님 추출물은 포유류에 낮은 독성을 가지고 있기 때문에 유기농업자재로 주로 이용되고 있다. 그러나 님 추출물은 림프구의 염색체 이상을 야기한다는 연구결과가 보고되었다. 따라서, 본 연구는 님 추출물을 이용하여 항돌연변이원성 시험 및 유전독성을 평가하였다. 항돌연변이원성 시험은 복귀돌연변이 시험을 이용하여 시험하였다. 복귀돌연변이 시험은 2개의 님 추출물을 Salmonella Typhimurium 5개 균주를 이용하여 돌연변이 유발 가능성을 평가하였다. 복귀돌연변이시험과 염색체이상시험은은 대사활성계 처리군(S-9 mix)과 대사활성계 미처리군(PBS)으로 나누어 양성대조군과 음성대조군을 사용하여 실시하였다. 염색체이상시험은 Chinese hamster lung cell을 이용하여 님추출물 시료에 대사활성계 처리군은 6시간 노출시켰고, 대사활성계 미처리군은 각각 6시간과 24시간 노출시켜 시험하였고, 음성대조군과 양성대조군을 사용하였다. 4 NQO에 의해 유도 된 돌연변이 집락수는 님추출물 시료 처리에 의해 감소되어 SRE는 항 돌연변이 효과가 있을 수 있음을 나타냈다. 복귀돌연변이와 염색체이상시험은 님추출물 모든 시험 농도군에서 대화활성계의 처리 유무와 관계없이 음성으로 판정되었다. 이상의 결과를 ICH에서 제안된 유전독성 battery system에 근거해 살펴 봤을 때 본 연구에서 사용된 님 추출물 2종은 모두 유전독성이 없어 안전함을 확인 할 수 있었다.
님 추출물은 포유류에 낮은 독성을 가지고 있기 때문에 유기농업자재로 주로 이용되고 있다. 그러나 님 추출물은 림프구의 염색체 이상을 야기한다는 연구결과가 보고되었다. 따라서, 본 연구는 님 추출물을 이용하여 항돌연변이원성 시험 및 유전독성을 평가하였다. 항돌연변이원성 시험은 복귀돌연변이 시험을 이용하여 시험하였다. 복귀돌연변이 시험은 2개의 님 추출물을 Salmonella Typhimurium 5개 균주를 이용하여 돌연변이 유발 가능성을 평가하였다. 복귀돌연변이시험과 염색체이상시험은은 대사활성계 처리군(S-9 mix)과 대사활성계 미처리군(PBS)으로 나누어 양성대조군과 음성대조군을 사용하여 실시하였다. 염색체이상시험은 Chinese hamster lung cell을 이용하여 님추출물 시료에 대사활성계 처리군은 6시간 노출시켰고, 대사활성계 미처리군은 각각 6시간과 24시간 노출시켜 시험하였고, 음성대조군과 양성대조군을 사용하였다. 4 NQO에 의해 유도 된 돌연변이 집락수는 님추출물 시료 처리에 의해 감소되어 SRE는 항 돌연변이 효과가 있을 수 있음을 나타냈다. 복귀돌연변이와 염색체이상시험은 님추출물 모든 시험 농도군에서 대화활성계의 처리 유무와 관계없이 음성으로 판정되었다. 이상의 결과를 ICH에서 제안된 유전독성 battery system에 근거해 살펴 봤을 때 본 연구에서 사용된 님 추출물 2종은 모두 유전독성이 없어 안전함을 확인 할 수 있었다.
Azadirachta indica extract (AIE) has been regarded as a promising source of environment-friendly organic materials owing to their low mammalian toxicity. However, quite a bit of research has been reported that AIE may cause clastogens in human lymphocytes. Therefore, this study was conducted to eval...
