꽃노랑총채벌레 산란에 의한 포도 과피 달무리 반점: 종 특이적 분자진단법을 이용한 종동정과 반점 증상의 형태적 특징 Halo Spot Symptom Induced by Oviposition of Frankliniella occidentalis on Grape Fruits: Molecular Diagnosis by a Species-specific DNA Amplification and Microscopic Characterization of the Symptom원문보기
최근 국내 포도원에서 과실 표면에 구름모양의 흰색 얼룩이 자주 발견되고 있으나, 그 원인에 대해 명확히 알려진 바가 없어 방제대책을 세우지 못하고 있는 실정이다. 흰색의 달무리 반점은 포도 과실 표면에 부정형으로 퍼져 있으며, 그 중앙에는 총채벌레가 산란할 때 만들어진 작은 구멍의 상처가 남아 있다. 이 상처부위는 시간이 지나면서 코르크화되고 표피세포와 분리되어 딱지로 남거나 떨어져 나가게 된다. 이러한 증상은 총채벌레의 섭식이나 노린재의 흡즙에 의한 상처와는 구별된다. 산란구멍에서 발견한 총채벌레 알껍질에서 DNA를 추출하여 ITS2 부위의 염기 서열을 PCR-RFLP 방법으로 분자동정을 실시한 결과 꽃노랑총채벌레의 것으로 확인되었다. 미토콘드리아 COI 염기서열은 이러한 분자 동정 결과를 재확인하여 주었다. 본 연구결과는 포도 과피에 꽃노랑총채벌레 산란에 의해 유발되는 독특한 피해 증상에 대한 정확한 정보를 제공하며 포도원에서 이 해충에 대한 방제전략 수립에 도움이 될 것으로 여겨진다.
최근 국내 포도원에서 과실 표면에 구름모양의 흰색 얼룩이 자주 발견되고 있으나, 그 원인에 대해 명확히 알려진 바가 없어 방제대책을 세우지 못하고 있는 실정이다. 흰색의 달무리 반점은 포도 과실 표면에 부정형으로 퍼져 있으며, 그 중앙에는 총채벌레가 산란할 때 만들어진 작은 구멍의 상처가 남아 있다. 이 상처부위는 시간이 지나면서 코르크화되고 표피세포와 분리되어 딱지로 남거나 떨어져 나가게 된다. 이러한 증상은 총채벌레의 섭식이나 노린재의 흡즙에 의한 상처와는 구별된다. 산란구멍에서 발견한 총채벌레 알껍질에서 DNA를 추출하여 ITS2 부위의 염기 서열을 PCR-RFLP 방법으로 분자동정을 실시한 결과 꽃노랑총채벌레의 것으로 확인되었다. 미토콘드리아 COI 염기서열은 이러한 분자 동정 결과를 재확인하여 주었다. 본 연구결과는 포도 과피에 꽃노랑총채벌레 산란에 의해 유발되는 독특한 피해 증상에 대한 정확한 정보를 제공하며 포도원에서 이 해충에 대한 방제전략 수립에 도움이 될 것으로 여겨진다.
In grape vineyards, whitish spots in a cloud shape have been often observed on the fruit surface recently. However, the cause of the halo spot symptom was unknown, hindering countermeasures to be properly designed for the control. A small hole in the middle of the formless halo spot remained as a sc...
In grape vineyards, whitish spots in a cloud shape have been often observed on the fruit surface recently. However, the cause of the halo spot symptom was unknown, hindering countermeasures to be properly designed for the control. A small hole in the middle of the formless halo spot remained as a scar formed by oviposition of the thrips. It became later a suberized scab, which is separated from the epidermal cells on the surface either to be retained on or to be detached from it as time proceeds. Such a symptom is distinguished from the feeding damages caused by thrips or true bugs occurring on the grape fruits. With DNA extracted from the egg-shell found in the hole, molecular diagnosis by amplifying an ITS2 region with universal primers and subsequently digesting the PCR product by an restriction enzyme (RsaI) revealed that the egg was laid by Frankliniella occidentalis. In addition, a mitochondrial COI sequence confirmed that the halo spot symptom was formed by its oviposition. This study provides accurate information on the peculiar damage symptom caused by oviposition of F. occidentalis that could be useful in the control strategies for this pest in vineyards.
