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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 천연물로부터 안전하고 미백 효과가 뛰어난 소재를 개발하기 위하여 참당귀로부터 coumarin계 화합물을 분리하고 멜라닌 생성 저해 효과를 검증하였으며, B16F1 melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 생성 저해 효과를 평가하여 새로운 미백 기능성 소재로서 참당귀의 개발 가능성을 검토하고자 하였다.
가설 설정
- 8) 그러나 과도한 멜라닌의 축적은 주근깨, 기미, 피부반점 등과 같은 과색소 현상을 유발한다.9,10) Tyrosine 으로부터 형성되는 멜라닌 생합성은 tyrosinase의 촉매작용을 통해 일어나는 초기 반응으로 시작되며, tyrosine을 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)로 전환시키는 작용을 하며, tyrosinase related protein-1(TRP-1)은 5,6-dihydroxyindole2-carboxylic acid(DHICA)를 indole-5,6-quinone-2-carboxy acid로 전환시키는 DHICA oxidase 작용을 tyrosinase related protein-2(TRP-2)는 DOPAchome을 DHICA로 전환 시키는 역할을 한다.
제안 방법
- − ATCC에서 구매한 mouse melanoma (B16F1) 세포를 10% fetal bovine serum(FBS), 5% antibiotic-antimyotic을 첨가한 Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)으로 배양기에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
- − 참당귀로부터 유효성분의 분리와 정제를 위해 silica gel column chromatography(silica gel 60, Merck, 230~400 mesh)를 실시하였다.
- 5% skim milk가 함유된 tris 완춘용액으로 1 hr blocking한 후, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF, β-actin 1차, 2차 항체와 각각 반응시켰다.
- 참당귀추출물은 증류수에 용해시키고 동량의 Et2O를 가하여 3회에 걸쳐 용매 분배한 후 Et2O 층 45 g을 얻었다. Et2O 분획물 30 g을 silica gel column chromatography(이동상; n-hexane:EtOAc=20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 0:1, v/v)를 실시하여 10개의 subfraction(Fr. 1-10)으로 나누었다. Fr.
- 멜라닌 생성 억제 효과 − 화합물 1이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 B16F1 melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제 효과를 측정하였다.
- 5% skim milk가 함유된 tris 완춘용액으로 1 hr blocking한 후, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF, β-actin 1차, 2차 항체와 각각 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate(Millipore, USA)를 이용하여 1~3 min 반응시킨 후 ChemiDoc(ATTO, Japan)으로 확인하였다.
- 세포독성결과 − 화합물 1의 세포 독성측정과 실험에 사용 될 농도 범위 결정을 위해 NRU assay를 시행하였다.
- 참당귀로부터 분리한 화합물들의 구조 동정을 위한 NMR 측정에는 JEOL ECA-500을 사용하였으며, CDCl3를 용매로 사용하였고, 내부 표준물질로 사용한 tetramethylsilane(TMS)를 기준으로δ(ppm)으로 나타내었다.
- 참당귀에서 분리된 coumarin계 화합물은 HPLC, 1D/2DNMR 등의 분광학적 방법으로 demethylsuberosin(1)으로 동정하였으며, 이 화합물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 B16F1 melanoma 세포를 이용하여 세포내 멜라닌생성 저해효과, tyrosinase와 관련단백질 및 유전자에 미치는 영향을 연구하였다. 화합물 1의 B16F1 melanoma 세포를 이용한 멜라닌 생성은 5 µg/ml 농도에서 74% 감소하였고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현도 농도 의존적으로 억제하였다.
대상 데이터
- − 본 실험에서 사용한 참당귀(Angelica gigas NaKai)는 한국 경북에서 재배한 생약을 옴니허브에서 구입하여, 형태학적 평가를 통하여 동정하였다.
- Neutral red는 Sigma(USA), Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)은 Thermo scientific(USA), fetal bovine serum(FBS)과 AntibioticAntimyotic(100X)은 Gibco(USA) 제품을 사용하였다.
- Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, β-actin 항체는 Santacruze Biotechnology(USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, β-actin 항체는 Santacruze Biotechnology(USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 microplate reader(Bio-rad, USA)와 ChemiDoc(ATTO, Japan)을 사용하였다.
- 200 nM α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)이 있는 배지조건에 시료를 농도별로 처리한 후 72 hr 배양하였다. 양성대조군으로는 알부틴을 사용하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 trypsination하여 세포를 회수하였다.
