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제안 방법
- 만들어진 cDNA를 주형으로 이용하여 TNF-α, IL-6, iNOS, COX-2, p21, p53, cyclin D1, Bcl-2 유전자를 polymerase chain reaction(PCR) 방법으로 특정 유전자 부위를 증폭하였다. Internal control은 housekeeping 유전자인 GAPDH(glyceral dehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하여 이들의 발현 정도를 비교하였고, 각 유전자의 primer sequence는 Table 1에 표기하였다. PCR은 automatic Bioneer thermocycler(Bioneer, Daejeon, Korea)로 증폭시키고, 증폭된 DNA 산물들을 2% agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide(EtBr, Sigma-Aldrich Co.
- Pratt과 Birac(21)의 실험을 변형하여 추출물을 제조하였다. 된장을 동결 건조시킨 후 건조된 된장 시료를 파쇄하여 가루로 만든 뒤 시료에 20배(w/v)의 메탄올을 혼합하여 24시간 교반을 한 번 실행한 뒤 여과하고, 10배(w/v)의 메탄올을 혼합하여 24시간 교반을 한 번 더 실행한 뒤 여과하여 추출액을 얻었다.
- RT-PCR을 이용한 TNF-α, IL-6, COX-2의 mRNA 발현 분석: TNF-α, IL-6와 COX-2의 mRNA 발현을 측정하였다(Fig. 4).
- RT-PCR을 이용한 TNF-α, IL-6, iNOS, COX-2, p21, p53, cyclin D1, Bcl-2의 mRNA 발현 분석: HT-29 인체 대장암세포를 위와 동일한 방법으로 배양하여 6 well plate 에 well당 1.5×106 cells/mL로 분주하고 된장 추출물을 배지에 일정 농도를 희석하여 암세포에 처리한 후 상층액을 모아 원심분리기(1,200 rpm, 3 min, 4°C)로 세포와 배지를 분리하였다.
- pH는 SevenEasy pH meter(8603, Mettler-Toledo AG, Schwerzenbach, Switzerland)를 이용하여 측정하였으며, 증류수로 10배 희석한 된장 시료를 사용해 실온에서 측정하였다. 아미노태 질소 함량 측정을 위해 10배 희석한 된장 시료 5 mL에 중성 formalin 용액 5 mL를 가한 후, 0.
- 각각의 된장은 콩을 세척하고 불린 후 가마솥에서 장작불로 삶고 나서 분쇄하여 일정한 크기의 육면체 모양(3kg, 10×15×20 cm)의 메주를 제조한 후 볏짚을 깔아둔 선반에 진열하여 메주를 띄웠다(40°C).
- Pratt과 Birac(21)의 실험을 변형하여 추출물을 제조하였다. 된장을 동결 건조시킨 후 건조된 된장 시료를 파쇄하여 가루로 만든 뒤 시료에 20배(w/v)의 메탄올을 혼합하여 24시간 교반을 한 번 실행한 뒤 여과하고, 10배(w/v)의 메탄올을 혼합하여 24시간 교반을 한 번 더 실행한 뒤 여과하여 추출액을 얻었다. 추출액을 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co.
- 만들어진 cDNA를 주형으로 이용하여 TNF-α, IL-6, iNOS, COX-2, p21, p53, cyclin D1, Bcl-2 유전자를 polymerase chain reaction(PCR) 방법으로 특정 유전자 부위를 증폭하였다.
- 각각의 된장은 콩을 세척하고 불린 후 가마솥에서 장작불로 삶고 나서 분쇄하여 일정한 크기의 육면체 모양(3kg, 10×15×20 cm)의 메주를 제조한 후 볏짚을 깔아둔 선반에 진열하여 메주를 띄웠다(40°C). 메주 성형 후 60일이 지난 뒤 햇빛에 말리고 물로 깨끗이 세척한 후 9회 죽염(Insanga, Hamyang, Korea)을 첨가한 20%의 소금물에 1:2(메주 : 소금물)의 비율로 항아리에 담았다. 4개월 후 간장과 된장을 분리하고 분리된 된장은 따로 항아리에 담아 1년간 발효시켰다.
- 메탄올로 용해 희석한 150 μM DPPH(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) 용액 100 μL를 농도별로 준비된 시료 100μL에 가하여 96-well plate에 혼합해 30분간 실온에서 반응시킨 뒤, UV-VIS spectrophotometer(Jasco)로 537 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Louis, MO, USA) 2 mL를 가한 후 30분 동안 실온(20~25°C)에서 방치하여 반응을 시켰다. 반응 후 UV-VIS spectrophotometer(Jasco, Tokyo, Japan)를 이용하여 750 nm에서 흡광도 값을 측정하였으며, 표준물질로 gallic acid를 사용하여 표준곡선을 작성하였다. 총 폴리페놀 함량은 시료 L당 mg gallic acid equivalent(GAE)로 나타내었다.
