[논문]비만세포에서 연교(連翹) 추출물의 Th2 사이토카인 발현 및 신호전달 기전 억제 효과

이진화; 한재경; 김윤희

doi:10.7778/jpkm.2014.28.3.031

비만세포에서 연교(連翹) 추출물의 Th2 사이토카인 발현 및 신호전달 기전 억제 효과
The Suppressive Effect of Th2 Cytokines Expression and the Signal Transduction Mechanism in MC/9 Mast Cells by Forsythiae Fructus Extracts 원문보기

大韓韓方小兒科學會誌 = The journal of pediatrics of Korean medicine, v.28 no.3, 2014년, pp.31 - 46

이진화 (대전대학교 한의과대학 소아과학교실) , 한재경 (대전대학교 한의과대학 소아과학교실) , 김윤희 (대전대학교 한의과대학 소아과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives Forsythiae Fructus treatment has been used for inflammatory and allergic diseases in Korean Medicine. Nevertheless, the mechanism of action and the cellular targets are not understood well. The pathogenesis of allergic diseases are associated with Th2 cytokines such as IL-13, MIP-$1{\alpha}$, IL-13, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-${\alpha}$ and IL-6, which are secreted by the mast cells. This study was conducted to investigate the effects of Forsythiae Fructus extracts (FF) on Th2 cytokines expression and signal transduction in MC/9 mast cells. Methods In the study, MC/9 mast cells were stimulated with DNP-IgE for 24 hours and then treated separately with CsA $10{\mu}g/m{\ell}$ and varying doses of FF for one hour. MC/9 mast cells stimulated with DNP-IgE was the control group, a treatment with CsA was the positive control group and a treatment with varying doses FF was the experimental groups. The mRNA levels of IL-13, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-${\alpha}$, IL-6 were analyzed with Real-time PCR. The levels of IL-13, MIP-$1{\alpha}$ were measured using enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA). NFAT, AP-1 and NF-${\kappa}B$ p65 were examined by Western blot analysis. Results 1. FF were observed to suppress the mRNA expression of IL-13, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-${\alpha}$, IL-6 in comparison to DNP-IgE control group. 2. FF also has inhibited the IL-13, MIP-$1{\alpha}$ production significantly in comparison to DNP-IgE control group. 3. Western blot analysis of transduction factors involving Th2 cytokines expression has revealed a prominent decrease of the mast cell specific transduction factors including NFAT-1, NFAT-2, c-Jun, and NF-${\kappa}B$ p65 but c-Fos. Conclusions In conclusion, the anti-allergenic activities of FF may be strongly related to the regulation of transcription factors NFAT-1, NFAT-2, c-Jun, and NF-${\kappa}B$ p65 causing inhibition of Th2 cytokines in mast cells.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

또한 Th2 사이토카인 발현 억제 기전 연구를 위하여 western blot으로 NFAT-1, NFAT-2, AP-1 protein (c-Jun, c-Fos), NF-κB p65 전사인자 단백질 발현 억제를 관찰하여 유의한 결과를 얻었으므로 보고하는 바이다.
사이토카인과 mRNA는 유전자 발현의 결과물로 비만 세포내의 신호전달 체계에 의해 생성된다. 이러한 일련의 신호전달 과정에서 連翹의 작용 부위를 확인하기 위하여 western blot을 통하여 전사인자의 단백질 발현을 연구하였다.
이에 저자는 아토피 피부염의 피부 병변에서 관찰 되는 비만 세포³¹⁾에서 連翹의 항염증 작용 기전을 알아보기 위하여 생쥐 MC/9 비만 세포에서 다양한 Th2 사이토카인의 활성 억제를 확인하고, 그 기전을 연구하기 위하여 사이토카인 유전자 발현에 관여하는 신호전달 물질의 활성에 대하여 알아보았다. 표준화된 실험을 위하여 HPLC를 통해 실험에 사용된 連翹의 지표 성분을 분석하였으며, Real-Time PCR을 통해 Th2 사이토카인인 IL-13, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-6 mRNA 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하였고, ELISA를 통해 IL-13, MIP-1α의 단백질 생성 억제 효과를 분석하였다.
이들 연구를 통해 連翹의 항염증 작용이 Th2 사이토카인 억제와 연관되는 것을 알 수 있다. 이에 저자는 連翹의 항염증 기전을 보다 명확하게 밝히기 위하여 생쥐 MC/9 비만 세포에서 Th2 사이토카인의 생성 억제를 확인하고, 그 억제 기전 연구를 위하여 Th2 사이토카인의 유전자 발현에 영향을 미치는 신호전달 물질의 활성에 대하여 알아보았다.

