[국내논문]버섯 세균갈색무늬병균(Pseudomonas tolaasii)에 항균활성을 가지는 미생물 Pseudomonas azotoformans HC5 Pseudomonas azotoformans HC5 Effective in Antagonistic of Mushrooms Brown Blotch Disease Caused by Pseudomonas tolaasii원문보기
P. tolaasii에 의해 발생하는 세균갈색무늬병은 버섯재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항미생물의 항균활성과 선발된 길항미생물에 대해 폿트 수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 느타리 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균을 강하게 억제하는 길항세균 HC5를 선발하였으며, 생리 생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC5균주는 P. azotoformans로 동정되었다. P. azotoformans HC5를 양송이, 팽이버섯, 느타리에 처리한 결과 각각 78%, 73%, 71%의 방제효과를 보였다. 따라서 P. azotoformans HC5가 버섯 세균갈색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경 방제제가 될 수 있을 것으로 생각된다.
P. tolaasii에 의해 발생하는 세균갈색무늬병은 버섯재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항미생물의 항균활성과 선발된 길항미생물에 대해 폿트 수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 느타리 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균을 강하게 억제하는 길항세균 HC5를 선발하였으며, 생리 생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC5균주는 P. azotoformans로 동정되었다. P. azotoformans HC5를 양송이, 팽이버섯, 느타리에 처리한 결과 각각 78%, 73%, 71%의 방제효과를 보였다. 따라서 P. azotoformans HC5가 버섯 세균갈색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경 방제제가 될 수 있을 것으로 생각된다.
A gram-negative bacterium was isolated from spent substrate of Agaricus bisporus and showed marked antagonistic activity against Pseudomonas tolaasii. The bacterium was identified as Pseudomonas azotoformans by based on the cultural, biochemical and physiological characteristics, and 16S rRNA gene s...
A gram-negative bacterium was isolated from spent substrate of Agaricus bisporus and showed marked antagonistic activity against Pseudomonas tolaasii. The bacterium was identified as Pseudomonas azotoformans by based on the cultural, biochemical and physiological characteristics, and 16S rRNA gene sequence. The isolated bacterium was saprophytic but not parasitic nor pathogenic to cultivation mushroom. The isolated bacterium for P. tolaasii cell was not sufficient for inhibition in vitro. Control efficacy of Pseudomonas azotoformans HC5 to brown blotch of P. tolaasii was 73, 78, and 71% on A. bisporus, Flammulina velutipes, and Pleurotus ostreatus, respectively. In the future, the suppressive bacterium may be useful for development of a biocontrol system.
A gram-negative bacterium was isolated from spent substrate of Agaricus bisporus and showed marked antagonistic activity against Pseudomonas tolaasii. The bacterium was identified as Pseudomonas azotoformans by based on the cultural, biochemical and physiological characteristics, and 16S rRNA gene sequence. The isolated bacterium was saprophytic but not parasitic nor pathogenic to cultivation mushroom. The isolated bacterium for P. tolaasii cell was not sufficient for inhibition in vitro. Control efficacy of Pseudomonas azotoformans HC5 to brown blotch of P. tolaasii was 73, 78, and 71% on A. bisporus, Flammulina velutipes, and Pleurotus ostreatus, respectively. In the future, the suppressive bacterium may be useful for development of a biocontrol system.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제를 위하여 길항미생물을 선발 및 동정하여 화학농약을 대체하고 친환경적인 버섯 병해 방제를 위하여 수행하였다.
tolaasii에 의해 발생하는 세균갈색무늬병은 버섯재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항미생물의 항균활성과 선발된 길항미생물에 대해 폿트 수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 느타리 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균을 강하게 억제하는 길항세균 HC5를 선발하였으며, 생리·생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC5균주는 P.
제안 방법
DNA는 Quiagen Genomic DNA Isolation Kit(Quiagen, USA)을 사용하여 분리하였고, PCR 증폭은 Techne thermocycler(Techne LTD, Duxford, Cambridge, U.K.)로 수행하였다. PCR 반응혼합액은 1 × buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.
