LPS를 처리한 RAW 264.7 세포에서 털여뀌와 양지꽃 추출물의 NF-κB 활성화 및 Nitric Oxide 생성 저해 Persicaria orientalis and Potentilla fragarioides Extracts Inhibit NF-κB Translocation and Nitric Oxide Production in LPS-stimulated RAW 264.7 Cells원문보기
최재훈
(Herbal Crop Utilization Research Team, National Institute of Horticultural & Herbal Science (NIHHS), RDA)
,
이승은
(Herbal Crop Utilization Research Team, National Institute of Horticultural & Herbal Science (NIHHS), RDA)
,
이정훈
(Herbal Crop Research Division, National Institute of Horticultural & Herbal Science (NIHHS), RDA)
,
김금숙
(Herbal Crop Utilization Research Team, National Institute of Horticultural & Herbal Science (NIHHS), RDA)
,
노형준
(Herbal Crop Utilization Research Team, National Institute of Horticultural & Herbal Science (NIHHS), RDA)
,
김승유
(Herbal Crop Utilization Research Team, National Institute of Horticultural & Herbal Science (NIHHS), RDA)
Persicaria orientalis (L.) Spach (Po) and Potentilla fragarioides var. major Maxim (Pf) extracts were analyzed to investigate anti-inflammation through their suppressing effects on free radicals such as reactive oxygen species (ROS). In addition, with regard to Po and Pf, an analysis was conducted o...
Persicaria orientalis (L.) Spach (Po) and Potentilla fragarioides var. major Maxim (Pf) extracts were analyzed to investigate anti-inflammation through their suppressing effects on free radicals such as reactive oxygen species (ROS). In addition, with regard to Po and Pf, an analysis was conducted of their inhibitory effect on nitric oxide, which is produced in lipopolysaccharide (LPS)-treated murine macrophage RAW 264.7 cells, and their inhibitory effect on the translocation of the nucleus of nuclear factor-kappa B (NF-${\kappa}B$). The $IC_{50}$ value of ROS, which was induced by $50{\mu}M$ 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1), was found to be $23.35{\pm}1.27{\mu}g/mL$ due to the effect of the Po extract, and $8.46{\pm}1.22{\mu}g/mL$ due to the effect of the Pf extract. In addition, the $IC_{50}$ value of peroxynitrite treated with the Po extract was $2.19{\pm}0.04{\mu}g/mL$, whereas that of peroxynitrite treated with the Pf extract was $0.80{\pm}0.02{\mu}g/mL$. ROS and peroxynitrite were induced by $50{\mu}M$ 3-morpholinosydnonimine hydrochloride. There was an increase in the amount of nitric oxide in the RAW 264.7 cells treated with LPS ($1{\mu}g/mL$), whereas the level of NO was observed to significantly and dose-dependently decrease in the cells treated with Po and Pf. The amount of nitric oxide produced by the group treated with $10{\mu}g/mL$ of the Pf extract was $11.45{\pm}0.57{\mu}M$. Furthermore, the Po extracts inhibited the translocation of the nucleus of NF-${\kappa}B$ in LPS-treated RAW 264.7 cells. Therefore, it is highly possible that Po and Pf have anti-inflammatory properties.
Persicaria orientalis (L.) Spach (Po) and Potentilla fragarioides var. major Maxim (Pf) extracts were analyzed to investigate anti-inflammation through their suppressing effects on free radicals such as reactive oxygen species (ROS). In addition, with regard to Po and Pf, an analysis was conducted of their inhibitory effect on nitric oxide, which is produced in lipopolysaccharide (LPS)-treated murine macrophage RAW 264.7 cells, and their inhibitory effect on the translocation of the nucleus of nuclear factor-kappa B (NF-${\kappa}B$). The $IC_{50}$ value of ROS, which was induced by $50{\mu}M$ 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1), was found to be $23.35{\pm}1.27{\mu}g/mL$ due to the effect of the Po extract, and $8.46{\pm}1.22{\mu}g/mL$ due to the effect of the Pf extract. In addition, the $IC_{50}$ value of peroxynitrite treated with the Po extract was $2.19{\pm}0.04{\mu}g/mL$, whereas that of peroxynitrite treated with the Pf extract was $0.80{\pm}0.02{\mu}g/mL$. ROS and peroxynitrite were induced by $50{\mu}M$ 3-morpholinosydnonimine hydrochloride. There was an increase in the amount of nitric oxide in the RAW 264.7 cells treated with LPS ($1{\mu}g/mL$), whereas the level of NO was observed to significantly and dose-dependently decrease in the cells treated with Po and Pf. The amount of nitric oxide produced by the group treated with $10{\mu}g/mL$ of the Pf extract was $11.45{\pm}0.57{\mu}M$. Furthermore, the Po extracts inhibited the translocation of the nucleus of NF-${\kappa}B$ in LPS-treated RAW 264.7 cells. Therefore, it is highly possible that Po and Pf have anti-inflammatory properties.
