[논문]인간 대장암 HT-29 세포에서 제주조릿대의 세포사멸 효과

변지희; 김민영

doi:10.5352/jls.2014.24.9.1012

인간 대장암 HT-29 세포에서 제주조릿대의 세포사멸 효과
Apoptotic Effect of Sasa quelpaertensis Nakai in Human Colon Cancer HT-29 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.24 no.9 = no.173, 2014년, pp.1012 - 1018

변지희 (제주대학교 생명공학부 독성학 실험실) , 김민영 (제주대학교 생명공학부 독성학 실험실)

초록
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제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 한라산에 넓게 분포되어 자생하는 식물로 최근 연구에서 항염증, 항당뇨, 항산화, 항암 효능을 가지는 것으로 알려져 있으나 대장암에서의 항암 효능 및 그에 따른 mechanism에 대해서는 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 인간 대장암 HT-29 세포를 대상으로 제주조릿대에 의한 항암작용과 기전에 대해 조사하였다. 제주조릿대에 의한 HT-29 세포의 증식 억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있음을 DNA fragmentation와 flow cytometry 분석에 의한 sub-G1기의 세포빈도의 증가로 확인하였다. 제주조릿대에 의한 apoptosis 유발은 HT-29 세포의 S arrest 현상을 동반하였을 뿐만 아니라 발생한 산화질소의 증가와 anti-apoptotic factor인 IAP family (survivin, XIAP, cIAP-1, cIAP-2) 발현이 감소함으로써 촉진되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 제주조릿대가 대장암에 대한 치료제로서의 사용 가능성을 확인할 수 있었지만 이를 입증하기 위해서는 더 자세한 항암기전에 관한 연구가 진행되어야 한다고 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Sasa quelpaertensis Nakai (Korean name, Jeju-Joritdae) is one of the most abundant plants on Mt. Halla, Jeju Island, and it has long been used in traditional medicines. Recent studies have reported it as possessing various beneficial functions, including anti-inflammatory, anti-diabetic, anti-hypertension, anti-gastritis, anti-oxidant, and anti-cancer effects. However, the molecular mechanisms of its anti-cancer activity have not been clearly elucidated. In this study, we investigated the anti-cancer effects and mechanism of S. quelpaertensis on human colon cancer HT-29 cells. Cell growth inhibition by S. quelpaertensis was determined by MTT assay. Apoptosis was performed by DNA fragmentation, flow cytometry with propidium iodide staining (PI), and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) to confirm the anti-apoptotic factors, such as inhibitor of apoptosis (IAP) family members. $NO^{\bullet}$ production was determined by Griess assay. S. quelpaertensis treatment resulted in the time- and dose-dependent inhibition of the cell viability of HT-29 cells by inducing apoptosis, as evidenced by the accumulation of the sub-G1 cell population stained by PI, as well as the ladder-like DNA fragmentation in a dose-dependent manner. S. quelpaertensis-inducing apoptosis was accompanied by the induction of S cell cycle arrests, increasing $NO^{\bullet}$ concentrations, and the down-regulation of IAPs, including X-chromosome-linked IAP (XIAP), cellular IAP-1 (cIAP-1), cIAP-2, and survivin. Taken together, these findings have important implications for future clinical developments of S. quelpaertensis in colon cancer treatment.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

제주조릿대는 다양한 생리활성을 가져 의약품 소재, 기능성 식품 원료 등 고효율 자원화 가능성이 높은 것으로 알려져 있으나, 대장암에 대한 항암효과 및 분자생물학적 기전에 대한 구체적인 연구는 미흡한 실정이다[12, 13, 15, 17, 39]. 따라서 본 연구에서는 제주조릿대에 의한 인간 대장암 HT-29 세포 증식 억제 및 apoptosis유발 여부를 확인하고, 유발된 apoptosis가 NO^․발생과 IAP family의 발현 변화에 어떤 연관성을 가지고 있는지 조사함으로써 제주조릿대의 자원화 방안과 부작용이 적고 우수한 천연 항암 소재로서 개발 가능성을 검토하고자 한다.

제안 방법

하지만 암세포인 경우 세포주기가 제대로 진행되지 않아 계속 증식만 하게 된다고 알려져 있어, 최근 세포주기를 조절함으로써 암세포 사멸을 유도시키는 연구가 진행되고 있다[14, 35]. 따라서 제주조릿대에 의한 세포 증식 억제 효과가 apoptosis와 연관이 있는지 확인하기 위하여 HT-29 세포에 72시간 동안 농도별로 처리한 후 flow cytometry를 통해 세포주기를 분석하였다. 그 결과 G0/G1기는 대조군일 때 79.
IAP family 인자들은 apoptosis 유발에 중요한 역할을 하는 caspase와 직·간접적인 결합함으로써 caspase의 활성을 억제하여 apoptosis 유발을 억제하는 것으로 알려져 있다[3, 7]. 이에 IAP family의 구성원인 survivin, XIAP, cIAP-1 및 cIAP-2가 제주조릿대에 의한 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지 mRNA 수준에서 확인하였다. 그 결과 Fig.

대상 데이터

본 실험에 사용하는 제주조릿대는 2012년 한라산에서 채집하여 60℃에서 24시간 동안 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. 분쇄한 제주조릿대를 각각 95℃의 물과 80℃의 70% 에탄올에서 6시간 동안 3회 반복 추출하여 여과 및 농축 후 동결 건조 하여 -20℃에 보관하였다.
본 실험에 사용한 인간 대장암 HT-29 세포는 Massachusetts Institute of Technology (MIT)의 G. N. Wogan 박사님 (Cambridge, MA, USA)으로부터 분양 받았으며, 10% heatinactivated fetal bovine serum (FBS) 및 100 units/ml penicillin-streptomycin및 L-glutamine을 첨가한 McCoy’s 5A 배지를 사용하여 37℃ 습윤한 CO₂ incubator (5% CO₂, 95% air) 에서 배양하였다. 세포가 배양용기의 80%정도 증식 시 적정 수의 세포를 유지하기 위해 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.

