Ginsenoside Rg3는 홍삼으로부터 추출한 활성 성분들 중 하나로 한방 의학에선 원기를 회복시키는 약제로 잘 알려져 있는 인체에 유효한 화학 성분이다. Rg3는 지금까지 많은 연구들에 의하여 다양한 암세포로부터 강력한 항암효과를 가진다고 알려져 있다. 그러나 Rg3가 악성 흑색종 세포에서 어떻게 세포사멸을 유도하는지에 대한 작용 기작은 명백하게 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 ginsenoside Rg3가 B16F10 흑색종 세포에서 세포 사멸 유도 활성 및 기전에 관한 영향을 조사하였다. 세포 생존력을 MTT assay 법으로 수행한 결과, B16F10 세포에선 농도 의존적으로 세포증식 저해 효과가 나타났고 정상세포인 EA.hy.926 과 NIH3T3 에서는 나타나지 않았다. B1610 세포에 Rg3를 농도 별로 처리 후, TUNEL 염색을 한 결과 세포사멸이 농도 의존적으로 증가 하는 것을 확인 할 수 있었다. Western blot 분석을 실시한 결과, Rg3를 처리한 B16F10 세포에서 p-FAK, Bcl-2, pro-caspase3 단백질들의 발현이 감소 되었고 이와 반대로 Bax, p-p38의 발현은 증가되었다. 따라서, 본 연구에서는 Rg3가 B16F10 흑색종 세포에서 항암제의 agent로써 사용 될 수 있다는 것을 입증하였다.
Ginsenoside Rg3는 홍삼으로부터 추출한 활성 성분들 중 하나로 한방 의학에선 원기를 회복시키는 약제로 잘 알려져 있는 인체에 유효한 화학 성분이다. Rg3는 지금까지 많은 연구들에 의하여 다양한 암세포로부터 강력한 항암효과를 가진다고 알려져 있다. 그러나 Rg3가 악성 흑색종 세포에서 어떻게 세포사멸을 유도하는지에 대한 작용 기작은 명백하게 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 ginsenoside Rg3가 B16F10 흑색종 세포에서 세포 사멸 유도 활성 및 기전에 관한 영향을 조사하였다. 세포 생존력을 MTT assay 법으로 수행한 결과, B16F10 세포에선 농도 의존적으로 세포증식 저해 효과가 나타났고 정상세포인 EA.hy.926 과 NIH3T3 에서는 나타나지 않았다. B1610 세포에 Rg3를 농도 별로 처리 후, TUNEL 염색을 한 결과 세포사멸이 농도 의존적으로 증가 하는 것을 확인 할 수 있었다. Western blot 분석을 실시한 결과, Rg3를 처리한 B16F10 세포에서 p-FAK, Bcl-2, pro-caspase3 단백질들의 발현이 감소 되었고 이와 반대로 Bax, p-p38의 발현은 증가되었다. 따라서, 본 연구에서는 Rg3가 B16F10 흑색종 세포에서 항암제의 agent로써 사용 될 수 있다는 것을 입증하였다.
Ginsenoside Rg3 is one of the active ingredients extracted from red ginseng, and it is an effective chemical component of the human body and well known in herbal medicine as a restorative agent. Several studies have shown that Rg3 has a potent anti-tumor effect on various cancer cell lines. However,...
Ginsenoside Rg3 is one of the active ingredients extracted from red ginseng, and it is an effective chemical component of the human body and well known in herbal medicine as a restorative agent. Several studies have shown that Rg3 has a potent anti-tumor effect on various cancer cell lines. However, Rg3-induced apoptosis in B16F10 melanoma cancer cells is not well understood. In the present study, we tested whether ginsenoside Rg3 could induce apoptosis in B16F10 melanoma cells. We found that Rg3 could inhibit B16F10 melanoma cell viability in a dose-dependent manner, but not normal cells, such as EA.hy.926 and NIH3T3 cells. We also found that Rg3 could induce apoptosis in B16F10 melanoma cells using tunnel-staining assay in a dose-dependent manner. Rg3 treatment induces the phosphorylation of p38 and the expression of Bax, but it inhibits the expressions of the phosphorylation of focal adhesion kinase Bcl2 and pro-caspase3. Taken together, our data suggest that Rg3 could be useful as an anti-cancer agent in B16F10 melanoma cells.