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문제 정의
본 연구에서는, 산화 스트레스와 염증반응을 저해하는지 살펴보고자, SIN-1 50 µM이 유도하는 ROS와 peroxynitrite를 Po와 Pf 추출물이 저해하는지 살펴보고, RAW 264.7 세포에 LPS에 의해 활성화되는 NF-κB와 NO를 Po와 Pf 추출물이 저해하는지 검토해 보았다.
이번 연구는 약용식물 Po와 Pf 추출물 에 의한 ROS 저해능과 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 유도된 염증반응의 저해 활성을 확인하여 항염증 소재로서의 가능성을 확인하였다.
제안 방법
그리고 10% FBS를 첨가하지 않은 것을 serum-free medium으로 하였다. 100 mm plastic flasks에 2일에 한번씩 subculture 하여 세포주를 유지하였다.
)가 결합하여 생성되는 물질로 체내에서 DNA 등을 포함한 세포 분자에 손상을 주는 자유 라디칼이며, 강력한 산화 스트레스이다(Beckman과 Koppenol, 1996; Szabó 등, 2007). Peroxynitrite의 제어는 산화 스트레스 및 세포 분자염증의 제어에 의미가 있어, Po와 Pf 추출물에 의한 peroxynitrite 제어를 관찰하였다.
Po와 Pf 추출물을 5, 10, 20, 40 µg/mL의 농도로 처리하여 18시간동안 배양 후 MTT assay를 이용하여 세포독성을 측정하였다.
Po와 Pf 추출물이 RAW 264.7 세포에 LPS 1 µg/mL을 처리하여 유도한 NO를 억제하는지 관찰 하였다.
Po와 Pf는 50 µM SIN-1로 생성된 peroxynitrite를 농도의존적, 유의적으로 제어 하였다(Fig. 3).
RAW 264.7 세포에 LPS 1 µg/mL을 처리하여 유도한 nitric oxide (NO)를 Po와 Pf 추출물이 억제하는지 관찰 하였다.
RAW 264.7 세포에 LPS의 자극에 의해 염증반응이 일어나고 있을 때 Po와 Pf 추출물이 얼마만큼 NF-κB의 활성화를 저해하는지 관찰하였다.
그 후 ROS 생성을 위해 3-Morpholino-sydnonimine hydrochloride (SIN-1) 50 µM로 추가한 DCFH 용액 190 µL와 추출물 10 µL 합하여 Po와 Pf 추출물의 최종 농도가 10, 20, 40, 80 µg/mL이 되도록 하였다. SIN-1에 의해 생성되는 ROS를 처리 시료가 저해하는 정도를 여기파장 485 nm, 방출파장 530 nm으로 fluorescence microplate reader (Synergy HT, BIO-TEK, USA)로 측정하였다.
5, 1, 2, 4 µg/mL이 되게 하였다. peroxynitrite의 분당 변화량을 여기파장 500 nm 및 방출파장 536 nm로 fluorescence microplate reader (Synergy HT, BIOTEK)로 측정하였다.
검은색 96-well microplate에 Po와 Pf 추출물을 10 µL 취하고, 90 mM NaCl, 5 mM KCl 및 100 mM diethylenetriaminepenta acetic acid와 10 mM DHR 123을 함유하는 sodium phosphate 완충액 (pH 7.4)을 가한 후, peroxynitrite를 발생시키는 SIN-1을 50 µM이 되게 처리하여 시료의 최종농도 0.5, 1, 2, 4 µg/mL이 되게 하였다.
그 후 ROS 생성을 위해 3-Morpholino-sydnonimine hydrochloride (SIN-1) 50 µM로 추가한 DCFH 용액 190 µL와 추출물 10 µL 합하여 Po와 Pf 추출물의 최종 농도가 10, 20, 40, 80 µg/mL이 되도록 하였다.
또한 세포는 5% CO2와 95% air가 함유된 습한 대기와 같은 조건에서 37℃를 유지하였다. 그리고 10% FBS를 첨가하지 않은 것을 serum-free medium으로 하였다. 100 mm plastic flasks에 2일에 한번씩 subculture 하여 세포주를 유지하였다.
또한, Pf 추출물은 NO를 저해하고, Po 추출물은 NF-κB의 활성화를 저해하는 것을 관찰하였다.
5, 5, 10 µg/mL 이 되게 처리한 다음 1시간 후 LPS 1 µg/mL로 처리하여 18시간 배양하였다. 배양 후 상층액을 얻어, 세포배양액 중으로 분비한 nitric oxide양을 griess reagent system (Promega, USA)를 이용하여 측정하였다(Rao, 1997).