제안 방법

(2) 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 75 ℃에서 5분 동안 변성 (denaturation) 시키고, 이에 2.5 ㎕ 10 mM dNTPs mix와 1 ㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/25 ㎕) 및 RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor (20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5 × RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다.
이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심침강하여 37 ℃ 항온 수조에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95 ℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다. (3) cDNA PCR Real time quantitative RT-PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system를 이용하여 수행하였으며, 사용된 Probe와 Oligonucleotide의 염기배열은 다음과 같다 (Table 2). Mouse GAPDH-VIC probe set; Endogenous Control (VIC®/MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems (4352339E) 유전자 발현은 Taqman PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard를 GAPDH를 사용하였으며, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다.
MC/9 비만 세포를 48-well plate에 5×105 /㎖로 1 ㎖ 씩 분주하고 무처리한 군을 정상군 (only MC/9 cell)으로, 24시간 동안 DNP-IgE 1 ㎍/㎖ 만으로 자극한 후 PBS로 수세하고 10% FBS-DMEM으로 교체한 군을 대조군 (DNP- IgE Control)으로 하였다. 3시간 후 Cyclosporin A (CsA) 10 ㎍/㎖과 FF (100, 50 ㎍/㎖)을 처리하고 1시간 후에 DNP-BSA 0.5 ㎍/㎖으로 자극한 뒤 6시간 후에 세포를 얻어 FF 처리한 것을 실험군 (DNP-IgE + FF-100, 50), CsA를 처리한 것을 양성대조군 (DNP-IgE + CsA 10)으로 하였다. 그 세포에 Trizol 시약을 1 ㎖넣고 eppendorf tube에 넣은 후 Chloroform을 100 ㎕ 넣었다.
MC/9 비만 세포주를 48-well plate에 5×105/㎖로 1㎖씩 분주하고 무처리한 군을 정상군 (only MC/9 cell) 으로, 24시간 동안 DNP-IgE 1 ㎍/㎖ 만으로 자극한 후 PBS로 수세하고 10% FBS-DMEM으로 교체한 군을 대조군 (DNP-IgE Control)으로 하였다. 3시간 후 대조군에 FF (400, 200, 100 ㎍/㎖)와 CsA 10 ㎍/㎖를 처리하고 1시간 후에 DNP-BSA 0.5 ㎍/㎖으로 자극하여 FF 처리한 것을 실험군 (DNP-IgE + FF-100, 200, 400), CsA로 처리한 것을 양성대조군 (DNP-IgE + CsA 10)으로 하였다.
) 를 사용하였다. A용매는 100% 3차 증류수에 0.1% 포름산을 첨가하고, B용매는 100% 아세토니트릴에 0.1% 포름산을 첨가하여 사용하였으며 용매계는 다음과 같다 (Table 1). 지표성분으로 Arctigenin을 표준시료와 FF에서의성분분석을 하였다.
FF이 비만세포에서 IL-13, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNFα, IL-6 mRNA 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, MC/9 비만 세포에 DNP-IgE로 자극한 뒤 CsA 와 다양한 농도의 FF을 처리한 후 6시간 뒤 Real-Time PCR로 mRNA 유전자 발현을 분석하였다.
FF이 비만세포에서 IL-13, MIP-1α 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, MC/9 비만 세포에 DNP-IgE로 자극한 뒤 CsA와 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도의 FF을 처리한 후 6시간 후 ELISA로 IL-13와 MIP-1α 생성량을측정하였다.
FF이 비만세포에서 NFAT-1과 NFAT-2, AP-1 protein (c-Jun, c-Fos), NF-κB p65 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, MC/9 비만 세포에 DNP-IgE로 자극한 뒤 1시간 동안 CsA와 100 ㎍/㎖ 농도의 FF을 처리한후 6시간 후 western blot으로 NFAT-1과 NFAT-2, AP-1 protein (c-Jun, c-Fos), NF-κB p65의 단백질 발현을 측정하였다.
MC/9 비만 세포를 100 × 20 ㎜ plate에 4 × 105 /㎖로 10 ㎖씩 분주하고 무처리한 군을 정상군 (only MC/9 cell)으로, 24시간 동안 DNP-IgE 1 ㎍/㎖로 자극한 후 PBS로 수세하고 10% FBS-DMEM으로 교체한 군을 대조군 (DNP- IgE Control)으로 하였다.
