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문제 정의
- 이 DPPH 억제에 대한 주요 활성성분으로 flavanonol, flavanone, proanthocyanidin들을 분리하여, 그 중 catechin이 가장 강한 활성을 나타낸다고 보고가 있다. 따라서 본 연구에서는 유백피 추출물을 천연 항산화 소재로서 식품 및 한약에 활용하기 위하여 인체에 유해한 유기용 매들을 배제하고 물과 에탄올만을 용매로 사용하여 최적의 추출용매조건을 찾고자 하였다.
- 본 연구에서는 인체에 안전한 천연항산화소재의 개발을 위하여, 식품공전에 식품으로 사용할 수 있는 원료의 목록으로 등재 되어 있는 유백피로부터 물과 에탄올 혼합용매를 사용하여 최적의 추출조건을 알아보고자, 에탄올 함량별로 추출하여 수율, 폴리페놀 함량 및 카테킨 함량을 분석하고, DPPH 라디칼, ABTS 라디칼 및 LPO 억제활성 시험을 통하여 항산화활성을 조사하였다.
제안 방법
- ABTS radical assay는 보고된 문헌들16,17)을 응용하여 수행 하였다. 즉, 추출물 30 μL에 ABTS radical 용액 3 ml를 첨가하여 734nm에서 측정하였으며 대조구로는 BHT를 사용하였다.
- LAE 750 μL에 시료 50 μL 및 증류수 200μL 가하고 혼합한 후 실온, 어두운 곳에서 72시간 과산화를 유도시켰다.
- 추출물에 의한 라디칼소거활성 측정은 ammonium thiocyanate를 사용하는 방법18,19)에 의하여 측정되었다. Linoleic acid (1.563 g)와 Tween20 (0.391 g)혼합물에 30% (v/v) ethanol (100 ml)을 가하고 잘 혼합하여 linoleic acid emulsion(LAE)을 제조하였다. LAE 750 μL에 시료 50 μL 및 증류수 200μL 가하고 혼합한 후 실온, 어두운 곳에서 72시간 과산화를 유도시켰다.
- UV-VIS 분광광도계는 Cary 300 UV-Vis spectrophotometer (Agilent Technologies Inc., USA)를 사용하였고, HPLC 분석에는 Waters 2695 및 996 photodiode array 검출기 (Waters Co., USA)에 의하여 수행되었다.
- 약재 100 g에 1.5 L의 물, 에탄올 또는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 에탄올 함유 수용액을 가한 다음 85℃에서 3시간씩 환류 추출하였다. 이 과정으로 얻은 추출액을 여과(Whatman No.
- 5 L의 물, 에탄올 또는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 에탄올 함유 수용액을 가한 다음 85℃에서 3시간씩 환류 추출하였다. 이 과정으로 얻은 추출액을 여과(Whatman No. 4)하고 45℃에서 감압농축, 건조하여 분석 및 항산화활성시험시료로 사용하였다.
- 6 mm; particle size 5 μm, Phenomenex, USA)를 사용하였고, 컬럼 오븐은 30℃를 유지하였다. 이동상은 HPLC용 물과 메탄올의 혼합용매의 비율을 변화시킨 gradient solvent system (10% ⇀ 50%메탄올, 시간: 40분, 유속: 1 ml/min)을 사용하였고, 유백피 추출물들은 50%메탄올에 용해하여 50 mg/ml의 농도로 조제하였으며, 0.45㎛ filter로 여과한 후 10 ㎕를 주입하여 분석하였다. 이때, PDA 검출기의 UV 파장은 280 nm였다.
대상 데이터
- 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH·), linoleic acid, Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt) (ABTS)은 Sigma 사에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 유백피는 정도약업에서 구입하여 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다.
- 즉, 추출물 30 μL에 ABTS radical 용액 3 ml를 첨가하여 734nm에서 측정하였으며 대조구로는 BHT를 사용하였다.
- 추출물 0.2 ml에 60 μM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 2.8 ml를 첨가하여 30분간 반응시켜 515 nm에서 측정하였으며 대조구로는 butylated hydroxytoluene (BHT)를 사용하였다.
데이터처리
- The vertical bars represent mean±SD (n=3) and those with different small alphabetical letters within the same compound contents are significantly different by Duncan’s multiple test (p<0.05).
- 또한 SAS 통계 프로그램 (SAS Institute, Cary, NC. USA)을 이용하여 분산분석을 실시하여 유의적인 차이가 발견된 경우 Duncan’s new multiple range test 에 의해 평균값에 대한 유의성을 검증하였다.
- 모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- DPPH radical 소거활성은 Williams 등15)의 방법을 이용하였다. 추출물 0.