In grape vineyards, whitish spots in a cloud shape have been often observed on the fruit surface recently. However, the cause of the halo spot symptom was unknown, hindering countermeasures to be properly designed for the control. A small hole in the middle of the formless halo spot remained as a scar formed by oviposition of the thrips. It became later a suberized scab, which is separated from the epidermal cells on the surface either to be retained on or to be detached from it as time proceeds. Such a symptom is distinguished from the feeding damages caused by thrips or true bugs occurring on the grape fruits. With DNA extracted from the egg-shell found in the hole, molecular diagnosis by amplifying an ITS2 region with universal primers and subsequently digesting the PCR product by an restriction enzyme (RsaI) revealed that the egg was laid by Frankliniella occidentalis. In addition, a mitochondrial COI sequence confirmed that the halo spot symptom was formed by its oviposition. This study provides accurate information on the peculiar damage symptom caused by oviposition of F. occidentalis that could be useful in the control strategies for this pest in vineyards.
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문제 정의
본 연구는 최근 국내 포도원에서 나타나고 있는 포도 과실 달무리 반점 증상의 미세구조를 광학 및 전자현미경 수준에서 관찰하여 그 형태적 특징을 살펴보았다. 또한, 반점 조직에서 발견한 총채벌레 알껍질에서 유전자를 추출하여 분자진단법을 이용한 종 동정을 통해 어떤 총채벌레에 의한 산란피해인지를 확인하고자 수행하였다.
본 연구는 최근 국내 포도원에서 나타나고 있는 포도 과실 달무리 반점 증상의 미세구조를 광학 및 전자현미경 수준에서 관찰하여 그 형태적 특징을 살펴보았다. 또한, 반점 조직에서 발견한 총채벌레 알껍질에서 유전자를 추출하여 분자진단법을 이용한 종 동정을 통해 어떤 총채벌레에 의한 산란피해인지를 확인하고자 수행하였다.
제안 방법
(2002)이 이용했던 프라이머들(5’-ATTAGGAGCHCCH GAYATAGCATT-3’과 5’-CAGGCAAGATTAAAATATAA ACTTCTG-3’)을 이용하여 COI 부위의 일부를 PCR 증폭하였다.
PCR 결과산물 5 μL를 2% agarose gel (TAE buffer)에 전기영동으로 전개하여 증폭 여부를 확인한 후, 남은 PCR 결과산물을 Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다.
PCR 반응은 gDNA 1 μL가 포함된 반응액 50 μL (2 mM MgCl2 , 0.2 mM dNTP, 0.2 μM primer, 1 × PCR buffer)에 1 unit의 Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea)를 첨가한 후 다음과 같은 조건에서 실시하였다.
(2002)이 이용했던 프라이머들(5’-ATTAGGAGCHCCH GAYATAGCATT-3’과 5’-CAGGCAAGATTAAAATATAA ACTTCTG-3’)을 이용하여 COI 부위의 일부를 PCR 증폭하였다. PCR 반응조건은 위와 동일하였으며 결과산물을 바이오니어 시퀀싱 서비스(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI에 등록된 총채벌레들의 COI 염기서열과 BLAST 분석하여 유사도가 가장 높은 서열을 찾은 후, Clustal W를 이용하여 정렬한 후 비교하였다.
2 μM primer, 1 × PCR buffer)에 1 unit의 Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea)를 첨가한 후 다음과 같은 조건에서 실시하였다. Thermal cycler (TP600, TaKaRa, Japan)를 이용하여 94℃ 에서 10 분간 초기 denaturation을 실시한 이후, 94℃에서 1 분간 denaturation, 55℃에서 1 분간 annealing, 72℃에서 1 분간 extension하는 반응을 35 회 반복한 이후, 마지막으로 72℃에서 10 분간 추가 extension을 실시하였다. PCR 결과산물 5 μL를 2% agarose gel (TAE buffer)에 전기영동으로 전개하여 증폭 여부를 확인한 후, 남은 PCR 결과산물을 Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다.