산화 스트레스를 발생시키는 SIN-1 50 mM로 유도된 ROS를 Po와 Po 추출물이 얼마만큼 저해하는지 관찰하였다. ROS는 자유 라디칼에 의해 생성되는 산화 스트레스로 superoxide (•O2−), hydroxyl radical (•OH), hydrogen peroxide (H2O2) 등이 있다.
세포에서 NF-κB의 발현을 확인 하기 위해 Po와 Pf 추출물을 최종농도 5, 10, 20, 40 µg/mL이 되도록 처리한 다음 1시간 후 LPS 1 µg/mL로 처리하여 1시간 배양하였다.
항염증인자에 대한 활성을 평가하기 위해 Po와 Pf 건조한 추출물을 추출시 사용한 용매 ethyl alcohol로 4 mg/mL이 되도록 제조 하여 사용하였다.
대상 데이터
major Maxin 추출물은 농촌진흥청 식물자원추출물은행에서 분양 받아 사용하였다. Po와 Pf 추출물은 건조된 뿌리부위를 100% 에탄올, 50℃ 조건으로 가속용매추출장치(ASE 300, Dionex, USA)를 사용하여 농촌진흥청 식물자원추출물은행에서 제조하였다.
RAW 264.7 (mouse monocyte/macrophage cell line)은 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 받았다. 세포는 2 mM L-glutamine, 100 mg/mL streptomycin, 2.
) Spach와 Potentilla fragarioides var. major Maxin 추출물은 농촌진흥청 식물자원추출물은행에서 분양 받아 사용하였다. Po와 Pf 추출물은 건조된 뿌리부위를 100% 에탄올, 50℃ 조건으로 가속용매추출장치(ASE 300, Dionex, USA)를 사용하여 농촌진흥청 식물자원추출물은행에서 제조하였다.
세포는 2 mM L-glutamine, 100 mg/mL streptomycin, 2.5 mg/L amphotericin B, 그리고 보체 불활성화된 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium을 이용하여 배양하였다.
데이터처리
통계학적 분석은 prism5 for windows (GraphPad Software, Inc., USA)를 이용하여 Newman-Keuls Multiple Comparison Test로 분석하였다.
이론/모형
7 cells. Cell viability was measured by MTT assay. Con, Control.
Po와 Pf의 Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1)에 의해 발생한 ROS의 저해 Po와 Pf의 ROS 저해능은 DCFDA방법으로 측정하였다(LeBel 등, 1992). 50 mM phosphate buffer pH 7.
Po와 Pf의 peroxynitrite 저해능은 dihydrorhodamine 123 (DHR123) 방법으로 측정하였다(Kooy 등, 1994). 검은색 96-well microplate에 Po와 Pf 추출물을 10 µL 취하고, 90 mM NaCl, 5 mM KCl 및 100 mM diethylenetriaminepenta acetic acid와 10 mM DHR 123을 함유하는 sodium phosphate 완충액 (pH 7.
시험물질의 세포 독성여부를 확인하기 위해, Raw 264.7 세포 증식에 미치는 각 시험물질의 영향을 MTT assay법을 이용하여 측정하였다. Raw 264.
성능/효과
Po와 Pf 추출물은 SIN-1 50 µM로 유도된 ROS를 농도의존적, 유의적으로 강력하게 제거하는 활성을 나타내었는데, SIN-1 50 µM로 유도된 ROS의 Po와 Pf 추출물에 의한 50% 저해능(IC50)은 Po 23.35±1.27, Pf 8.46±1.22 µg/mL이었다.
Po와 Pf 추출물은 SIN-1 50 µM로 유도된 ROS를 농도의존적, 유의적으로 강력하게 제거하는 활성을 나타내었다(Fig. 2).
02 µg/mL이었다(Table 2). Po와 Pf 추출물의 peroxynitrite 제어능이 매우 우수한 것을 확인 하였다. 특히, Peroxynitrite 저해능이 뛰어난 것으로 알려진 단일물질 penilcillamin과 trolox의 SIN-1 50 µM로 유도된 peroxynitrite의 IC50 값이 0.
RAW 264.7 세포에 LPS 1 µg/mL을 처리하여 NF-κB를 유도하여 Po와 Pf 추출물이 저해하는지를 확인한 결과, LPS 1 µg/mL를 처리한 RAW 264.7 세포에서 Po와 Pf 추출물이 처리농도 의존적으로 NF-κB의 활성화를 저해한 것을 확인하였다(Figs. 5 and 6).
RAW 264.7 세포에 LPS 1 µg/mL을 처리하여 세포핵 내로 NF-κB 이동을 유도하였고, Po와 Pf 추출물이 이를 저해하는지를 확인한 결과, Po 추출물이 처리농도 의존적으로 NF-κB의 이동을 저해한 것을 확인하였다.