MC/9 비만 세포를 48-well plate에 5×105 /㎖로 1 ㎖ 씩 분주하고 무처리한 군을 정상군 (only MC/9 cell)으로, 24시간 동안 DNP-IgE 1 ㎍/㎖ 만으로 자극한 후 PBS로 수세하고 10% FBS-DMEM으로 교체한 군을 대조군 (DNP- IgE Control)으로 하였다.
MC/9 비만 세포주를 48-well plate에 5×105/㎖로 1㎖씩 분주하고 무처리한 군을 정상군 (only MC/9 cell) 으로, 24시간 동안 DNP-IgE 1 ㎍/㎖ 만으로 자극한 후 PBS로 수세하고 10% FBS-DMEM으로 교체한 군을 대조군 (DNP-IgE Control)으로 하였다.
Mouse GAPDH-VIC probe set; Endogenous Control (VIC®/MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems (4352339E) 유전자 발현은 Taqman PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard를 GAPDH를 사용하였으며, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다.
Mouse GAPDH-VIC probe set; Endogenous Control (VIC®/MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems (4352339E) 유전자 발현은 Taqman PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard를 GAPDH를 사용하였으며, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation을 2 min at 50 ℃, 10 min 94 ℃, 그리고 40 cycles 을 0.15 min at 95 ℃, 1 min at 60℃에서 수행하였으며 Target group의 RQ (relative quantitative)는 Quantitative PCR로 다음과 같이 측정하였다.
MC/9 비만 세포를 100 × 20 ㎜ plate에 4 × 105 /㎖로 10 ㎖씩 분주하고 무처리한 군을 정상군 (only MC/9 cell)으로, 24시간 동안 DNP-IgE 1 ㎍/㎖로 자극한 후 PBS로 수세하고 10% FBS-DMEM으로 교체한 군을 대조군 (DNP- IgE Control)으로 하였다. 그리고 3시간 후 CsA 10 ㎍/㎖과 FF 100 ㎍/㎖를 처리하고 1시간 후에 DNP-BSA 0.5 ㎍/㎖으로 자극한 뒤 1시간 후에 차가운 PBS로 세척한 후 scraper로 세포를 얻고 원심분리하여 상청액을 버린 후 각각 양성대조군 (DNP-IgE + CsA 10)과 실험군 (DNP -IgE + FF)으로 하였다.
Lysis buffer (RIPA buffer 98 ㎕+ protease inhibitor cocktail (100×) 1 ㎕+ PMSF (100 mM) 1 ㎕) 100 ㎕로 얼음에서 15∼20분간 배양한 후 상청액을 얻었다. 또한 nuclear extract kit를 사용하여 hypotonic buffer를 넣고 얼음에서 15분간 배양한 후 원심분리하여 상청액 (cytoplasmic fraction)을 모았으며, tube에 남아 있는 핵에 complete lysis buffer를 넣고 30초 동안 얼음에서 배양한 후 원심분리 하여 상청액 (nuclear fraction)을 얻었다. 이렇게 얻은 단백질은 BCA단백질 정량법으로 정량하였으며, 10% SDS PAGE gel을 만들어서 running buffer를 채운 뒤 20분 동안 pre-running시키고, 그 사이에 단백질을 loading buffer로 희석하고 끓는 물에 5분 동안 끓여서 단백질이 꼬인 것을 풀어주었다.
세포 독성은 EZ-Cytox assay법³²⁾을 약간 변형하여 실험에 사용하였으며 MC/9 비만 세포는 37 ℃, 5% CO2배양기에서 1 시간 배양한 후 FF (최종 농도 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖) 을 48 시간 동안 처리하였다. 배양 종료 6 시간 전에 EZ-Cytox 용액 10 ㎍씩 각 well에 가하고 실험 종료 시까지 배양하였으며 이 plate를 plate shaker에서 3.
) 및 100㎍/㎖ streptomycin이 함유된 DMEM 배지에 부유시켜 37 °C, 5% CO2, 95% 대기에서 배양하였다. 세포는 주 2-3회씩 계대 배양하였다.
또한 Membrane을 크기에 맞게 자르고 5% skim milk (TBST buffer) 로 1시간 동안 blocking 해주었 으며, Primary antibody (NFAT1, NFAT2, c-Jun, c-Fos, NF-κB p⁶⁵⁾ 로 4℃에서 하루를 반응시킨 후, 다음날 secondary antibody를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 암실에서 ECL detection 용액을 사용하여 필름에 옮기고 현상용액에 담가 현상하고 고정액에 고정시켜 건조시켰으며 결과에 대한 밴드밀도 (band densities)는 YY-1과 비교하여 Image-Rab densitometer를 사용하여 최종 측정 분석하였다.
1% 포름산을 첨가하여 사용하였으며 용매계는 다음과 같다 (Table 1). 지표성분으로 Arctigenin을 표준시료와 FF에서의성분분석을 하였다.
표준화된 실험을 위하여 HPLC를 통해 실험에 사용된 連翹의 지표 성분을 분석하였으며, Real-Time PCR을 통해 Th2 사이토카인인 IL-13, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-6 mRNA 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하였고, ELISA를 통해 IL-13, MIP-1α의 단백질 생성 억제 효과를 분석하였다.