2010년 7월에 경기도 안성시 공도읍의 비가림 재배방식의 포도원에서 달무리 반점 증상이 생긴 피해 과실을 채집하여 해부현미경(Stemi 2000-C, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 표면을 관찰하였다. 그 후 반점 중앙에 위치한 상처 부위를 수직으로 잘라 절편을 만들어 광학현미경(Axioskop2, Carl Zeiss, Germany)으로 표피세포와 코르크층을 관찰하였다. 또한 그 상처 부위를 주사전자현미경(S-2460N, Hitachi, Japan)으로도 관찰하여 특징을 기술하였다.
또한 꽃노랑총채벌레, 대만총채벌레, 및 볼록총채벌레를 1마리씩 준비하였다. 떼어낸 조직과 총체 벌레에서 RED Extract-N-Amp Tissue PCR Kit (#090M6175, Sigma-Aldrich)를 이용하여 genomic DNA (gDNA)를 추출하였다. Toda and Komazaki(2002)가 사용했던 프라이머들(5’-TGT GAACTGCAGGACACATGA-3’과 5’-GGTAATCTCACCTGAAC TGAGGTC-3’)을 이용하여 internal transcribed spacer 2 (ITS2) 부위의 일부를 PCR 증폭하였다.
그 후 반점 중앙에 위치한 상처 부위를 수직으로 잘라 절편을 만들어 광학현미경(Axioskop2, Carl Zeiss, Germany)으로 표피세포와 코르크층을 관찰하였다. 또한 그 상처 부위를 주사전자현미경(S-2460N, Hitachi, Japan)으로도 관찰하여 특징을 기술하였다.
PCR 반응조건은 위와 동일하였으며 결과산물을 바이오니어 시퀀싱 서비스(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI에 등록된 총채벌레들의 COI 염기서열과 BLAST 분석하여 유사도가 가장 높은 서열을 찾은 후, Clustal W를 이용하여 정렬한 후 비교하였다.
정제된 PCR 결과산물 10 μL에 제한효소 RsaI (Thermo Scientific, USA) 5 unit를 처리하고 37℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 60℃에서 20 분간 제한효소를 불활성화 시키고, 2% agarose gel (TAE buffer)에 전기영동하여 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편의 패턴을 확인하였다. 실제 총채벌레의 PCR-RFLP 패턴과 비교하기 위하여 꽃노랑총채벌레, 대만총채벌레 및 볼록총채벌레의 gDNA를 위의 방법과 동일하게 각각 추출 하여 같은 제한효소를 처리한 후, 절단된 DNA 단편의 패턴을 전기영동으로 확인하였다.
정제된 PCR 결과산물 10 μL에 제한효소 RsaI (Thermo Scientific, USA) 5 unit를 처리하고 37℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 60℃에서 20 분간 제한효소를 불활성화 시키고, 2% agarose gel (TAE buffer)에 전기영동하여 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편의 패턴을 확인하였다.
한편, 보다 정확한 분자동정을 위하여 총채벌레 동정용으로 많이 쓰이는 미토콘드리아 COI 부위의 염기서열을 PCR 증폭 하여 비교하였다. 프라이머 부위를 포함하여 485 bp 크기의 PCR 증폭산물을 얻었으며, 이를 NCBI GenBank에서 BLAST 분석을 실시한 결과 꽃노랑총채벌레의 염기서열과 100% 일치 하였다(Fig.
대상 데이터
2010년 7월에 경기도 안성시 공도읍의 비가림 재배방식의 포도원에서 달무리 반점 증상이 생긴 피해 과실을 채집하여 해부현미경(Stemi 2000-C, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 표면을 관찰하였다. 그 후 반점 중앙에 위치한 상처 부위를 수직으로 잘라 절편을 만들어 광학현미경(Axioskop2, Carl Zeiss, Germany)으로 표피세포와 코르크층을 관찰하였다.