Azadirachta indica extract (AIE) has been regarded as a promising source of environment-friendly organic materials owing to their low mammalian toxicity. However, quite a bit of research has been reported that AIE may cause clastogens in human lymphocytes. Therefore, this study was conducted to evaluate the antimutagenic and genotoxicity of two samples of AIE. Antimutagenic test was experimented by using bacterial reverse mutation test. In the bacterial reverse mutation test, five strains Salmonella Typhimurim of two samples of AIE in order to evaluate its mutagenic potential. Bacterial reverse mutation test was also performed on positive control and negative control groups in the presence of the metabolic activation system (S-9 mix) and metabolic non-activation system. In the chromosome aberration test, Chinese hamster lung cells were exposed to AIE for 6 or 24 h with BPS, or for 6 h with S-9 mix. Negative and positive control groups were experimented for chromosome aberration test. As a result, the number of mutated colonies induced by 4-NQO were reduced by AIE treatment in all strains, indicating that AIE may have antimutagenic effects. Bacterial reverse mutation and chromosomal aberration were not shown at all concentration of AIE, regardless of activation of the metabolic system. we concluded that two AIE samples used in this study have no genotoxic effects to human, according to the genotoxicity battery system suggested by ICH (International Conference on Harmonization).
Azadirachta indica extract (AIE) has been regarded as a promising source of environment-friendly organic materials owing to their low mammalian toxicity. However, quite a bit of research has been reported that AIE may cause clastogens in human lymphocytes. Therefore, this study was conducted to evaluate the antimutagenic and genotoxicity of two samples of AIE. Antimutagenic test was experimented by using bacterial reverse mutation test. In the bacterial reverse mutation test, five strains Salmonella Typhimurim of two samples of AIE in order to evaluate its mutagenic potential. Bacterial reverse mutation test was also performed on positive control and negative control groups in the presence of the metabolic activation system (S-9 mix) and metabolic non-activation system. In the chromosome aberration test, Chinese hamster lung cells were exposed to AIE for 6 or 24 h with BPS, or for 6 h with S-9 mix. Negative and positive control groups were experimented for chromosome aberration test. As a result, the number of mutated colonies induced by 4-NQO were reduced by AIE treatment in all strains, indicating that AIE may have antimutagenic effects. Bacterial reverse mutation and chromosomal aberration were not shown at all concentration of AIE, regardless of activation of the metabolic system. we concluded that two AIE samples used in this study have no genotoxic effects to human, according to the genotoxicity battery system suggested by ICH (International Conference on Harmonization).
Plate 수거 2시간 전에 Colcemid (Gibco)를 최종농도의 0.2 µg/mL가 되도록 처리한 후, 2시간을 추가로 더 배양하여 분열중기세포를 0.25% TrypsinEDTA (Gibco)를 이용하여 수거하였다.
S. Typhimurium TA98, TA100, TA102, TA1535 및 TA1537을 10 mL의 nutrient broth (DifcoTM; USA)에 접종해 진탕배양하였다(37°C, 16시간, 200 rpm).
님 추출물의 염색체이상 시험 농도를 결정하기 위한 예비시험으로 MTT를 수행하여 본 시험의 최고농도를 선정한 결과, 님 추출물 시료 A는 최고농도로 6시간 대사 활성계 미처리군 2000 µg/mL, 6시간 대사활성계 처리군 4000µg/mL, 24시간 대사활성계 미처리군 1600 µg/mL에서 시험하였으며, 시료 B는 6시간 대사활성계 미처리군 1200 µg/mL, 6시간 대사활성계 처리군 1200 µg/mL, 24시간 대사활성계 미처리군 800 µg/mL에서 시험하였다.
후)대사 활성계">대사활성계 미처리군(PBS)으로 나누어 시험하였다. 본 시험농도를 결정하기 위하여 예비독성 실험을 통해 최고농도 결정 5.0 mL/plate에 등비 2로 3농도에서 시험하였다.
수거한 세포에 저장액(0.75M KCl, Sigma) 4 mL을 가하여 37°C 수욕상에서 15분간 처리한 후 냉각 고정액으로 고정 및 표본을 제작하였으며, Giemsa (Fluka, USA) 염색 후 현미경(Nikon, Eclipose 80i, Japan)으로 관찰하였다.