데이터처리

모든 실험결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계분석은SPSS 18.0 (PASW Statistics 18; IMB Co., Armonk, NY, USA)을 이용하여 Student’s t-test에 의해 p<0.05인 경우 유의한 것으로 판정하였다.

성능/효과

Hsu 등[11]과 Park 등[28]은 survivin의 발현을 조절함으로써 대장암 세포의 사멸을 유도했다는 보고가 있으며, 이외에도 XIAP, cIAP-1, cIAP-2 등의 IAP family을 조절함으로써 암세포의 사멸을 유도한다는 연구 결과가 있었다[2, 10, 32]. 따라서 caspase의 활성을 억제하는 IAP family 발현이 전사수준에서 모두 농도 의존적으로 억제되어 제주조릿대에 의한 apoptosis 유도에 중요한 역할을 한 것으로 생각된다.
이상의 결과를 종합해 보면 제주조릿대에 의한 인간 대장암 HT-29 세포의 증식 억제가 apoptosis 유도에 의한 것임을 알 수 있었고 flow cytometry 분석을 통해 세포주기의 S기와 apoptosis가 유도된 sub-G1기의 세포빈도가 증가하는 것을 확인함으로써 S arrest 현상에 의해 HT-29 세포의 사멸이 유도되었음을 알 수 있었다. 또한 이러한 apoptosis는 NO^․의 생성과 IAP family 발현의 억제가 동반되었음을 확인할 수 있어, 이를 입증하기 위해서는 더 구체적인 연구가 지속될 필요가 있을 것으로 사료된다.
3 pmoles/10⁸ cells로 약 4배 가량 더 많이 발생하였음을 알 수 있었다. 이에 제주조릿대에 의해 발생된 고농도의 NO^․는 HT-29 세포에 대해 세포독성을 가진다고 생각되며 apoptosis 유발에 연관성이 있음을 알 수 있었다.

후속연구

이상의 결과를 종합해 보면 제주조릿대에 의한 인간 대장암 HT-29 세포의 증식 억제가 apoptosis 유도에 의한 것임을 알 수 있었고 flow cytometry 분석을 통해 세포주기의 S기와 apoptosis가 유도된 sub-G1기의 세포빈도가 증가하는 것을 확인함으로써 S arrest 현상에 의해 HT-29 세포의 사멸이 유도되었음을 알 수 있었다. 또한 이러한 apoptosis는 NO^․의 생성과 IAP family 발현의 억제가 동반되었음을 확인할 수 있어, 이를 입증하기 위해서는 더 구체적인 연구가 지속될 필요가 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	대장암의 생존율은?	암은 우리나라에서 가장 높은 사망 원인으로 알려져 있으며 특히 대장암인 경우 전 세계적으로 발병률이 높은 암 중 하나로서 유전적인 요인뿐만 아니라 식습관에 의한 환경적인 요인에도 발병되는 경우가 많은데 국내에서도 서구화된 식습관으로 인해 발병률이 증가하고 있다[21, 29, 37]. 대장암 치료에는 암 절제를 위한 외과적 수술, 방사선 치료, 화학용법 등이 사용되고 있으나 대장암에 대한 생존율은 약 50% 밖에 되지 않고, 항암제인 경우 암세포에 대한 선택성이 낮아 정상 세포에서도 사멸을 유도함으로써 심각한 부작용이 문제가 되고 있다[22, 31]. 따라서 최근에는 항암 치료에 대한 부작용을 최소화할 수 있는 천연생리활성물질을 사용하여 세포 내의 신호전달 물질의 조절과 암세포의 사멸 유도에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다[21, 22, 31].
	제주조릿대 추출물의 처리 농도에 따른 NO•발생량 증가로 보아 추출물이 HT-29 세포의 apoptosis에 미치는 영향은?	3 pmoles/108 cells로 약 4배 가량 더 많이 발생 하였음을 알 수 있었다. 이에 제주조릿대에 의해 발생된 고농도의 NO•는 HT-29 세포에 대해 세포독성을 가진다고 생각되며 apoptosis 유발에 연관성이 있음을 알 수 있었다.
	제주조릿대란?	한라산에만 자생하는 ‘벼과 대나무아과’의 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 생장이 빠르고 번식력이 강해 다른 식물을 고사시키고 광범위한 면적에 대규모로 자생하고 있는 식물로서 종 다양성 감소 등 생태계 파괴와 환경문제를 유발하고 있지만, p-coumaric acid, alkene glycoside, polysaccharide, tricin, flavonoid, polyphenol 등의 다양한 물질들이 함유되어 예로부터 당뇨병, 고혈압, 위염, 만성간염, 암에 효능이 있다고 알려져 왔다[1, 12, 13, 15, 26, 38]. 최근 연구에서도 제주조릿대 잎의 열수 추출물이AMP-activated protein kinase (AMPK) pathway를 활성화시켜 고칼로리식단으로 인한 비만을 제어함은 물론 멜라닌 합성을 억제하여 미백효과를 가진다는 결과가 보고되는 등의 다양한 연구가 이루어지고 있다[1, 15, 39].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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