달무리 반점 증상이 나타난 포도 과실 5개 각각에서 반점 중앙의 상처를 포함하여 직경 약 5 mm 크기의 얇은 원형으로 과실 표면을 잘라내었다. 또한 꽃노랑총채벌레, 대만총채벌레, 및 볼록총채벌레를 1마리씩 준비하였다. 떼어낸 조직과 총체 벌레에서 RED Extract-N-Amp Tissue PCR Kit (#090M6175, Sigma-Aldrich)를 이용하여 genomic DNA (gDNA)를 추출하였다.
이론/모형
Toda and Komazaki(2002)가 사용했던 프라이머들(5’-TGT GAACTGCAGGACACATGA-3’과 5’-GGTAATCTCACCTGAAC TGAGGTC-3’)을 이용하여 internal transcribed spacer 2 (ITS2) 부위의 일부를 PCR 증폭하였다.
성능/효과
(A) PCR-RFLP of eggshell in the halo spot tissues on grape fruit. (B) PCR-RFLP of the three thrips species: from left to right, Frankliniella occidentalis, Frankliniella intonsa, and Scirotothrips dorsalis. M: 1,000 bp ladder, 1: PCR product, 2: RsaI treatment.
3. Sequence alignment of partial COI sequences from the halo spot tissue, Frankliniella occidentalis (GenBank No. FN545986.1), Frankliniella intonsa (GenBank No. FN546001.1), and Scirotothrips dorsalis (GenBank No. AB277238.1). Primer sites used for PCR are underlined and consensus sequences are highlighted in gray color.
외국에서는 포도에 피해를 주는 총채벌레 중에 꽃노랑총채벌레가 가장 심각하다고 보고하고 있지만(Bettiga, 2013), 우리나라에서는 볼록총채벌레 이외의 다른 총채벌레가 포도에 피해를 주는지에 대해서는 알려진 바가 없었다(Yang, 2010). 그러나 본 연구를 통해 국내 포도원에도 꽃노랑총채벌레가 피해를 준다는 것이 처음으로 확인되었다. 이러한 사실은 우리가 최근에 전국의 주요 시설 포도원에서 실시한 총채벌레 발생예찰의 결과와 일치하는 것으로 청색 끈끈이 트랩을 이용하여 총채벌레의 발생소장을 조사한 결과 꽃노랑총채벌레가 국내 시설포도원에서 높은 밀도로 발생하는 것이 확인된 바 있다(Ahn et al.
포도 과피에 나타난 달무리 반점을 해부현미경으로 조사하면서, 중앙의 상처부위에서 총채벌레 알과 그것에서 부화하는 약충을 관찰한 바 있으나 사진으로 남기지는 못하였다. 그러나 부화 후 남은 총채벌레 알 껍질이 포함된 포도 과피 조직을 떼어내어 DNA를 추출하고, 총채벌레 분자진단용으로 개발된 프라이머를 이용하여 ITS2 부위를 PCR 증폭한 결과, 475 bp 크기의 DNA 단편을 얻을 수 있었다(Fig. 2A). 이 PCR 산물을 제한효소 RsaI으로 절단하여 DNA 단편의 패턴을 전기영동으로 확인한 결과 69, 166, 240 bp 크기의 3가지 단편을 얻었다(Fig.
그 부위를 해부현미경으로 관찰한 결과, 산란 부위가 코르크화되어 부풀어 오르며 상처가 하나의 점으로 나타났다. 그리고 코르크 화된 부위를 긁으면 떨어져 나가는 것이 확인되었고 과실 표면의 종단면을 관찰한 결과, 상처 부위는 표피에만 존재하며 과육부위에는 변화가 없는 것으로 나타났다(Fig. 1C). 광학현미경과 해부현미경 관찰(Figs.