대상 데이터

Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배양액, sulforhodamin B (SRB), 2-isopropanol, sodium dodecyl sulfate (SDS), Fetal bovine serum (FBS), Trypsin-EDTA, Antibiotics (penicillin, streptomycin)는 Gibco-BRL사 (U.S.A.) 제품을 사용하였고, Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), Diethyl pyrocarbonate (DEPC), Chloroform, Isopropanol, Ethanol, Nonidet P-40는 Sigma사 (U.S.A.) 제품을 사용하였다.
ECLhybond film은 Amersham사 (U.S.A.) 제품을 사용하였고, SYBR master mix와 Taqman master mix는 Applied Biosystems사 (U.S.A.), nuclear extract kit는 Active motif사 (U.S.A.), Mouse IL-13, MIP-1α ELISA kit는 eBioscience사 (U.S.A.) 제품을, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
Trizol은 Ambion사 (U.S.A.) 제품을, EZ-cytox kit는 Daeil Lab사 (Korea) 제품을, DEPC water는 Invitrogen사 (U.S.A.) 제품을 Deoxynucleoside triphosphate (dNTP)는 TaKaRa사 (Japan) 제품을, Moloey murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) 와 RNase inhibitor는 Promega사 (U.S.A.) 제품을 사용하였고, primary antibody (NFAT-1, NFAT-2, c-Jun, c-Fos, NF-κB p65)는 Santa-Cruz사 (U.S.A.) 제품을 사용하였다.
본 실험에 사용된 MC/9 비만 세포주 (ATCC, U.S.A.) 를 10% FBS, 10% T-stim (U.S.A.), 0.05 mM 2-mercaptoethanol and 2 mM L-glutamine (Sigma, U.S.A.) 및 100㎍/㎖ streptomycin이 함유된 DMEM 배지에 부유시켜 37 °C, 5% CO2, 95% 대기에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 기기는 열탕추출기 DWT-1800T (대웅, Korea), 감압 증류장치 BÜCHI B-480 (BÜCHI Labortechnik AG, Switzerland), 동결 건조기 FDU-540 (EYELA, Japan), CO2 배양기 (Forma scientific Co., U.S.A.), 원심분리기 (한일과학, Korea), plate shaker (Lab-Line, U.S.A.), spectrophotometer (Shimazue, Japan), Quantitative Real-Time PCR (Applied Biosystems, U.S.A.), Image-Rab densitometer (Bio-Rad, U.S.A.), Bio-freezer (Sanyo, Japan), ELISA reader (Molecular Devices, U.S.A.), HPLC Waters 2695 system (Waters Co. U.S.A.) 등을 사용하였다.
본 실험에 사용한 連翹는 대전대학교 한의과대학 부속 둔산한방병원 약제과에서 구입, 정선하여 사용하였다. 連翹 분말 (317 g) 을 ASE300 Accelerated Solvent Extractor (DIONEX Co.

데이터처리

Statistically significant value compared with control group data by independent T-test (*** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05).
각 실험군 결과값은 SPSS통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, 유의성 검사는 independent T-test 로 p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

이론/모형

) 등을 사용하였다. HPLC 는 Agilent 1200 series로서 autosampler, column oven, binary pump, DAD detector (Agilent Technologies, Germany), degasser (Agilent Technologies, Japan)를 사용하였으며, software는 Agilent사의 Chemstation software (Agilent Technologies, U.S.A.)를 사용하였다.