후)분석.시험에">시험에 사용된 님 추출물 시료에 대한 정확한 유효성분의 함량을 확인하고자 유기농업자재의 유효성분인 azadirachtin 및 그 이성질체들을 분석하였다. 시료의 정제 및
후)희석조제하여">희석 조제하여 사용하였다. 실험물질은 대사활성계 처리군(6시간 처리)과 대사활성계 미처리군(6시간 및 24시간 처리)으로 나누어 실시하였다. 6시간 물질 처리군의 경우,
염색체이상">2005). 염색체이상 시험은 최종 판정은 gap을 제외한 이상세포의 평균 출현율이 5% 미만일 때 음성, 5 이상 10% 미만일 때는 의양성, 10% 이상일 때 양성으로 최종 판정한 Ishidate와 Odashima(1977)의 자료를 근거로 최종 염색체이상결과를 판정 하였다.
항돌연변이원성 시험은 복귀돌연변이(Maron과 Ames, 1983)의 전배양법을 개량하여 시험을 실시하였다.
대상 데이터
Salmonella Typhimurium TA98 (hisD3052, ∆uvrB, rfa/pKM101), TA100 (hisG46, ∆uvrB, rfa/pKM101), TA102 (hisG428, rfa/pKM101), TA1535 (hisG46, ∆uvrB, rfa), TA1537 (hisC3076, ∆uvrB, rfa) 모두 5개 균주를 Moltox (USA) 에서 분양 받아 형질확인 후 계대배양한 것을 항돌연변이원 성과 복귀돌연변이시험에 사용하였다.
후)시약.님추출물의">님추출물의 유효성분 분석을 위해 사용된 표준물질 azadirachtin A, azadirachtin B, deacetylsalannin과 salannin 은 ChromaDex (USA)에서 구매하여 사용하였다.
후)복귀 돌연변이">복귀돌연변이 시험에 사용되는 양성물질은 2-nitrofluorene (2NF), sodium azide (SA), mitomycin C (MMC), 9-aminoacridine (9AA), 2-aminoanthracene (2AA)를, 염색체이상시험의 양성대조물질은 benzo[e]pyrene와 MMC를 Sigma (USA)에서 구매하여 사용하였다. 항돌연변이원성과
본 시험에서는 시중에 유통되는 인도산 님추출물 2종(A, B)을 구입하여 시험에 사용하였다. 시험물질은 사용기간 동안 빛이 통하지 않는 불투명한 용기에 담아 실온에서 보관하였으며,
세포는 37°C 배양기(5% CO2)에서 배양하여 2−3일마다 세포를 계대배양하여 사용하였다.
후)염색체 이상">염색체이상 시험에서는 Chinese Hamster Lung cell (ATCC, USA)를 사용하였으며, 세포주를 Minimum Essential Medium (Gibco, USA) 액체배지에 10% FBS (Gibco), Pen strep (Gibco) 5.5 mL, L-glutamine 200 mM (100X) (Gibco) 5.5 mL을 혼합하여 사용하였다. 세포는 37°C 배양기(5% CO2)에서 배양하여 2−3일마다 세포를
데이터처리
후)결과 해석을">결과해석을
위해 구조이상(structural aberration)과 수적이상(numerical aberration)으로 나누어 계수하였다(JEMS-MMS, 1988). 염색체 이상을 가진
이론/모형
후)돌연변이 유도제에">돌연변이유도제에
대한 저해율(inhibition rate, %)은 Jeun 등(2011)의 방법에 따라 계산하였다.
후)복귀돌연변이 시험은">복귀돌연변이시험은 Maron과 Ames(1983) 에 따라 전배양법 시험에 따랐으며, 대사활성계 처리군(S-9 mix)과 대사활성계 미처리군(PBS)으로 나누어 시험하였다. 본
세포를 이용한 염색체 이상시험은 농약관리법 제5조 제1항 제3호 관련 ‘임축독성 시험기준과 방법’(농촌 진흥청 고시 제 2013-21호)에 근거하여 시행되었다.