다만, 녹색의 과피가 흰색으로 변하는 것은 엽록소의 파괴와 관계된 것으로 추정되는데, 식물 체의 엽록소가 분해되는 것은 잎의 노화나 과실의 성숙에 따라 진행되는 현상이기도 하지만, 여러 가지 생물적 또는 무생물적스트레스에 대한 식물의 방어기작에 의해 생기는 현상으로도 알려져 있다(Hörtensteiner and Kräutler, 2011). 본 연구에서 확인한 흰색 반점이 총채벌레 산란에 특이적으로 나타나는 현상 인지, 단순히 물리적인 상처에 의해 생기는 현상인지를 구별하기 위하여, 소독된 바늘을 이용하여 총채벌레 산란과 유사한 방식으로 포도 과피에 상처를 낸 결과 흰색의 반점이 관찰되지는 않았다(data not shown). 이는 총채벌레에서 유래한 물질이 흰색 반점(또는 엽록소 파괴) 현상을 유발하는데 관여한다는 것을 간접적으로 말해주는 것으로 여겨진다.
이 PCR 산물을 제한효소 RsaI으로 절단하여 DNA 단편의 패턴을 전기영동으로 확인한 결과 69, 166, 240 bp 크기의 3가지 단편을 얻었다(Fig. 2A).
2%의 낮은 유사도를 보였다. 즉, 포도 과실 표면의 달무리 반점 피해 조직에서 분리한 총채벌레의 알 껍질은 꽃노랑총채벌레의 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과로부터, 최근 국내 포도원에 발생하여 문제가 되고 있는 포도 과피의 달무리 반점 증상과 코르크반점 증상은 꽃노랑총채벌레의 산란에 의해 형성되는 것으로 여겨진다.
한편, 보다 정확한 분자동정을 위하여 총채벌레 동정용으로 많이 쓰이는 미토콘드리아 COI 부위의 염기서열을 PCR 증폭 하여 비교하였다. 프라이머 부위를 포함하여 485 bp 크기의 PCR 증폭산물을 얻었으며, 이를 NCBI GenBank에서 BLAST 분석을 실시한 결과 꽃노랑총채벌레의 염기서열과 100% 일치 하였다(Fig. 3). 반면에 대만총채벌레와는 81.
후속연구
꽃노랑총채벌레에 의한 포도 과피 달무리 반점 증상은 어린 과실을 중심으로 많이 발생하고 산란 초기에는 피해 확인이 어렵기 때문에 착과 직후부터 봉지 씌우기 작업 직전에 총채벌레가 산란하지 못하도록 철저한 방제가 필요할 것으로 보인다. 본 연구 결과를 바탕으로 앞으로 포도원에 발생하는 꽃노랑총채벌레 산란에 의한 달무리 반점 증상과 코르크 반점 피해를 조기에 진단하고, 적용 약제로 적기에 방제한다면 살충제 살포 횟수와 방제 비용을 절감함과 동시에 고품질의 포도를 생산하는데 도움이 될 것으로 전망된다.
이는 비록 꽃노랑총채벌레의 산란 피해 자체가 상품성을 크게 저하 시키지는 않는다고 하더라도(Yokoyama, 1977), 꽃노랑총채벌레의 발생이 증가하여 흡즙 등에 의한 직접적인 피해도 발생할 가능성이 있음을 암시하고 있다. 외국의 경우 꽃노랑총채벌레는 포도 과실에 대한 산란 피해 이외에도 흡즙에 의한 과실 표면의 상처와 줄기 생장 저해 등 직간접적인 피해를 주고 있기 때문에(McNally et al., 1985), 국내 포도원에 발생하는 꽃노랑총채벌레의 피해 양상에 대한 면밀한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
, 2013). 이러한 연구 방법은 식물의 피해부위에서 해충을 직접 확인하지 못할 경우, 해충에서 유래한 조직이나 흔적을 이용하여 간접적으로 확인하는데 활용가치가 높다고 하겠다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
외국과 국내의 발생하는 총채벌레의 종류는 각각 무엇인가?
총채벌레는 포도의 잎과 과실에 피해를 주는 중요한 해충으로 약충과 성충이 잎과 과실 표면을 직접적으로 섭식하거나 또는 산란을 통해 피해를 유발하고, 간접적으로는 신초와 잎의 성장을 저해하여 결국 과실의 품질 저하에 영향을 미친다(Childers, 1997). 외국의 포도원에서는 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis), 볼록총채벌레(Scirotothrips dorsalis), 포도류 가해 총채벌레류 (Drepanothrips reuteri) 등 10여 종이 발생하는 것으로 알려져 있으나(Bettiga, 2013), 우리나라 포도원에는 볼록총채벌레의 발생과 피해 외에는 알려진 바가 거의 없다(Yang, 2010).