Ginsenoside Rg3 is one of the active ingredients extracted from red ginseng, and it is an effective chemical component of the human body and well known in herbal medicine as a restorative agent. Several studies have shown that Rg3 has a potent anti-tumor effect on various cancer cell lines. However, Rg3-induced apoptosis in B16F10 melanoma cancer cells is not well understood. In the present study, we tested whether ginsenoside Rg3 could induce apoptosis in B16F10 melanoma cells. We found that Rg3 could inhibit B16F10 melanoma cell viability in a dose-dependent manner, but not normal cells, such as EA.hy.926 and NIH3T3 cells. We also found that Rg3 could induce apoptosis in B16F10 melanoma cells using tunnel-staining assay in a dose-dependent manner. Rg3 treatment induces the phosphorylation of p38 and the expression of Bax, but it inhibits the expressions of the phosphorylation of focal adhesion kinase Bcl2 and pro-caspase3. Taken together, our data suggest that Rg3 could be useful as an anti-cancer agent in B16F10 melanoma cells.
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문제 정의
Rg3에 의한 B16F10의 세포사멸 효과의 기전을 알아보기 위해 apoptosis 관련 단백질에 관하여 알아보았다. FAK (focal adhesion kinase)은 암세포 초기 이동에 중요한 단백질로서 FAK이 세포간의 상호작용에 의하여 활성화 되면 세포외 matrix와 접촉하는 세포 내 신호전달 경로를 유도하여 세포의 이동을 촉진하므로 암세포의 전이를 가능하게 한다.
그러나 gin-senoside Rg3가 악성 흑색종 세포에서 성장과 전이를 어떤 경로를 통해 억제하는지에 대한 정확한 기전과 B16F10 흑색종 세포의 세포사멸에 관련되는 단백질에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 ginsenoside Rg3가 악성 흑색종 세포증식에 미치는 영향과 관련되는 단백질에 대한 연구를 그리고 다른 정상 세포와 비교하여 확인하고자 한다.
제안 방법
B16F10 cells를 96-well plates에 각 well 당 4×103으로 100 μl 의 medium과 함께 분주하고 5% CO2가 공급되는 incubator 에서 배양한 뒤, 각 well 마다 Rg3를 20, 40, 80, 100ĪμM) 농도로 처리하고 24시간, 48시간 배양하였다.
B16F10 세포를 24시간 배양 후 Rg3를 20, 40, 80, 100 (μM) 농도 별로 처리하고 48시간 뒤 Western blot을 진행하였다.
DAPI staining은 1 μg/ml 의 DAPI가 포함되어있는 mounting solution을 떨어트리고 형광 현미경을 이용하여 200배율로 무작위적으로 3개의 필드를 관찰하여 positive cell 숫자를 확인 후 평균치를 사용하였다.
Rg3가 B16F10 흑색종 세포의 세포증식 억제 효과를 가짐을 MTT assay를 통하여 확인하였다. 더 나아가 과연 Rg3가 흑색종 세포가 아닌 정상 세포의 세포증식에도 저해 효과가 있는지를 알아보기 위해, HUVEC 세포로부터 분화된 인간 내피세포인 EA.
Rg3에 의한 B16F10 세포의 세포사멸 효과를 확인하기 위해 DAPI 와 tunnel staining을 시행하였다. Rg3를 50, 100 μM 처리한 군에서 control과 비교 시 세포의 수가 줄어 들었다는 것을 DAPI 염색결과 확인할 수 있었다(Fig.
Rg3을 EA.hy.926 세포와 NIH3T3 세포에 0, 20, 40, 80, 100 (μM) 농도로 각각 24시간, 48시간 처리 후 MTT assay를 실행하였다.
배양 후, Rg3를 50, 100 (μM) 농도로 처리 하고 36시간 뒤 4% paraformaldehyde로 상온에서 10분간 고정시켜주었다. TUNEL assays는 Red in situ apoptosis Detection kit (Millipore Corporation, Billerica, MA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. DAPI staining은 1 μg/ml 의 DAPI가 포함되어있는 mounting solution을 떨어트리고 형광 현미경을 이용하여 200배율로 무작위적으로 3개의 필드를 관찰하여 positive cell 숫자를 확인 후 평균치를 사용하였다.
ginsenoside Rg3가 B16F10 세포증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Rg3를 농도 별로 처리하여 MTT assay 를 실행하였다. Rg3를 농도 별로 각각 24, 48시간 처리한 결과 40 μM에서 유의적으로 세포증식이 억제 효과를 확인하였고, 100 μM 에서 24시간 처리 하였을 때는 21%, 48시간 처리 하였을 때는 50%의 세포 증식 억제 효과를 확인하였다(Fig.
sample은 100℃에서 10분간 가열하여 얻었고 50 μg의 단백질을 15% SDS-PAGE gel 에의해서 크기 별로 분류하였다.