- Peroxyl radical (LOO·)을 생성하기 위하여 리놀레익산 에멀젼에서의 지질과산화(Lipid peroxidation)방법이 사용되었다.
- 총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등14)의 방법을 이용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출물 0.
- Peroxyl radical (LOO·)을 생성하기 위하여 리놀레익산 에멀젼에서의 지질과산화(Lipid peroxidation)방법이 사용되었다. 추출물에 의한 라디칼소거활성 측정은 ammonium thiocyanate를 사용하는 방법18,19)에 의하여 측정되었다. Linoleic acid (1.
성능/효과
- 20% 이상의 에탄올 추출물들은 IC50이 8.53 μg/ml에서 12.00 μg/ml의 범위로 어느 정도 유사한 수준에서의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었으나, 그 이하인 10% 에탄올 및 물 추출물은 각각 IC50이 21.10 μg/ml 및 25.42 μg/ml로 약 2배 이상 활성에 큰 차이를 가지고 약하게 나타났다.
- 15분에서 나타났다. Catechin 및 epicatechin의 HPLC 정량을 위한 검량선의 상관관계는 0.999 이상으로 매우 적합하였다. Catechin에 대한 검량선은 Y=29154X + 35.
- Catechin의 함량은 에탄올 추출물(4.27 mg/g)이 가장 높게 나타났고, 다음으로 90% 에탄올 추출물(2.92 mg/g) > 80% 에탄올 추출물(2.45 mg/g) > 70% 에탄올 추출물(1.73 mg/g) > 50% 에탄올 추출물(1.54 mg/g) > 60% 에탄올 추출물(1.40 mg/g) > 30% 에탄올 추출물(1.17 mg/g) > 40% 에탄올 추출물(0.98 mg/g) > 20% 에탄올 추출물(0.65 mg/g) > 물 추출물(0.52 mg/g)순으로 높게 나타났고, 10% 에탄올 추출물 (0.15 mg/g)이 가장 낮게 나타났다.
- DPPH 라디칼 소거활성과 마찬가지로 ABTS라디칼 소거활성도 20% 이상의 에탄올 추출물들은 IC50이 3.08 μg/ml에서 4.91 μg/ml의 범위로 어느 정도 유사한 수준에서의 ABTS 라디칼 소거활성을 나타내었으나, 그 이하인 10% 에탄올 및 물 추출물은 각각 IC50이 11.02 μg/ml 및 13.02 μg/ml로 약 2배 이상 활성에 큰 차이를 가지고 약하게 나타났다.
- Epicatechin은 에탄올 추출물(0.27 mg/g)이 가장 높게 나타났고, 다음으로는 90% 에탄올 추출물(0.21 mg/g) > 80% 에탄올 추출물(0.20 mg/g) > 50% 에탄올 추출물(0.20 mg/g) > 60% 에탄올 추출물(0.20 mg/g) > 70% 에탄올 추출물(0.19 mg/g) > 30% 에탄올 추출물(0.18 mg/g) > 40% 에탄올 추출물(0.14 mg/g) > 20% 에탄올 추출물(0.07 mg/g) > 10% 에탄올 추출물(0.02 mg/g) 순으로 높게 나타났고, 물 추출물에서 epicatechin은 검출되지 않았다.
- LPO 억제활성은 물 추출물의 IC50이 28.65μg/ml인 값과 비교하여 30%까지 에탄올 함량이 증가함에 따라 급격히 증가하였고 30%에서 60% 에탄올 추출물까지는 IC50이 10.13 μg/ml에서 10.73 μg/ml 범위로 유사한 수준으로, 다음으로 70%에서 100% 에탄올 추출물까지 IC50이 7.96 μg/ml에서 8.63 μg/ml 범위로 유사한 수준으로 나타났다.
- 결론적으로 수율과 항산화활성 및 에탄올에 대한 비용을 고려하면 30% 에탄올이 천연항산화소재로서의 유백피 추출물의 제조를 위한 최적의 용매이다.
- 9997 이었다[Y= 피크면적, X= 표준품의 함량 (mg/ml)]. 모든 추출물에서 epicatechin에 비하여 catechin 함량이 최소 5배 이상 월등히 높게 나타났다 (Fig. 4).
- 이러한 결과는 본 연구에서 폴리페놀함량 또한 물 추출물 보다 에탄올혼합용매 추출물에서 높게 나타난 결과와 부합한다. 본 연구결과로부터 수율과 항산화력을 모두 고려하면 물보다는 물과 에탄올 혼합용매 추출물이, 특히 30% 에탄올 추출물이 보다 적절한 용매로 제안된다.