총채벌레는 무엇에 피해를 주는 해충인가?
총채벌레는 포도의 잎과 과실에 피해를 주는 중요한 해충으로 약충과 성충이 잎과 과실 표면을 직접적으로 섭식하거나 또는 산란을 통해 피해를 유발하고, 간접적으로는 신초와 잎의 성장을 저해하여 결국 과실의 품질 저하에 영향을 미친다(Childers, 1997). 외국의 포도원에서는 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis), 볼록총채벌레(Scirotothrips dorsalis), 포도류 가해 총채벌레류 (Drepanothrips reuteri) 등 10여 종이 발생하는 것으로 알려져 있으나(Bettiga, 2013), 우리나라 포도원에는 볼록총채벌레의 발생과 피해 외에는 알려진 바가 거의 없다(Yang, 2010).
미국 포도원에서는 달무리 반점의 원인이 무엇이라고 알려져 있는가?
포도 재배 농가에서는 약해 또는 공해에 의한 증상으로 오인하는 경우가 많으며 포도 과피가 녹색일 때는 증상이 보이다가 착색되면서 반점이 사라지기 때문에 재배자들이 잘 모르고 넘어 가는 경우도 있다. 미국 포도원에서는 이러한 달무리 반점 증상이 꽃노랑총채벌레의 산란에 의해 생긴다고 알려져 있기 때문에(Jensen, 1973), 국내 포도원에 발생하는 이러한 피해증상도 꽃노랑총채벌레의 산란에 의한 것인지 확인이 필요한 실정이다.
참고문헌 (18)
Ahn, S.-J., Park, C.H., Kang, T.J., Kim, H.H., Yang, C.Y., Kim, D.-H., 2013. Occurrence of mites and thrips in protected grape vineyards in Korea. Proceedings of the Autumn Symposium of the Korean Society of Applied Entomology, p. 183.
Bettiga, L.J., 2013. Grape pest management, 3rd ed., University of California, USA.
Brunner, P.C., Fleming, C., Frey, J.E., 2002. A molecular identification key for economically important thrips species (Thysanoptera: Thripidae) using direct sequencing and a PCR-RFLP-based approach. Agric. For. Entomol. 4, 127-136.
Childers, C.C., 1997. Feeding and oviposition injuries to plants, in: Lewis, T. (Eds.), Thrips as crop pests. CABI International, Oxon, New York, pp. 505-537.
Cho, M.R., Jeon, S.-W., Kang, T.J., Kim, H.H., Ahn, S.-J., Yang, C.Y., 2013. Pests occurring on Cymbidium. Korean J. Appl. Entomol. 52, 403-408.
Hilker, M., Meiners, T., 2002. Induction of plant responses to oviposition and feeding by herbivorous arthropods: a comparison. Entomol. Exp. Appl. 104, 181-192.
Salguero-Navas, V.E., Funderburk, J.E., Olson, S.M., Beshear, R.J., 1991. Damage to tomato fruit by the western flower thrips (Thysanoptera: Thripidae). J. Entomol. Sci. 26, 436-442.
Soler, M., Serra, O., Molinas, M., Huguet, G., Fluch, S., Figueras, M., 2007. A genomic approach to suberin biosynthesis and cork differentiation. Plant Physiol. 144, 419-431.
Toda, S., Komazaki, S., 2002. Identification of thrips species (Thysanoptera: Thripidae) on Japanese fruit trees by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of the ribosomal ITS2 region. B. Entomol. Res. 92, 359-363.
Yang, C. Y., 2010. Occurrence of grape pests and their control, in: Ahn, J.G. (Eds), Manual of grape growing. Rural Development Adminstration. pp. 209-220.
Yokoyama, V.Y., 1977. Frankliniella occidentalis and scars on table grapes. Environ. Entomol. 6, 25-30.
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