성능/효과

1. HPLC 분리 및 지표성분 분석連翹의 지표성분으로 알려진 Arctigenin을 連翹 추출물 내에서 확인하기 위해 Arctigenin 표준물질을 HPLC로 분석한 결과, chromatogram (Fig. 1-1)에서 Retention time을 나타내는 고유의 peak가 44.59분대에서 확인되었으며, FF의 chromatogram (Fig. 1-2)에서 Arctigenin 지표성분을 확인한 선행실험과 동시간대인 44.60분대에서 elution peak을 확인할 수 있었다. FF의 Arctigenin 성분함량은 2.
1. 連翹 추출물은 IL-13, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-6 mRNA 유전자 발현을 억제하였다.
2. 세포 독성 측정 FF의 세포독성을 측정한 결과 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖의 모든 측정 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다 (Fig. 2).
2. 連翹 추출물은 IL-13 와 MIP-1α 단백질 생성을 억제하였다.
3. 連翹 추출물은 전사인자 NFAT-1 및 NFAT-2 단백질 발현을 억제하였다.
4. 連翹 추출물은 전사인자 c-Jun 단백질 발현을 억제하였다.
5. 連翹 추출물은 전사인자 NF-κB p65 단백질 발현을 억제하였다.
IL-6 mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.314 ± 0.104이었고, 대조군은 0.984 ± 0.016로 정상군에 비하여 유전자 발현 증가가 나타났다.
MC/9 비만 세포에 24시간 동안 DNP-IgE을 자극하여 활성화 상태를 만든 후 連翹 추출물 (100, 50 ㎍/㎖) 을 처리하고 Real-time PCR로 mRNA 유전자 발현을 분석한 결과 IL-13, IL-6, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-α의 mRNA 유전자 발현이 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (Fig. 3-1,2,3).
MIP-1α 생성량은 정상군은 264.931 ± 23.73 pg/㎖이었고, 대조군은 352.631 ± 22.43 pg/㎖로 정상군에 비해 증가하였고, 양성대조군은 191.641 ± 16.78으로 대조군에 비해 억제되었다 (p<0.001).
NF-κB p65 단백질 발현은 정상군에서 DT가 1로 나타났고 (Fig. 7, NF-κB p65 band lane 1), 대조군에서 DT가 4.87로 정상군에 비하여 증가하였고 (Fig. 7, NFκB p65 band lane 2), 양성대조군의 DT는 1.21로 대조 군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.01) (Fig. 7, NF-κB p65 band lane 3).
NFAT-1의 단백질 발현은 정상군에서 NFAT-1 densities (이하 DT)가 2.1로 나타났고 (Fig. 5-1, NFAT-1 band lane 1), 대조군에서 35.40로 정상군에 비하여 증가하였으며 (Fig. 5-1, NFAT-1 band lane 2), 양성대조군의 DT는 10.10으로 대조군에 비하여 유의성 있게 억 제되었다 (p<0.01) (Fig. 5-1, NFAT-1 band lane 3).
NFAT-2의 단백질 발현은 정상군에서 DT가 1로 나타났고 (Fig. 5-2, NFAT-2 band lane 1), 대조군에서 2.8로 정상군에 비하여 증가하였으며 (Fig. 5-2, NFAT-2 band lane 2), 양성대조군의 DT는 0.31로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.01) (Fig. 5-2, NFAT-2 band lane 3).
TNF-α mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.338 ±0.077이었고, 대조군은 1.063 ± 0.063로 정상군에 비하여 유전자 발현이 증가되었다.
c-Fos의 단백질 발현은 정상군에서 DT가 1로 나타났으며 (Fig. 6-2, c-Fos band lane 1), 대조군에서 DT가 5.5로 정상군에 비하여 증가하였고 (Fig. 6-2, c-Fos band lane 2), 양성대조군의 DT는 1.6로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.05) (Fig. 6-2, c-Fos band lane 3).
4-1,2). 두 실험 결과를 통하여連翹 추출물이 Th2 사이토카인 분비를 억제하여 아토피 피부염에서 Th1과 Th2 세포 반응의 평형을 유지하여 치료효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
또한 AP-1 전사전달계의 c-Jun 단백질 발현은 連翹를 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었으나 (Fig. 6-1), c-Fos의 경우 양성대조군에서는 유의성 있게 억제 되었으나, 連翹를 처리한 실험군에서는 대조군과 거의 차이가 나지 않았다 (Fig. 6-2). c-Fos는 c-Jun과 함께 AP-1 단백질 복합체의 중요한 구성원으로서 AP-1 결합 부위를 통해 전사를 조절하여 IL-8, IL-10 등의 사이토카인 발현에 영향을 미친다⁴⁹⁾.
또한 連翹 추출물 (400, 200, 100 ㎍/㎖)을 처리하고 ELISA를 통해 IL-13, MIP-1α의단백질 발현을 측정한 결과 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (Fiq. 4-1,2).
본 실험에서 NF-κB p65 단백질 발현은 대조군에 비하여 連翹를 처리한 실험군에서 현저히 억제되었으며 양성대조군보다도 억제되었다 (Fig. 7).
본 실험에서 NFAT-1, NFAT-2 단백질 발현은 連翹를 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었으며 특히 NFAT-1의 경우 Cyclosporin A 10㎍/㎖를 처리한 양성대조군보다도 높은 억제효과를 나타냈다 (Fig. 5-1,2).
본 실험에서 사용된 連翹를 HPLC를 통해 분석한 결과 Arctigenin을 2.91% 함유하고 있음이 확인되었다 (Table 3).
실험군의 100 ㎍/㎖에서 DT는 1.45로 대조군에 비하여 NFAT-1의 단백질 발현이 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001) (Fig. 5-1, NFAT-1 band lane 4).
실험군의 100 ㎍/㎖에서의 DT는 0.64로 NF-κB p65 단백질 발현이 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.01) (Fig. 7, NF-κB p65 band lane 4).
실험군의 100 ㎍/㎖에서의 DT는 1.62로 대조군에 비하여 NFAT-2의 단백질 발현이 유의성 있게 억제되었다 (p<0.05) (Fig. 5-2, NFAT-2 band lane 4).
이상의 결과로 連翹 추출물은 IgE에 의해 활성화된 비만세포에서 발현하는 IL-13, IL-6, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-α, MIP-1α의 생성을 억제하여 아토피 염증 반응을 조절하는 것으로 예상되며, 그 중 NFAT-1, NFAT-2, c-Fos, NF-κB p65 전사인자 활성을 억제하여 염증성 사이토카인의 발현에 핵심적인 NFAT, AP-1, NF-κB의 신호전달 기전을 차단하는 것으로 볼 수 있다.