FAMEs profile은 25 mm × 0.2 mm의 methyl phenyl silicone fused silica capillary column을 사용하여 MIDI Hewlett-Packard Microbial Identification System(MIDI Inc., Newark, DE, USA)software를 가진 마이크로프로세스를 장착한 Gas Chromatography(HP 5890A, Avondale, Pa)로 분석하였다.
PCR 반응혼합액은 1 × buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin and 0.1% Triton X-100), 최종농도 200 µM의 deoxyribonucleotide triphosphates(dATP, dCTP, dTTP), 0.6 U Taq DNA polymerase(Molecular Biochemicals, Mt Wellington, Auckland, New Zealand), 최종농도 2 µL의 정, 역방향의 primers [fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 rP2(5'-ACGGCT ACCTTGTTACGACTT-3')] 그리고 10 ng template DNA로 이루어졌다.
6 U Taq DNA polymerase(Molecular Biochemicals, Mt Wellington, Auckland, New Zealand), 최종농도 2 µL의 정, 역방향의 primers [fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 rP2(5'-ACGGCT ACCTTGTTACGACTT-3')] 그리고 10 ng template DNA로 이루어졌다. PCR은 94oC에서 1분, 56oC에서 1분 그리고 72oC에서 2분간 30cycles로 수행하였고, 반응 후 primer와 dNTP는 High Pure PCR Product Purification Kit(Bioneer Co., Chungbuk, Korea)을 사용하여 PCR 산물로부터 제거하였다. 정제된 PCR 산물은 pT7 blue Vector(Novagen Co.
길항세균 HC5균주의 16S rDNA를 PCR 증폭에 의해 약 1.5 kb의 유전자를 확보하였으며, 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 Ribosomal database project를 이용하여 상동성을 분석한 결과 P.
세균갈색무늬병의 방제효과를 검정하기 위해 병재배된 느타리와 팽이버섯 그리고 폿트(90×30 cm)에 재배된 양송이를 실험에 사용하였다. 버섯 자실체에 병원균 현탁액을 분무살포하고 30분 후 유용미생물 현탁액을 분무살포하고 온도 15oC, 습도 95%의 생육실에서 재배하면서 병 발생율을 조사하였다. 발병율 및 방제가는 다음 식으로 계산하였다.
병원균을 R2A배지에 48시간 배양한 후 멸균수로 현탁(5×106)하여 페트리디쉬에 도말한 후 분리 미생물을 접종하여 생육저지환의 정도에 따라 각 균주에 대한 길항능력을 평가하였다.
선발 유용미생물의 생화학적인 특성을 조사하기 위하여 기본배지[21]에 다양한 종류의 탄소원과 질소원, 유기산 등을 0.1%(w/w)씩 첨가하여 생육정도를 조사하였으며, 부가적으로 API 20E, API 20NE, 50CH 키트(BioMerieus, Marcy I'Etoile, France)를 사용하였고, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology[22]에 준하여 실험을 하였다.
세균갈색무늬병을 일으키는 P. tolaasii에 대해 길항성을 나타내는 미생물을 선발하기 위하여 버섯배지로 부터 약 3,500균주의 미생물을 분리하여 길항력을 조사하였다. 그 결과 미생물 HC5가 가장 높은 길항력을 보였지만 대부분의 분리 미생물은 길항력이 없었거나 아주 약한 길항력을 보였다(Fig.
, Chungbuk, Korea)을 사용하여 PCR 산물로부터 제거하였다. 정제된 PCR 산물은 pT7 blue Vector(Novagen Co., Madison, WI, USA)에 클로닝하여 Big Dye Terminator Kit와 ABI Prism 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer, New Jersey, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 결정한 16S rRNA 유전자의 염기서열은 GenBank Database에 등록하였다.