그 뒤 β-actin (1:500), FAK (1:500) antibodies (santa cruz biotechnoloy) 와 phosho-FAK (1:1,000), Bax (1:1,000), procaspase (1:1,000), Bcl-2 (1:1,000), p38 (1:1,000), phosho-p38 (1:1,000) primary antibodies (Cell signaling Technology) 를 하룻동안 반응 시켰다. 그 후 anti-mouse (1:2,000) 또는 anti-rabbit (1:3,000) secondary anti-bodies를 이용하여 상온에서 1시간 반응 시킨 후 ECL용액 (GE Healthcare)을 이용하여 시각화 하였다.
Rg3가 B16F10 흑색종 세포의 세포증식 억제 효과를 가짐을 MTT assay를 통하여 확인하였다. 더 나아가 과연 Rg3가 흑색종 세포가 아닌 정상 세포의 세포증식에도 저해 효과가 있는지를 알아보기 위해, HUVEC 세포로부터 분화된 인간 내피세포인 EA.hy.926 세포와 쥐 배아 섬유아세포인 NIH3T3세포를 사용하여 실험을 진행하였다. Rg3을 EA.
배양 후 medium을 제거하고 MTT Ī3-Ī4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphnyltetrazolium bromide) 20 μl/well 넣고 incubator에서 3시간 배양한 뒤 iso-propyl alcohol 을 200 μl/well 넣고 1시간 뒤 infinite reader를 이용하여 595nm에서 세포 생존능력을 측정했다.
배양 후, Rg3를 50, 100 (μM) 농도로 처리 하고 36시간 뒤 4% paraformaldehyde로 상온에서 10분간 고정시켜주었다.
대상 데이터
B16F10, NIH3T3 세포는 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양 받았고 EA.hy.926 세포는 University of North Carolina (UNC) 대학교로부터 분양 받았다. Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), penicillin, streptomycin, fetal bovine serum (FBS), Newborn Calf Serum (NBCS)는 Gibco Life Technologies (Grand Island, NY)로부터 구입하였다.
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), penicillin, streptomycin, fetal bovine serum (FBS), Newborn Calf Serum (NBCS)는 Gibco Life Technologies (Grand Island, NY)로부터 구입하였다.
NIH3T3은 10% Newborn Calf Serum, 100 U/ml penicillin 그리고 100 μg/ml streptomycin을 포함하는 DMEM-high medium 에 5% CO2가 공급되는 37℃ incubator 에서 배양하였다.
성능/효과
Fig. 4A의 결과를 정량화 한 결과, Rg3를 50, 100 μM 처리 후 apoptotic cell이 각각 6%, 27.6% 의 비율을 보인 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4B).
Rg3를 50, 100 μM 처리한 군에서 control과 비교 시 세포의 수가 줄어 들었다는 것을 DAPI 염색결과 확인할 수 있었다(Fig. 4A).
Rg3를 농도 별로 각각 24, 48시간 처리한 결과 40 μM에서 유의적으로 세포증식이 억제 효과를 확인하였고, 100 μM 에서 24시간 처리 하였을 때는 21%, 48시간 처리 하였을 때는 50%의 세포 증식 억제 효과를 확인하였다(Fig. 2A).
Tunel은 TdT (terminal deocynucleotidyl transferase)라는 효소를 이용해 UTP (uridine triphosphate)를 DNA 조각 말단에 붙여그 DNA fragmentaion이 일어나는지 여부를 파악하는 실험 방법으로서 세포사멸에 의한 DAN fragmentation 정도를 측정할 수 있다. Tunel 염색 결과, Rg3을 처리한 군에서 control 군에 비해 Tunel positive한 이미지 결과가 많이 나타남을 확인하였고, 형광 광도 또한 Rg3를 처리한 군에서 농도에 의존적으로 강해짐을 확인하였다(Fig. 4A). Fig.
그 결과, EA.hy.926세포를 24시간 배양 했을 때, control에서의 세포 생존능력은 85%였고, Rg3를 100 μM 처리 했을 때는 75%였다.
