF 투여에 의해 발현이 조절된 유전자 항목과 pathway를 확인해 보았는데 regulation of lipid metabolic process에 관여하는 항목이 선별되었으며, 주요 pathway로는 fatty acid metabolism이 관여하는 pathway가 선별되었다(Table 6, 7). 따라서 EEAF가 혈청 중 cholesterol 수치를 낮추는 데는 fatty acid metabolism pathway에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는데 기인한 것으로 추정된다.
- 2). EEAF군에서 시료 섭취 1 주까지는 대조군과 거의 유사한 체중 증가율을 보였으나 2 주째에는 감소하는 경향을 보였다. 실험 동물이 2 주간의 실험 기간 동안 섭취한 사료의 양에는 각 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았으며(Table 2), 본 연구 결과에 나타내지는 않았지만 음수량에도 변화는 없었다.
- EEAF를 2 주간 투여한 후 생쥐의 혈액에서 분리된 혈청 중 triglyceride 함량 변화를 관찰한 결과 각 실험군에서 64.6±7.6 ㎎/㎗, 82.6±14.4 ㎎/㎗, 77.8±12.7 ㎎/㎗로 나타나 각 군 사이에 유의한 차이가 없었다(Fig. 3C).
- HDL-cholesterol 함량 변화를 관찰한 결과 각 실험군에서 48.0±10.3 ㎎/㎗, 64.8±16.8 ㎎/㎗, 68.4±7.1 ㎎/㎗의 수치를 보여 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다(Fig. 3B).
- 고지방 식이를 4 주 동안 섭취한 고지혈증 유발 기간이 끝난 후, 2 주간 EEAF 시료를 투여하면서 체중의 변화를 관찰한 결과, CON군에서 경미한 체중 증가의 경향이 관찰되기는 하였으나 각 실험군 간의 통계적 유의성은 보이지 않았다(Fig. 2). EEAF군에서 시료 섭취 1 주까지는 대조군과 거의 유사한 체중 증가율을 보였으나 2 주째에는 감소하는 경향을 보였다.
- AST 수치는 chloroform 분획에서 유의한 증가를 보인 반면, hexane 분획과 ethyl-acetate 분획에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 고지혈증 유발에 의해 발현이 변화된 간 조직 유전자의 변화 억제율은 본 연구에서는 49%이고 chloroform 분획에서는 47%로 나타났다. 김18)의 연구는 주로 지질 대사의 변화와 항산화 효과와의 연관성에 대한 결과를 위주로 보고하였으며, 정19)의 연구는 유전자 발현의 변화도 함께 관찰한 것으로, 정19)의 연구가 본 실험과 유사한 방법을 사용하였는데, chloroform 분획의 경우 주로 steroid 생합성의 변화로 인한 지질 대사의 불균형을 직접적으로 조절하는 것이 아니라 DNA의 복제와 오류의 수정, RNA 분해 등과 같은 기본적 기능을 하는 유전자를 조절함으로써 고지혈증을 억제하는데 간접적으로 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
- 따라서 고지방 식이로 인해 발현이 증가 또는 감소된 유전자는 901개였으며 EEAF 투여로 인해 정상 상태를 유지한 유전자는 438개였으므로 전체적으로 약 49%의 유전자 발현 조절의 작용을 보였음을 알 수 있다.
- 위와 같이 발현의 변화를 보인 유전자를 추출하여 갯수를 계측한 결과 NOR군에 비해 CON군에서 발현이 증가된 유전자의 개수는 417개였으며 이 중 EEAF 투여로 인해 정상 상태의 발현을 유지한 유전자의 개수는 140개였으므로 약 34%의 유전자의 발현 증가가 조절되었음을 알 수 있다(Table 3). 또한 NOR군에 비해 CON군에서 발현이 감소된 유전자의 개수는 484개였으며 이 중 EEAF 투여로 인해 정상 상태의 발현을 유지한 유전자의 개수는 298개로 약 62%의 유전자의 발현 감소가 조절되었다.
- 본 연구에서는 예비 연구를 통해 마황 추출물의 활성도를 조사한 후 그 중 chloroform, ethyl-acetate, hexane의 순으로 활성도가 높음을 확인하였다. 이에 저자는 앞서 보고된 hexane과 chloroform에 이어 ethyl-acetate가 고지방식이로 유발된 고지혈증 생쥐의 혈청 중 지질 함량과 식욕 및 간 독성에 미치는 영향을 살펴보았다.
- 본 연구의 결과에서 6 주간의 고지방 사료 섭취 및 EEAF 투여는 실험 동물의 간 조직의 지방 조직에 영향을 미치지 못하였는데(Fig. 4), 이는 역시 고지방 식이의 기간이 비교적 짧은데 기인한 것으로 보인다.
- 실험 기간 동안 생쥐가 섭취한 사료와 음용수의 양이 연구결과에 영향을 미칠 수 있으므로 본 연구에서는 2 주간의 실험 기간 동안 사료 섭취량과 음수량을 관찰한 바 각 군 사이에 유의한 차이는 없었으며(Table 2), 이러한 결과는 EEAF가 식욕에는 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
- 실험 동물의 혈액으로부터 분리된 혈청 중 AST 함량 변화를 관찰한 결과 각 실험군에서 34.4±5.7 U/L, 37.2±6.8 U/L, 38.6±6.7 U/L로 나타나 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 5A).