후)확인하고 자">확인하고자 유기농업자재의 유효성분인 azadirachtin 및 그 이성질체들을 분석하였다. 시료의 정제 및 정량분석은 Lee 등 (2013)의 방법에 따라 아래와 같이 수행하였다. 추출물 시료 1 mL 를 증류수 49 mL 를 사용하여 50배 희석하고, Dichloromethane (25 mL×3)으로
성능/효과
님 추출물 시료 A와 B를 이용한 염색체이상 시험결과, 대 사활성 처리유무에 관계없이 모든 농도에서 gap을 제외한 구조적 염색체이상 발생율이 최고 2.7% 로 나타남에 따라, 본 시험에서 사용된 님 추출물 A와 B 시료 모두 염색체이상 시험에서 최종적으로 음성으로 판정하였다.
후)님 추출물">님추출물 시료 A를 분석한 결과 Azadirachtin A 98.2 ppm, Azadirachtin B 180.4 ppm, Deacetylsalannin 6,762.0 ppm, Salannin 434.3 ppm을 함유하고 있었으며, 님추출물 시료 B는 Azadirachtin A와 Azadirachtin B 만을 각각 2,102.2 ppm과 904.9 ppm 함유하였다.
대사활성계 미처리군에서 사용된 양성대조 물질인 MMC는 6시간 및 24시간 처리시 각각 38.0% 및 27.5%의 염색체이상을 보였으며, 대사활성계 처리군에서 사용된 Benzo[e]pyren도 22.5%의 염색체이상을 보여 모든 조건에서 음성대조군에 비해 유의적인 차이를 보였다(p <0.05).
후)음성 대조군과">음성대조군과 비교했을 때 비슷한 수준으로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 본 시험에 사용된 님 추출물 시료는 복귀돌연변이 시험에서 안전한 것으로 판정되어 유기농업자재로서의 사용이 적합한 것으로 사료된다.
후)마우스 림포마">마우스림포마 assay 중 한 시험을 수행하여 두 결과가 모두 음성인 경우 유전독성이 없다고 최종 판정하도록 하고 있다. 따라서, 본 연구에서 시험된 님 추출물 2종은 복귀돌연변이 시험과 포유류 배양세포를 이용한 in vitro 염색체이상 시험 결과 모든 시험군에서 음성을 나타남에 따라 최종적으로 유전독성이 없는 것으로 판정하였다.
후)염색체 이상을">염색체이상을 초래한다고 보고하였다. 또한, EFSA(2011) 농약으로 등록되어 사용되고 있는 님 추출물 3종을 인체 배양 lymphocyte를 이용한 in vitro 염색체이상 시험을 시행한 결과 3종 모두에서 구조적 염색체이상을 보였으나, in vivo 시험을 통해 2종의 님 추출물이 음성으로 최종 판정된 바 있다.
본">1). 본 시험에서 사용된 님 추출물 시료 A와 B의 3수준의 처리농도인 5.0, 2.5, 1.25 mL/plate에서 각각 73.2-99.0, 85.9-97.8, 76.6-98.5%의 범위로 나타남에 따라, 님 추출물 2종은 돌연변이 유발 억제효과가 있는 것으로 생각된다. 이는 Vinod 등(2011)의
후)시험 결과,">시험결과, 음성대조군은 대사활성 처리유무에 관계없이 모든 조건에서 염색체이상이 나타나지 않았다.
양성대조군은 음성대조군과 유의적인 차이를 보여 본 시험방법의 적절성을 확인 할 수 있었다(p <0.05).