그리고 Rg3를 100 μM 농도로 시간 별로 처리한 결과 12시간 처리 후 20%, 36시간 처리 후 40%, 그리고 48시간 처리 후 56%로 control 세포에 비해 시간-의존적으로 세포증식 속도가 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 2B).
세포사멸 관련 단백질들을 조사해본 결과, Rg3을 농도별로 처리하였을 때 control에 비해 FAK의 인산 화가 점진적으로 줄어드는 것을 확인하였고, Bcl2와 pro-caspase3 단백질의 발현도 줄어듬을 확인하였다. 그리고 p38단백질의 인산화와 Bax 단백질의 발현은 증가함을 확인하였다. (Fig.
2B). 상기의 결과로서 Rg3가 농도, 시간 의존적으로 B16F10 세포의 세포증식 억제 효과가 있음을 확인하였다.
상기의 결과로서 Rg3가 농도의존적으로 B16F10의 세포사멸을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로서, Rg3가 B16F10세포가 아닌 정상세포인 EA.hy.926, NIH3T3의 세포증식에는 영향을 미치지 않는 다는 것을 확인할 수 있었다.
5). 상기의 결과로서, Rg3는 FAK의 활성을 억제하고 anti-apoptotic proteins의 발현 및 활성을 감소시키고 proapoptotic proteins의 발현 및 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.
caspase3는 apoptosis 과정에 있어서 primary effector caspase 중 하나이고 암의 진행에 있어서 중요한 역할을 한다. 세포사멸 관련 단백질들을 조사해본 결과, Rg3을 농도별로 처리하였을 때 control에 비해 FAK의 인산 화가 점진적으로 줄어드는 것을 확인하였고, Bcl2와 pro-caspase3 단백질의 발현도 줄어듬을 확인하였다. 그리고 p38단백질의 인산화와 Bax 단백질의 발현은 증가함을 확인하였다.
후속연구
따라서 최근 항암제들은 동물이나 식물로부터 얻어낸 천연 화합물을 사용하여 부작용은 줄이고 항암 효과는 높이는 방향으로 이동하고 있다[14]. 악성 흑색종 발병 시 환자 스스로 몸의 면역력을 강화시켜 질병에 대한 치유능력을 향상시키는 것이 중요한데 합성 항암제의 경우 환자의 면역력을 저하시킬 수 있기 때문에 악성 흑색종 치료를 위한 천연화합물에 대한 연구가 더 많이 이루어져야 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
ginsenoside Rg3는 무엇인가?
그 중 ginsenoside Rg3는 인삼의 주요 활성 성분으로써 이전의 연구들은 Rg3가 피부암, 폐암, 전립선암 등의 세포사멸을 유도하여 침투뿐만 아니라 전이 억제 효과를 가지고 쥐에서 면역기능을 향상 시킨다는 것을 밝혀냈다[3]. 그러나 ginsenoside Rg3가 악성 흑색종 세포에서 성장과 전이를 어떤 경로를 통해 억제하는지에 대한 정확한 기전과 B16F10 흑색종 세포의 세포사멸에 관련되는 단백질에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
ginsenoside Rg3와 악성 흑생종 세포의 연관성에 대해서 기존 연구의 한계는 무엇인가?
그 중 ginsenoside Rg3는 인삼의 주요 활성 성분으로써 이전의 연구들은 Rg3가 피부암, 폐암, 전립선암 등의 세포사멸을 유도하여 침투뿐만 아니라 전이 억제 효과를 가지고 쥐에서 면역기능을 향상 시킨다는 것을 밝혀냈다[3]. 그러나 ginsenoside Rg3가 악성 흑색종 세포에서 성장과 전이를 어떤 경로를 통해 억제하는지에 대한 정확한 기전과 B16F10 흑색종 세포의 세포사멸에 관련되는 단백질에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 ginsenoside Rg3가 악성 흑색종 세포증식에 미치는 영향과 관련되는 단백질에 대한 연구를 그리고 다른 정상 세포와 비교하여 확인하고자 한다.
ginsenoside Rg3에 의한 B16F10의 세포사멸 효과에 관여하는 apoptosis 관련 단백질 변화는 어떠한가?
5). 상기의 결과로서, Rg3는 FAK의 활성을 억제하고 anti- apoptotic proteins의 발현 및 활성을 감소시키고 proapoptotic proteins의 발현 및 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.
참고문헌 (14)
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