후속연구

이상의 결과로 連翹 추출물은 IgE에 의해 활성화된 비만세포에서 발현하는 IL-13, IL-6, IL-5, GM-CSF, IL-4, TNF-α, MIP-1α의 생성을 억제하여 아토피 염증 반응을 조절하는 것으로 예상되며, 그 중 NFAT-1, NFAT-2, c-Fos, NF-κB p65 전사인자 활성을 억제하여 염증성 사이토카인의 발현에 핵심적인 NFAT, AP-1, NF-κB의 신호전달 기전을 차단하는 것으로 볼 수 있다. 이로써 임상에서 連翹의 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환에 적용이 가능할 것으로 판단되며, 향후 in vivo 실험을 통하여 아토피 피부염에서의 임상적 효과를 확인하는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이로써 連翹 추출물은 c-Jun에 특이적으로 작용하여 AP-1 단백질 복합체를 형성을 억제할 것으로 예상되며 c-Fos의 억제 조절 여부는 추후 농도 의존성에 대해 추가 실험이 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아토피 피부염의 특징은 무엇인가?	아토피 피부염은 영, 유아기의 대표적인 알레르기질환으로 재발이 잦고 만성으로 경과하는 염증성 질환으로 심한 소양감과 함께 홍반, 부종, 삼출, 가피, 인설, 태선화 등을 특징으로 한다26).
	CD4+ T세포의 종류인 Th1과 Th2는 각각 어떤 반응에 관여하는가?	인체에 항원이 침입하였을 때 T세포에 의해 면역이 조절되는데 CD4+ T세포는생성하는 사이토카인의 종류에 따라 Th1과 Th2로 분류된다28). Th1 세포는 IFN-γ, IL-2 등을 특징적으로 분비하며 세균 감염에 있어서 방어적 기능을 담당하고 지연형 과민 반응에 관여하며35), Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-16 등 일련의 사이토카인을 분비하는데, 이 중 IL-4와 IL-13은 B세포에서 IgE 생성을 유도하고, IL-5는 호산구의 분비, 분화와 성숙에 관여하여 즉시형 아토피 반응에 관여한다36). IL-3, TNF-α, GM-CSF 는 두 세포 모두에서 특징적으로 분비되는 사이토카인으로 염증 반응을 일으키며 비만세포의 발달에 영향을 미치는 것으로 알려져있다37).
	連翹는 무엇인가?	連翹 (Forsythiae Fructus)는 물푸레나무과 (木犀科, Oleaceae) 속하는 개나리 (Forsythia densitolra Nakai)와의성개나리 (Forsythia viridissima Lindley)의 과실을 건조한 것으로 약성이 平하고 苦味를 가지고 있으며 淸熱과 消腫의 작용을 통해 瘡瘍腫毒과 瘰癧結核을 치료하는 聖藥으로 알려져 있으며 癰疽, 乳癰, 丹毒 등 피부과 염증 질환에도 응용된다1-6). 현대에서 아토피피부염의 내치 또는 외치 요법에 다용되고 있으며7,8) 접촉성 피부염에도 사용되고 있다9).

참고문헌 (51)

Herbology Association of Korea's Colleges of Oriental Medicine. Textbook of herbology, 1st ed. Seoul:Younglimsa. 1991:199.
Ju YS. Ungok herbology. Jeonju: Woosuk Press. 2013:494-7.
Wangang. Benchobeiyao. Beijing: Zhongguoyiyaokechichuban. 2012:29.
Quanchuncong. Yimenzhuiyan. Wonju: Yibang medicalbooks. 2009:464.
GongtingXian. Wanbinghuichun. Seoul: Bubin Publishers. 2007:50, 82.
Huh J. Donguibogam. Seoul: Bubin Publishers. 2007:1997.
Kim MJ, Lee SY. A literature study of atopic dermatitis for children. J Korean Orient Med. 2000;14(2):169-84.
Min DL, Park EJ, Kang KH. Review of clinical and experimental studies on external application treatment for atopic dermatitis in the korean literature. J Pediatr Korean Med. 2013;27(1):36-49.