- 은 유백피를 물, 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올로 추출하여 항산화력을 평가한 결과 물 추출물이 가장 높은 활성을 나타내었다고 보고 하였다. 본 연구에서는 물 추출물 보다 물과 에탄올혼합용매 추출물들이 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 본 연구에서 폴리페놀함량 또한 물 추출물 보다 에탄올혼합용매 추출물에서 높게 나타난 결과와 부합한다.
- 6 mg/g extract 순으로 높게 나타났다. 상대적으로 물 추출물과 10% 에탄올 추출물은 각각 109.0 mg/g과 147.4 mg/g으로 다른 추출물들과 비교하여 현저하게 가장 낮은 총 폴리페놀 함량을 나타내었다.
- 에탄올 함량별 유백피 추출물들 중 DPPH 라디칼 소거활성은 60% 에탄올 추출물(IC50, 8.53 μg/ml)이 가장 강하게 나타났으며, BHT (IC50, 9.31 μg/ml) 보다도 강하게 나타났다.
- 에탄올 함량별 유백피 추출물들 중 DPPH 라디칼 소거활성은 에탄올 추출물(IC50, 8.53 μg/ml)이 가장 강하게 나타났으며, BHT (IC50, 9.31 μg/ml) 보다도 강하게 나타났다.
- 에탄올 함량별 유백피 추출물들 중 LPO 억제활성은 70% 에탄올 추출물(IC50, 7.96 μg/ml)이 가장 강하게 나타났으며, BHT (IC50, 8.27 μg/ml)과 유사한 수준으로 나타났다.
- 연구결과 수율은 물 추출물, 20% 에탄올 추출물과 30% 에탄올 추출물이 유사한 수준으로 가장 높게 나타났고, 총 폴리페놀함량은 30% 에탄올 추출물이 다른 추출물들에 비교하여 다른 용매 추출물들과 비교하여 월등히 가장 높게 나타났으며, 따라서 총 폴리페놀로서의 수율 또한 30% 에탄올 추출물에서 모든 추출물과 비교하여 월등히 높게 나타났다.
- 에탄올 함량별 유백피 추출물의 수율과 총 페놀함량은 Table 1과 같다. 용매별 추출물의 수율은 물 추출물이 8.9%로 제일 높았으며, 다음으로는 20% 에탄올과 30% 에탄올이 각각 8.6%와 8.5%로 유사한 수준으로, 그 다음의 70% 에탄올 추출물 7.1% 보다 월등히 높게 나타났다.
- 02 mg/g) 순으로 높게 나타났고, 물 추출물에서 epicatechin은 검출되지 않았다. 전체적으로 추출용매의 에탄올 함량이 높을수록 catechin과 epicatechin의 함량이 증가하였다.
- 총 폴리페놀 함량으로서의 수율은 30% 에탄올 추출물에서 3.0%로 가장 높으며, 다음으로는 20% 에탄올 추출물에서 2.8%로 유사한 수준으로 높으며, 그 다음으로는 40% 에탄올 추출물이 1.9%로 현저한 차이를 나타낸다. 폴리페놀은 항산화 효과 뿐만 아니라, 항박테리아, 항염, 항알러지, 항균 등 많은 생리활성26)과 관련되어 있다.
- . 총 폴리페놀함량은 30% 에탄올 추출물이 353.2 mg/g으로 제일 높았으며, 다음으로는 20% 에탄올 추출물이 322.9 mg/g, 40% 에탄올 추출물이 278.6 mg/g extract 순으로 높게 나타났다. 상대적으로 물 추출물과 10% 에탄올 추출물은 각각 109.
- 추출물들의 ABTS 라디칼 소거 활성은 60% > 30% > 40% > 50% > 100% > 90%> 70% > 80% > 20% > 10% 에탄올 추출물 순으로 높게 나타났고 물 추출물이 가장 낮게 나타났다.
- 추출물들의 LPO 억제활성은 70% > 80% > 90% > 100%> 60% > 50% > 40% > 30% > 20% > 10% 에탄올 추출물 순으로 높게 나타났고 물 추출물이 가장 낮게 나타났다.
- 항산화활성은 물 추출물로부터 에탄올함량이 30%로 증가함에 따라 활성이 급격히 증가하였고, 30%에서 100%까지 에탄올 함량이 증가함에 따라서는 큰 차이가 없었다.
후속연구
- 이 유백피로 부터 DPPH 억제활성을 갖는 성분들을 분리하여, 그중 가장 강한 활성성분으로 보고한 카테킨은, 본 실험에서 폴리페놀 함량이나 항산화활성과는 비례관계에 있지 않는 것으로 나타났다. 따라서 품질관리를 위한 지표성분으로서의 활용을 위해서는 권 등이 분리한 카테킨외의 다른 성분들을 포함하여 새로운 활성성분들을 추적, 분리를 위한 추가 연구가 필요하다.
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