님 추출물의 처리 농도에 따른 차이를 살펴보면, 대사활성계 미처리군에서 님 추출물 시료 A는 TA100과 TA1535에서, 시료 B는 TA102를 제외한 나머지 모든 균주들에서 농도가 증가함에 따라 저해율이 감소하였다. 또한,
특히 TA98에서 시료 A와 B 모두가 대사활성계 처리군이 미처리군보다 동일 농도에서 항돌연변이 저해율이 유의적으로 높게 나타남(p <0.05)에 따라 두 시료 모두 구조이동 돌연변이성을 저해하는 효과가 대사활성처리시 유의적으로 높아짐을 알 수 있다.
후속연구
후)독성 영향도">독성영향도 알려져 있다(Awasthy 등, 1995; 1999). 또한, 님을 추출할 때 사용된 용매나 추출방법에 따라 최대허용독성수준(NOEAL; No Observable Adverse Effect level)이 다르게 보고되고 있어(Singh 등, 1987; ElHawary와 Kholief, 1990; Tandan 등, 1995) 우리나라에서 유기농업자재 제품에 사용되는 님추출물의 안전성 확인이 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
님에 함유된 주성분은?
님(Azadirachta indica)은 치료 목적으로도 많이 사용되는 식물로써 azadirachtin, azadiradione, salannin, epoxyazadiradione 등의 주성분을 가지며, 혈압강하, 고지혈증 개선, 항종양효과, 항염증에도 효과를 가지고 있다(Han, 1989; Govindachari 등, 1998; Paterson, 2006), 특히 azadirachtin은 triterpenoid 물질로 곤충의 작물의 섭식을 기피 및 방지하는 효과가 뛰어나고, 탈피호르몬에 작용하여 번식을 억제함으로서(Schutterer, 1990) 작물을 병해충으로부터 예방하는 효과가 있어 유기농업자재로도 널리 사용되고 있다(Boeke 등, 2004).
님 추출물의 항돌연변이원성을 시험하기 위해 이용한 시험법은?
따라서, 본 연구는 님 추출물을 이용하여 항돌연변이원성 시험 및 유전독성을 평가하였다. 항돌연변이원성 시험은 복귀돌연변이 시험을 이용하여 시험하였다. 복귀돌연변이 시험은 2개의 님 추출물을 Salmonella Typhimurium 5개 균주를 이용하여 돌연변이 유발 가능성을 평가하였다.
2013년 8월 우리나라 유기농업자재 공시 및 품질인증된 제품의 수와 천연식물추출물의 비율은?
6조에 이를 것으로 예상하고 있다(Park 등, 2011; KEFAM, 2012). 이에 발 맞추어 유기농업자재들의 사용도 급증하여 2013년 8월 현재 우리나라 유기농업자재 공시 및 품질인증된 제품인 1,141종에 해당되며, 이 중에서도 고삼 추출물, 님 추출물, 데리스 추출물과 같은 천연식물추출물의 비율이 약 20%에 달하고 있다.
참고문헌 (30)
Awasthy KS, Chaurasia OP, and Sinha SP (1995) Genotoxic effects of crude extract of neem (Azadirachta indica) in bone marrow cells of mice. Cytologia 60, 189-95.
Awasthy KS, Chaurasia OP, and Sinha SP (1999) Prolonged murine genotoxic effects of crude extracted from neem. Phytother Res 11, 81-3.
Boeke SJ, Boersma MG, Alink GM, van Loon JJ, van Huis A, Dicke M et al. (2004) Safety evaluation of neem (azadirachta indica) derived pesticides. J Ethnophamacol 94, 25-41.
Cho HY, Yoon HY, Park KY, Lee JB, Shim CK, Kim JH et al. (2013) In vitro antimutagenic and genotoxic effects of Sophora Radis Extracts. Korean J Pesticide Science 17(4), 1-8.
EFSA(European Food Safety Authority) (2011) Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance azadirachtin. EFSA Journal 9, 1858
El-Hawary ZM and Kholief TS (1990) Biochemical studies on hypoglycemic agents. I. Effect of Azadirachta indica leaf extract. Arch Pharm Research (Seoul) 13, 108-12.