원문보기 상세보기
Kwon OS, Kim JT, Park IS, Ahn SH, Lee HP, Kim HH, Gang YH. The effect of Yunkyopaedosangamibang on allergic contact dermatitis : Based on the mitigation of skin damage and distributive change of mast cell on DNCB re - expasure region of mice. Dongguk J Institute Orient Med. 1999;8(1):77-91.
Li ZX, Wang XH, Zhao JH, Yang JF, Wang X. Investigation on antibacterial activity of forsytjia suspense vahl in vitro with Mueller-Hinton agar. Zhongguo Zhon Yoo Zhi. 2000;25(12):742-5.
Lee EB, Keum HJ. Pharmacological studies on Forsythae Fructus. Kor J Pharmacogn. 1998;19(4):262-9.
Nam JB, Lee MH, Choi HY, Sohn NW, Kang H. Effect of Forsythiae Fructus ethanol extract on inflammatory cytokine production and cellular signaling pathways in mouse macrophages. Kor J Herbology. 2012;27(1):59-64.

원문보기 상세보기
Kim SY, Park YK. Ethanol extract of Forsythiae Fructus inhibits the production of inflammatory mediators in LPS-stimulated BV-2 Microglial Cells. Kor J Herbology 2008;23(3):93-102.
Lee JM, Choi SW, Cho SH, Phee SJ. Effect of Forsythia viridissima extracts on antiosidative system and lipid peroxidation of liver in rats fed high-cholesterol die. Kor J Nutr Health. 2003;36(10):990-6.
Rim YS, Park MS, Kim KY, Kim MJ, Choi YH. Screening of antioxidant and antimicrobial activity in native plants. Korean J Medicinal Crop Sci. 2000;4(8):342-50.
Lim DK, Choi U, Shin DH. Antioxidative activity of ethanol extract from korean medicinal plants. Korean J Food Sci Techno. 2000;8(4):342-50.
Lue LF, Rydel R, Brigham EF, Yang LB, Hampel H, Murphy GM Jr, Brachova L, Yan SD, Walker DG, Shen Y, Rogers J. Inflammatory repertoire of alzheimer's disease and nondemented elderly microglia in vitro. Glia. 2001;35:72-9.

상세보기
Schinella GR, Tournier HA, Prieto JM, Modujovich D, Rios JL. Antioxidant activity of anti-inflammatory plant extracts. Life Sci. 2002;70:1023-33.

상세보기
Kim MJ, Kim JY, Jung TK, Choi SW, Yoon KS. Skin anti-aging effect of Forsythia Vridissima L. extract. Korean J Botechnol Bioeng. 2006;21(6):444-50.
Yoon JY, Han JK, Kim YH. Effect of Kami-chungsimyeunjatang on atopic dermatitis-like skin lesions induced in NC/Nga mice by mite antigen stimulation. J Korean Oriental Pediatrics. 2007;21(1):87-116.
Park SK, Han JK, Kim YH. Anti-dermatitis effects of Kamichengsimyeonjatang on GATA-3 regulation in NC/Nga mouse. J Pediatr Korean Med. 2009;23(2):29-50.
Song HJ, Han JK, Kim YH. Effects of Kakamsodokum (KKSDU) on atopic dermatitis-like skin lesions in NC/Nga mouse. J Pediatr Korean Med. 2009;23(1):23-35.
Shin DG, Kim WY, Lee JY, Kim DK. Effect of Sunbangpaedoktang on the cytokine secretory function of monocyte isolated and cultured from peripheral blood of AD patients. J Pediatr Korean Med. 2002;16(1):13-82.
Kim WY, Lee JY. Effects of Hanghaedan on the cytokine secretory function of monocytes of atopic dermatitis patients. J Pediatr Korean Med. 2007;21(2):169-84.
Park YM. Advances in the pathophysiology of atopic dermatitis. J Pediatr Allergy Respir Dis (Korea). 2006;16(3):189-96.
Ahn HS. Hongchangui pediatrics 9th edition. Seoul:Miraen. 2010:1142.
Park Y. Moisturizers in atopic dermatitis. J Skin Barrier Research (Korean). 2007;9(1):37-40.
Kim JW. Atopic dermatitis at allergic and immunological aspects. J Korean Dermatol Assoc. 2003;41(6):687-9.
Renz H, Jujo K, Bradley KL, Domenico J, Gelfand EW, Leung DY. Enhanced IL-4 production and IL-4 receptor expression in atopic dermatitis and their modulation by interferon-gamma. J Invest Dermatol. 1992;99(4):403-8.

상세보기
Valent P, Spanbloochl E, Sperr WR, Sillaber C, Zsebo KM, Agis H, Strobl H, Geissler K, Bettelheim P, Lechner K. Induction of differentiation of human mast cells from bone marrow and peripheral blood mononuclear cells by recombinant human stem cell factor/kit-ligand in long-term culture. Blood. 1992;80(9):2237-45.