- 실험 동물의 혈청 중 total cholesterol 함량 변화를 관찰한 결과 CON군에서 157.0±12.6 ㎎/㎗로 나타나 88.0±16.5 ㎎/㎗를 보인 NOR군에 비해 유의한 (P<0.05) 증가를 보였고, EEAF군에서는 134.6±7.4 ㎎/㎗로 나타나 CON군에 비하여 유의한 (P<0.05) 감소를 보였다(Fig. 3A).
- EEAF군에서 시료 섭취 1 주까지는 대조군과 거의 유사한 체중 증가율을 보였으나 2 주째에는 감소하는 경향을 보였다. 실험 동물이 2 주간의 실험 기간 동안 섭취한 사료의 양에는 각 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았으며(Table 2), 본 연구 결과에 나타내지는 않았지만 음수량에도 변화는 없었다.
- 위와 같이 발현의 변화를 보인 유전자를 추출하여 갯수를 계측한 결과 NOR군에 비해 CON군에서 발현이 증가된 유전자의 개수는 417개였으며 이 중 EEAF 투여로 인해 정상 상태의 발현을 유지한 유전자의 개수는 140개였으므로 약 34%의 유전자의 발현 증가가 조절되었음을 알 수 있다(Table 3). 또한 NOR군에 비해 CON군에서 발현이 감소된 유전자의 개수는 484개였으며 이 중 EEAF 투여로 인해 정상 상태의 발현을 유지한 유전자의 개수는 298개로 약 62%의 유전자의 발현 감소가 조절되었다.
- 유전자의 발현 변화와 ontology 분석을 통해 변화가 많은 상위 유전자들을 기능별 및 경로별로 분석한 결과 지질 대사에 관여하는 유전자들의 변화가 많이 관찰되었고, EEAF 투여는 이러한 유전자들의 변화를 효과적으로 조절하는 것으로 나타났으며(Table 3-7), 이러한 결과는 마황 chloroform 분획의 경우 지질 대사와는 직접적인 연관성 없이 혈중 지질 변화를 개선하는 것으로 보고한 정19)의 연구와는 다른 결과를 보이는 것으로 본 연구와 구별되는 중요한 특징이라 생각된다.
- 이상의 연구결과를 종합하면, 마황의 ethyl-acetate 분획인 EEAF는 고지혈증에서의 total cholesterol 및 혈당을 조절함으로써 고지혈증과 관련된 지표들을 개선하였으며, 이러한 과정에 지질 대사에 관여하는 유전자의 발현 조절이 있었음을 확인하였다.
- 형광 표지된 cDNA 제작 시 20 ㎍의 RNA를 사용하였으며, array를 씻어낸 후 ScanArray scanner(Perkin-Elmer, Boston, MA)로 scan하였다. 정상 RNA를 reference로 사용하여 DNA chip상의 대다수 cDNA spots(85% 이상)이 검출됨을 확인하였다.
- 한편 본 연구와 가장 연관성이 많은 마황 분획물을 이용한 연구로는 김18)과 정19)의 연구가 있는데 여기에선 각각 hexane 분획과 chloroform 분획을 이용하였으며 본 연구의 결과와 비교를 해보면, total cholesterol과 glucose는 세 용매 분획에서 모두 유의한 감소를 보였고, triglyceride는 hexane 분획과 chloroform 분획에서 유의한 감소를 보였다. AST 수치는 chloroform 분획에서 유의한 증가를 보인 반면, hexane 분획과 ethyl-acetate 분획에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다.
후속연구
- 의 연구결과가 있는데, 그 내용을 살펴보면 太陰調胃湯과 麻黃을 연구 재료로 하여 비만 사료로 유발한 흰쥐의 비만을 관찰하였고 그 결과 太陰調胃湯과 麻黃 추출액이 실험 동물의 체중을 유의하게 감소시켰으며 두 약물간의 효능 차이는 없는 것으로 나타났고, 두 약물 모두 혈중의 triglyceride를 유의하게 감소시켰으나 total cholesterol 함량에는 영향을 미치지 못한 것으로 보고되었다. 또한 DNA chip을 사용하여 일부 유전자 발현의 변화를 보는 등 비교적 다양한 연구를 수행한 바 있는데, 처방 및 단일 약재 조 추출물의 수준에서 연구를 진행하였으므로 향후 약물 개발과는 거리가 있는 연구라 생각된다.
- 이러한 결과를 통해 마황의 ethyl-acetate 분획인 EEAF는 향후 고지혈증 뿐만 아니라 다양한 대사성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 2, 3A). 이후 실험 기간을 연장하여 결과를 관찰한다면 조금 더 명확한 체중의 변화가 나타날 수도 있을 것으로 추정된다.
- 혈청 중 glucose 함량은 대사성 질환의 발생과 진행에 주요한 작용을 하는 것으로 알려져 있는데24,25) 본 연구를 통해 EEAF 투여가 혈청 중 glucose 수치를 유의하게 감소시키는 결과를 보였으므로(Fig. 3D) 향후 EEAF를 다양한 대사성 질환에 적용하여 그 결과를 관찰할 필요가 있을 것으로 생각된다.
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