Govindachari TR, Suresh G, Gopalakrishnan G, Banumathy B, and Masilamani S (1998) Identification of antifungal compounds from the seed oil of Azadirachta indica. Phytoparasitica 26, 109-16.
Han S (1989) Diversion of locomotor activity rhythm and neural control by Azadirachtin in Leucophaea maderae. Korean J Zool 32, 441-9.
ICH (2012) Genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use. International Conference on Harmonization, USA.
Ishidate M Jr and Odashima S (1977) Chromosome test with 134 compounds on Chinese hamster cells in vitro-A screening for chemicals carcinogens. Mutat Res 48, 337-54.
JEMS-MMS (1988) Atlas of chromosome aberration by chemicals. Japanese Environmental Mutagen Society-Mammalian Mutagenicity Study Group, Japan.
Jeun J, Cho HJ, Jun H, Lee JH, Jia Y, Cho KS et al. (2011) Mutagenic and antimutagenic effects of hemp seed oil evaluated by ames Salmonella testing. Korean J Food Sci Technol 43, 396-400.
Jongen WM and Koeman JH (1983) Mutagenicity testing of two tropical plant materials with pesticidal potential in Salmonella typhimurium: Phytolacca dodecandraberries and oil from seeds of Azadirachta indica. Environ Mutagen 5, 687-94.
KEFAM Association (2012) Standard guidelines of environment-friendly organic materials. Korea Eco-friendly Agro-materials, Korea.
Kusamran WR, Tepsuwan A, and Kupradinun P (1998) Antimutagenic and anticarcinogenic potentials of some Thai vegetables. Mutat Res 18, 247-58.
Lee J-W, Jin C-L, Jang KC, Choi G-H, Lee H-D, and Kim JH (2013) Investigation on the insecticidal limonoid content of commercial biopesticides and neem extract using solid phase extraction. J Agric Chem Environ 2(4), 81-5.
Maron DM and Ames BN (1983) Reversed methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 113, 173-215.
Nakahara K, Roy MK, Ono H, Maeda I, Ohnishi-Kameyama M, Yoshida M et al. (2003) Prenylated flavanones isolated from flowers of antimutagenic constituents against heterocyclic amines. J Agric Food Chem 51, 6456-60.
OECD SIDS (1999) Acetone, SIDS Initial Assessment Report for the 9th SIAM. UNEP Publications, USA.
Park M, Kim J, Choi W, and Yoon M (2011) Nematicidal effect of root-knot nematode (Meloidogyne incognita) by biological nematicide. Korean J Soil Fert 44, 228-35.
Polasa K and Rukmini C (1987) Mutagenicity tests of cashew nut shell liquid, rice-bran oil and other vegetable oils using the Salmonella typhimurium/microsome system. Food Chem Toxicol 25, 763-6.
Rojanapo W and Tepsuwan A (1992) Matagenic and antimutagenic activities of some vegetables (in Thai). Bulletin of the Department of Medical Services 17, 461-9.
RosenKranz HS and Klopman G (1995) An examination of the potential genotoxic carcinogenicity of a biopesticide derived from neem tree. Environ Mol Mutagen 26, 255-60.
Shin N and Koo S (1998) Antimutagenic effects of dietary fiber from yam (dioscorea batatas decne) against 2-AF and MNNG. Korean J Soc Food Sci 14, 333-8.
Song S, Yang DC, and Choung SY (2005) The chromosomal aberration test of wild ginseng culture extract in chinese hamster lung cell. J Toxicol Pub Health 21, 57-62.
Tandan SK, Gupta S, Chandra S, Lal J, and Singh R (1995) Safety evaluation of Azadirachta indica seed oil, a herbal wound dressing agent. Fitoterapia 66, 69-72.
Vinod V, Tiwari PK, and Meshram GP (2011) Evaluation of mutagenic and antimutagenic activities of neem (Azadirachta indica) seed oil in the in vitro Ames Salmonella/microsome assay and in vivo mouse bone marrow micronucleus test. J Ethnopharmacol 134, 931-7.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.