상세보기
Ahn SG, Pack BD, Won JH, Sung YY, Cheon SH. Atopic dermatitis for the opening doctor. Seoul: Pacific Publisher Co. 2007:13-82.
Munetaka I, Yoko M, Kazumi S, Yosuke O, Keiyu U. A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as a chromogenic indicator for NADH as well as cell viability. Talanta. 1997;44(7):1299-305.

상세보기
Greer FR, Sicherer SH, Burks AW. Effect of early nutritional interventions on the development of atopic disease in infants and children: the role of maternal dietary restriction, breastfeeding, timing of introduction of complementary foods, and hydrolyzed formulas. Pediatrics. 2008;111:608-16.
Van der Hulst AE, Klip H, Brand PI. Risk of developing asthma in young children with atopic eczema; a systemic review. J Allegy Clin Immunol. 2007;120:565-9.

상세보기
Mosmann TR, Coffman RI. Th1 and Th2 cells; Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol. 1989;7:145-73.

상세보기
Foster PS, Martinez-Moczygemba M, Huston DP, Corry DB. Interleukins-4, -5, and -13: emerging therapeutic targets in allergic disease. Pharmacol Ther. 2002;94(3):253-624.

상세보기
Gibbs BF, Haas H, Wolff HH, Grabbe J. Early IgE-dependent release of IL-4 and IL-13 from leukocytes is restricted to basophils : a comparison with other granulocytes and mononuclear cells. Inflamm Res. 2000;49(1):9-10.

상세보기
Kim JT. Evaluation of inflammation in childhood asthma; Non-invasive measurement. J Korean Pediatr Soc. 2001;44(3):334-9.
Weber A, Knop J, Maurer M. Pattern analysis of human cutaneous mast cell populations by total body surface mapping. Br J Dermatol. 2003;148(2):224-8.

상세보기
Humbert M, Grant JA, Taborda-Barata L, Durham SR, Pfister R, Menz G. High-affinity IgE receptor(Fcepsiolon RI)-bearing cells in bronchial biopsies from atopic and nonatopic asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996;153:1931-7.

상세보기
Toru H, Pawankar R, Ra C, Yata J, Nakahata T. Human mast cells produce IL-13 by high-affinity IgE receptor cross-linking: enhanced IL-13 production by IL-4-primed human mast cells. J Allergy Clin Immunol. 1998;102(3):491-502.

상세보기
Matsubara M, Masaki S, Ohmori K, Karasawa A, Hasegawa K. Differential regulation of IL-4 expression and degranulation by anti-allergic olopatadine in rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cells. Biochem Pharmacol. 2004;67(7):1315-26.

상세보기
Kou X, Qi S, Dai W, Luo D, Yin Z. Arctigenin inhibits lipopolysaccharide -induced iNOS expression in RAW264.7 cells through suppressing JAK-STAT signal pathway. Int Immunopharmacol. 2011;11(8):1095-102.

상세보기
Jang HH. Effects of arctigenin on nitric oxide production in human umbilical vein endothelial cells. Grad School Chonnam Univ. 2010.
Lee JY, Kim CJ. Arctigenin, a phenylpropanoid dibenzylbutyrolactone lignan, inhibits type I-IV allergic inflammation and pro-inflammatory enzymes. Arch Pharm Res. 2010;33(6):947-57.

원문보기 상세보기
Park JH, Hong YJ, Moon EJ, Kim SA, Kim SY. Forsythiae Fructus and its active component, arctigenin, provide neuroprotection by inhibiting neuroinflammation. Biomol Ther (Seoul). 2011;19(4):425-30.

원문보기 상세보기
Lee DJ, Shim SS. Effect of arctigenin on tyrosinase activity and melanin production in B16 melanoma cells. J Pharm Soc Korea. 2012;56(6):395-400.
Lee IS, Nguyen Tien Dat, Cai XF, Shen GG, Kim YH. Inhibitory effects of natural products against NFAT(nuclear factor of activated T cells) transcription factor. Kor J Phamacogn. 2003;34(2):150-5.
Lewin I, Nechushtan H, Ke Q, Razin E. Regulation of AP-1 expression and activity in antigen-stimulated mast cells: the role played by protein kinase C and the possible involvement of Fos interacting protein. Blood. 1993;82(12):3745-51.

상세보기
D'Acquisto F, May MJ, Ghosh S. Inhibition of Nuclear Factor Kappa B(NF- $\kappa{B}$ ) : An emerging theme in anti-inflammatory therapies. Mol Interv. 2002;2(1):22-35.

상세보기
Park GY, Lee SH, Hwangbo B, Im JJ, Lee CT, Kim YH, Han SG, Sim YS, Yu CG. Pro-inflammatory cytokine expression through NF- $\kappa{B}$ / $I\kappa{B}$ pathway in lung epithelial cells. Tuberc Respir Dis. 2000;49(3):332-42.

원문보기 상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증