- 본 실험은 검정콩된장과 노란콩된장, 일반 된장을 이용하여 pH, 암모니아태 질소 및 아미노태 질소 함량 및 항산화 효과, RAW 264.7 cells에서 된장 추출물의 독성 확인, HT29 인체 대장암세포를 이용하여 암세포 성장 억제 효과, RT-PCR을 이용해 대장암의 inflammation 관련 유전인자 TNF-α, IL-6, iNOS, COX-2와 대장암세포의 cell cycle에 영향을 주는 유전인자인 p21, p53, cyclin D1과 apoptosis와 관련된 유전인자 Bcl-2의 발현 정도도 살펴보았다.
- 분리된 RNA를 정량한 후 Oligo dT primer(Invitrogen Co.)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 μg의 RNA를 reverse transcription(역 전사) 하여 sscDNA로 만들었다.
- 샘플은 세포를 배양했던 조건에서 4시간 동안 incubator에서 배양한 다음, DMSO를 100 μL 첨가하였다.
대상 데이터
- MTT assay: 한국세포주은행에서 HT-29 인체 대장암 세포를 분양받아 실험에 사용하였다. 암세포 배양을 위해 RPMI 1640 medium(GIBCO)에 100 unit/mL의 penicillinstreptomycin, 10%의 FBS가 함유된 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator(Model 3154, Forma Scientific Inc.
- 4개월 후 간장과 된장을 분리하고 분리된 된장은 따로 항아리에 담아 1년간 발효시켰다. 메주를 이용하여 전통식으로 제조 후 1년을 발효하고 정제염이 첨가된 일반(노란콩)된장(commercial doenjang, CD)은 농협마트(Hamyang, Korea)에서 구입하였다.
- 본 연구에서는 (주)인산가(Hamyang, Korea)에서 메주를 이용하여 전통식으로 제조 후 1년을 발효하고 9회 죽염이 첨가된 노란콩(대원콩)된장(soybean doenjang, SD)과 검정콩(서리태)된장(black soybean doenjang, BD)을 사용하였다. 각각의 된장은 콩을 세척하고 불린 후 가마솥에서 장작불로 삶고 나서 분쇄하여 일정한 크기의 육면체 모양(3kg, 10×15×20 cm)의 메주를 제조한 후 볏짚을 깔아둔 선반에 진열하여 메주를 띄웠다(40°C).
- 세포 배양을 위해 DMEM medium(GIBCO, Grand Island, NY, USA)에 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin, 10%의 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator(Model 3154, Forma Scientific Inc., Marietta, OH, USA)에서 배양하였다.
- 이화학적 실험에 사용된 된장은 동결 건조하여 실험에 이용하였는데 시료를 -80°C, vacuum gauge 10(Sanwon Freezing Engineering Co., Busan, Korea)의 조건에서 일주일간 동결 건조한 다음 파쇄하여 가루로 만든 후 실험에 사용하였다.
- 된장을 동결 건조시킨 후 건조된 된장 시료를 파쇄하여 가루로 만든 뒤 시료에 20배(w/v)의 메탄올을 혼합하여 24시간 교반을 한 번 실행한 뒤 여과하고, 10배(w/v)의 메탄올을 혼합하여 24시간 교반을 한 번 더 실행한 뒤 여과하여 추출액을 얻었다. 추출액을 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축해 추출물을 얻었으며, 이들을 dimethylsulfoxide(DMSO, Kanto Chemical Co., Tokyo, Japan)에 용해하여 적당한 농도로 희석한 후 각 실험에 사용하였다.
- 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 RAW 264.7 세포를 분양받아 실험에 사용하였다. 세포 배양을 위해 DMEM medium(GIBCO, Grand Island, NY, USA)에 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin, 10%의 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator(Model 3154, Forma Scientific Inc.
데이터처리
- Means with the different letters (a,b) above the bars are significantly different (P<0.05) in the same concentration by Duncan's multiple range test.
- Means with the different letters (a-c) above the bars are significantly different (P<0.05) in the same concentration by Duncan's multiple range test.
- 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.
이론/모형
- 5×106 cells/mL로 분주하고 된장 추출물을 배지에 일정 농도를 희석하여 암세포에 처리한 후 상층액을 모아 원심분리기(1,200 rpm, 3 min, 4°C)로 세포와 배지를 분리하였다. 6 well plate에 부착된 세포는 Trizol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후 Oligo dT primer(Invitrogen Co.
- 각각 된장의 총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(20)의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu reagent가 시료의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다. 동결 건조된 각각의 된장을 1.
- 암모니아태 질소 함량은 10배 희석한 된장 시료를 이용하여 AM-505-Kit(Asan Parmaceuticals, Hwaseong, Korea)에 의한 Indophenol법으로 측정하였다(19).
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