결정한 16S rRNA 유전자의 염기서열은 GenBank Database에 등록하였다. 종 유사성 결정을 위해 Clustral W 분석프로그램[19]을 사용하여 GenBank에 있는 다른 염기서열들과 비교하였다. Jukes와 Cantor[20] 방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
대상 데이터
세균갈색무늬병의 방제효과를 검정하기 위해 병재배된 느타리와 팽이버섯 그리고 폿트(90×30 cm)에 재배된 양송이를 실험에 사용하였다.
미생물의 분리는 R2A배지에 단계별로 희석 배양하여 50~60개의 colony를 형성한 plate로부터 독립적으로 분리하였다. 순수 분리한 미생물은 R2A배지에서 2일 동안 배양한 후 균체를 모아서 20%(v/v) 글리세롤 용액에 넣어 -70oC에 보존하면서 검정용 시료로 사용하였다.
유용한 미생물을 분리하기 위해 재배중인 느타리 폐면배지와 양송이 퇴비를 농가별 3점씩 채취하여 실험에 사용하였다. 미생물의 분리는 R2A배지에 단계별로 희석 배양하여 50~60개의 colony를 형성한 plate로부터 독립적으로 분리하였다.
이론/모형
종 유사성 결정을 위해 Clustral W 분석프로그램[19]을 사용하여 GenBank에 있는 다른 염기서열들과 비교하였다. Jukes와 Cantor[20] 방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
배지에서 순수 분리한 미생물로부터 세균갈색무늬병균에 대한 길항균을 선발하기 위하여 paper disk methods를 이용하여 실험하였다. 병원균을 R2A배지에 48시간 배양한 후 멸균수로 현탁(5×106)하여 페트리디쉬에 도말한 후 분리 미생물을 접종하여 생육저지환의 정도에 따라 각 균주에 대한 길항능력을 평가하였다.
세포의 지방산 조성에 의한 분류동정은 상법에 따라 약 50 mg의 균체로부터 지방산을 추출하여[223 fatty acid methyl esters(FAMEs) 분석으로 수행하였다. FAMEs profile은 25 mm × 0.
성능/효과
azotoformans로 동정되었다. P. azotoformans HC5를 양송이, 팽이버섯, 느타리에 처리한 결과 각각 78%, 73%, 71%의 방제효과를 보였다. 따라서 P.
3%의 이병율을 보여 73%의 방제효과를 보였다. 그리고 팽이버섯에서는 무처리에서 89.8%의 이병율을 보였고, HC5처리에서는 19.5%의 이병율을 보여 78%의 방제효과가 있었다. 이상의 결과로 HC5균주는 세균갈색무늬병을 일으키는 거의 모든 버섯에 높은 병 방제효과가 관찰되었다(Table 3, Fig.
느타리에 세균갈색무늬병균을 접종한 후에 HC5을 처리한 결과 무처리구에서는 93.8%의 이병율을 보였지만 HC5 처리에서는 27.8%의 이병율을 보여 71%의 방제효과가 있었다. 양송이에서는 무처리에서 56.
azotoformans와 97%의 유사성을 보였다. 또한 Neighbor Joining방법을 이용한 유연관계를 분석한 결과 길항균 HC5는 P. azotoformans와 같은 그룹을 형성하였다(Fig. 2).
본 연구의 길항세균 HC5균주는 NaCl 3%와 NaCl 5%를 첨가한 배지에서 균생육이 가능하였으며, gelatin을 액화시키지 못하였다. 그리고 Urease, Glucose acidification, Aesculin hydrolysis에서 음성이었다.
8%의 이병율을 보여 71%의 방제효과가 있었다. 양송이에서는 무처리에서 56.3%의 이병율을 보였고, HC5처리에서는 15.3%의 이병율을 보여 73%의 방제효과를 보였다. 그리고 팽이버섯에서는 무처리에서 89.
5 kb의 유전자를 확보하였으며, 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 Ribosomal database project를 이용하여 상동성을 분석한 결과 P. azotoformans와 97%의 유사성을 보였다. 또한 Neighbor Joining방법을 이용한 유연관계를 분석한 결과 길항균 HC5는 P.