데이터처리
- − 본 실험의 통계처리는 Minitab 17을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2-표본 t 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.
이론/모형
- − 본 실험에서 mouse melanoma 세포에 대한 시료의 유효농도를 결정하기 위해 세포독성측정(NRU assay)을 진행하였다.
- Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 MITF의 단백질 발현 저해 효과 − 화합물 1의 멜라닌 합성 억제 효과가 tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 같은 멜라닌 합성효소의 발현억제와 멜라닌 형성에 중요한 transcription factor인 MITF의 발현에 관련된 효과인지 알아보기 위해 western blotting을 수행하였다.
성능/효과
- − 화합물 1은 옅은 노란색 gum의 형태로 분리되었으며, ELSD를 이용한 HPLC 분석 결과, 순도는 95% 이상으로 확인되었다.
- 1H-NMR 스펙트럼의 δ 6.21, 7.61 (each 1H, d, J = 9.5Hz, H-3, H-4)에서 전형적인 7-hydroxy-6-substituted coumarin의 존재를 확인할 수 있었으며, δ 6.89 (H-8)와 7.17 (H-5)에서 두 개의 amomatic proton이 있음을 알 수 있었다.
- 8) 그러나 과도한 멜라닌의 축적은 주근깨, 기미, 피부반점 등과 같은 과색소 현상을 유발한다.9,10) Tyrosine 으로부터 형성되는 멜라닌 생합성은 tyrosinase의 촉매작용을 통해 일어나는 초기 반응으로 시작되며, tyrosine을 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)로 전환시키는 작용을 하며, tyrosinase related protein-1(TRP-1)은 5,6-dihydroxyindole2-carboxylic acid(DHICA)를 indole-5,6-quinone-2-carboxy acid로 전환시키는 DHICA oxidase 작용을 tyrosinase related protein-2(TRP-2)는 DOPAchome을 DHICA로 전환 시키는 역할을 한다. 최근에는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 뿐만 아니라 microphthalmia-associated transcription factor(MITF) 등과 같은 단백질을 이용하여 melanin 합성 억제에 대한 연구가 이루어지고 있다.
- B16F1 melanoma 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과, 5 µg/ml 이하의 농도에서 세포생존율이 80% 이상으로 나타났다(Fig. 2).
- Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 MITF의 단백질 발현 저해 효과 − 화합물 1의 멜라닌 합성 억제 효과가 tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 같은 멜라닌 합성효소의 발현억제와 멜라닌 형성에 중요한 transcription factor인 MITF의 발현에 관련된 효과인지 알아보기 위해 western blotting을 수행하였다. 그 결과 화합물 1은 tyrosinase, TRP-1 그리고 TRP-2의 발현을 억제하는 것으로 나타났으며, transcription factor인 MITF의 발현도 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(Fig. 4).
- MITF는 melanin 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진한다. 따라서 실험 결과 화합물 1은 MITF 발현 억제를 통하여 tyrosinase, TRP-1, 그리고 TRP-2의 단백질 발현이 감소되고, 더 나아가 멜라닌 생성 억제로 이어지는 것이라 판단된다.
- 8)에서도 확인할 수 있었다. 위의 결과를 바탕으로 화합물 1은 coumarin 계열의 화합물인 demethylsuberosin로 추정되었으며, 보고된 문헌의 분광학적 data와 비교하여 demethylsuberosin로 최종 확인, 동정하였다(Fig. 1).12)
- 최고 농도인 5 µg/ml의 농도에서 약 74% 멜라닌 합성이 저해되었고, 양성대조군으로 사용한 arbutin은 500 µg/ml 농도에서 약 33%로 억제되었다.
- 화합물 1을 2.5, 5, 10 µg/ml 농도로 처리한 세포를 수집하여 멜라닌 양을 측정한 결과 농도 의존적으로 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였다(Fig. 3).
- 화합물 1의 B16F1 melanoma 세포를 이용한 멜라닌 생성은 5 µg/ml 농도에서 74% 감소하였고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현도 농도 의존적으로 억제하였다.
후속연구
- 화합물 1의 B16F1 melanoma 세포를 이용한 멜라닌 생성은 5 µg/ml 농도에서 74% 감소하였고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현도 농도 의존적으로 억제하였다. 참당귀 추출물 및 demethylsuberosin은 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질과 유전자의 발현조절 경로를 통하여 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타내는 것으로 보이며 향후 미백제로 응용 할 수 있을 것으로 생각된다.
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