RAW 264.7 세포에 Pf와 Po 추출물을 18시간 처리하여 cell viability를 확인한 결과 Pf와 Po 추출물은 RAW 264.7 세포에 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 1).
ROS 저해능이 뛰어난 것으로 알려진 단일물질 penicillamin과 trolox의 SIN-1 50 µM로 유도된 ROS의 IC50 값이 6.98±0.05와 7.38±0.05 µg/mL와 비교하여 Po와 Pf 추출물의 ROS의 저해능은 매우 높았다.
ROS, peroxynitirite등 산화스트레스를 저해하고 이로 인해 증가되는 NF-κB를 저해하는 Po 추출물은 TNF-α 등 NF-κB 유래 염증 유전자 발현을 억제하여 염증 반응에 효과가 있을 것으로 사료되며, ROS 등의 산화스트레스 및 NO의 생성을 저해하는 Pf 추출물은 iNOS 등의 NO 유래 염증 유전자를 억제하여 염증 반응을 제어하는 효과가 있을 것으로 사료된다.
7 세포에 LPS에 의해 활성화되는 NF-κB와 NO를 Po와 Pf 추출물이 저해하는지 검토해 보았다. 그 결과, Po와 Pf 추출물은 ROS와 peroxynitrite를 저해하였다. 또한, Pf 추출물은 NO를 저해하고, Po 추출물은 NF-κB의 활성화를 저해하는 것을 관찰하였다.
7 세포에서 NO의 발생을 억제 하였다. 그러므로, Pf 추출물은 NO 억제와 더불어 NO로 인하여 생성되는 염증 유전자 iNOS의 발현을 억제 할 수 있을 것이라 사료된다.
ROS, peroxynitirite등 산화스트레스를 저해하고 이로 인해 증가되는 NF-κB를 저해하는 Po 추출물은 TNF-α 등 NF-κB 유래 염증 유전자 발현을 억제하여 염증 반응에 효과가 있을 것으로 사료되며, ROS 등의 산화스트레스 및 NO의 생성을 저해하는 Pf 추출물은 iNOS 등의 NO 유래 염증 유전자를 억제하여 염증 반응을 제어하는 효과가 있을 것으로 사료된다. 이러한 결과로 Po와 Pf 추출물은 항염증소재로의 가능성이 충분하다고 사료된다.
특히, Peroxynitrite 저해능이 뛰어난 것으로 알려진 단일물질 penilcillamin과 trolox의 SIN-1 50 µM로 유도된 peroxynitrite의 IC50 값이 0.67±0.04과 0.55±0.01 µg/mL와 비교하여, Pf 추출물 IC50 값이 알려진 Peroxynitrite 제어물질들의 IC50 값에 근접해 있음을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Potentilla fragarioides var. major Maxim은 어떤 증상을 치료하는데 쓰일 수 있는가?
풀의 높이는 30−50 cm이며 노란색 꽃이 4−6월에 핀다. 식물체 전체 및 뿌리는 상처의 피를 멎게 하거나 설사, 이질에 쓰고 열을 내리는 약으로 사용한다(Kim, 1989). 하지만, Po의 환경 생태 연구(Lee 등, 2011)와 Pf에서 분리한 물질의 항산화능 연구(Choi 등, 1998)는 보고 되었지만 Po와 Pf의 추출물 혹은 Po와 Pf로부터 분리한 물질을 이용하여 활성산소 저해 활성 연구 및 세포와 동물 실험으로 염증 단백질의 발현과 활성을 살펴본 연구가 전무하였다.
산화 스트레스는 어떤 질환들의 원인인가?
산화 스트레스는 분자 염증반응뿐 아니라 동맥경화, 악성빈혈, 치매, 골다공증, 혈관 질환 같은 염증반응에 의해 발생하는 질환들의 주요한 원인이다. 이러한 염증반응은 체내의 redox 환경의 불균형에 의해 발생되며, 이로 인해 염증반응의 주요 전사인자인 NF-κB가 활성화되며 이로 인해 COX-2, iNOS, VCAM-1 등의 염증 유전자가 발현하게 된다(Kim 등, 2002; Chung 등, 2006).
Persicaria orientalis (L.) Spach에 대해 동의보감에선 어떻게 설명하고 있는가?
5−2 m이며 8−9월에 붉은색 꽃이 피는 식물로서 동남아시아가 원산지다. 동의보감에는 성질이 약간 차고 맛은 짜며 독(毒)이 없으며 당뇨와 비슷한 소갈과 다리가 나무처럼 뻣뻣하고 시큰거리며 힘이 없으면서 열이 나고 붓거나 마르기도 하는 각기를 주로 치료한다고 효능을 설명하고 있다. 또한, Potentilla fragarioides var.
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