5%의 이병율을 보여 78%의 방제효과가 있었다. 이상의 결과로 HC5균주는 세균갈색무늬병을 일으키는 거의 모든 버섯에 높은 병 방제효과가 관찰되었다(Table 3, Fig. 3). Lee 등[25]은 세균갈색무늬 병원균의 분비독소를 저해는 미생물인 Pseudomonas 속이 느타리, 팽이버섯, 양송이 등에 높은 방제효과가 있었다고 보고하였으나, 현재까지 국내에서는 세균갈색무늬병에 대한 생물적 제제가 개발되어 상품화된 것은 없다.
재배중인 느타리 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균을 강하게 억제하는 길항세균 HC5를 선발하였으며, 생리·생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC5균주는 P. azotoformans로 동정되었다.
myo-Inositol, D-Saccharate, meso-Erythritol, Adonitol, D-Glucuronate, Itaconate, L-Histidine, Xylitol, D-Sorbitol, D-Galactose, L-Arabitol 그리고 L-Rhamnose등과 같은 산과 당을 이용하였고, Phenylacetate, L-Arabinose, Adipate, D-Glucose, D-Sucrose 그리고 D-Melibiose 등은 이용하지 못하였다(Table 1). 지방산 분석 결과 전체 지방산 중에서 Sum in Feature 3(16:1w7c/16:1 w6c), 16:0, Sum In Feature 8(18:1 w7)가 가장 높았고, 낮은 양의 10:0 지방산이 존재하였다(Table 2).
후속연구
azotoformans HC5를 양송이, 팽이버섯, 느타리에 처리한 결과 각각 78%, 73%, 71%의 방제효과를 보였다. 따라서 P. azotoformans HC5가 버섯 세균갈색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경 방제제가 될 수 있을 것으로 생각된다.
Lee 등[25]은 세균갈색무늬 병원균의 분비독소를 저해는 미생물인 Pseudomonas 속이 느타리, 팽이버섯, 양송이 등에 높은 방제효과가 있었다고 보고하였으나, 현재까지 국내에서는 세균갈색무늬병에 대한 생물적 제제가 개발되어 상품화된 것은 없다. 따라서 길항세균 HC5 균주의 항균활성 물질탐색 및 생산의 최적 조건 검토, 농가 편의성을 고려한 제형화 기술개발과 살포방법 등을 추가적으로 개발한다면 산업적으로 충분히 가치가 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
P. tolaasii는 어떤 버섯에 갈색무늬병을 일으키는가?
P. tolaasii는 느타리, 양송이, 표고 등에 갈색무늬병을 일으키며[6-9], 분류학적으로 버섯에서 분리되는 여러 종의 형광성 Pseudomonas 종과 매우 유사하여, 생리적인 특성 및 영양 요구성에 의한 방법으로는 동정하기가 쉽지 않다[1, 9]. 그리고 병징에 있어서는 P.
세균갈색무늬병은 언제 처음 보고되었는가?
이들 병원균은 Pseudomonas tolaasii, Pseudomonas agarici, Pseudomonas gingeri 그리고 병원성 Pseudomonas reactans 등으로 알려져 있다[1-3]. 세균갈색무늬병은 1915년 Tolaas에 의하여 처음으로 보고되었으며[4],1919년 Paine에 의하여 P. tolaasii로 명명되었다[5].
P. tolaasii에 의한 갈색무늬 병은 ginger blotch disease과 어떤 유사한 특성이 있는가?
gingeri에 의해 발생되는 옅은 갈색(yellow-brown)의 반점병인 ginger blotch disease와 유사한 특성을 갖는다[2, 10]. 이 병은 병 발생의 예측이 매우 어렵고, 병 발생 후에는 방제가 거의 불가능하며, 한번 발생하면 재배사 전체로 급격하게 전염되어 심한 경우에는 버섯을 전혀 수확하지 못하게 하는 특성이 있다[7, 11]. P.
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