당귀로부터 정제한 Decursin의 인간 급성 단핵구성 백혈병 세포(THP-1 cells)의 세포 독성 및 Apoptosis에 미치는 영향 Decursin from Angelica gigas Nakai Promotes Cytotoxicity and Induces Apoptosis in THP-1 cells, a Human Acute Monocytic Leukemia원문보기
Decursin is a major component of the root of Angelica gigas(Umbelliferae), which has been traditionally used in Korea as a tonic and to treat anemia, hemiplegia, and women's diseases. The objective of this study is to identify the anti-cancer mechanism induced by decursin on apoptosis of human leuke...
Decursin is a major component of the root of Angelica gigas(Umbelliferae), which has been traditionally used in Korea as a tonic and to treat anemia, hemiplegia, and women's diseases. The objective of this study is to identify the anti-cancer mechanism induced by decursin on apoptosis of human leukemia and lymphoma cells. Cytotoxicity of decursin on U937, HL-60, MOLT-4, THP-1 cells showed the significant effects. First of all, $IC_{50}$ of decursin on four cell lines was 27.1, 32.4, 17.4, $15.1{\mu}M$, respectively. So $IC_{50}$ in THP-1 cells was the smallest among 4 cell lines treated with decursin($15.1{\mu}M$). In order to understand the apoptosis-mechanism by decursin, we examined the gene expression of bcl-2(anti-apoptotic), bax(pro-apoptotic) and p53(tumor suppressor)after treating the THP-1 cells with decursin(10, 50 and $100{\mu}M$). It was found bcl-2 gene was decreased dose dependently, the expression level of bax gene of THP-1 cells treated with $100{\mu}M$ of decursin was about 3 times higher than those of control, and p53 gene was increased In the same concentration($100{\mu}M$), p53 gene was increased dose dependent manner. In protein express, bcl-2 and p53 protein showed a tendency to decrease. bax was increased about 4 fold. Therefore decursin is a useful chemotherapeutic agent against leukemia.
Decursin is a major component of the root of Angelica gigas(Umbelliferae), which has been traditionally used in Korea as a tonic and to treat anemia, hemiplegia, and women's diseases. The objective of this study is to identify the anti-cancer mechanism induced by decursin on apoptosis of human leukemia and lymphoma cells. Cytotoxicity of decursin on U937, HL-60, MOLT-4, THP-1 cells showed the significant effects. First of all, $IC_{50}$ of decursin on four cell lines was 27.1, 32.4, 17.4, $15.1{\mu}M$, respectively. So $IC_{50}$ in THP-1 cells was the smallest among 4 cell lines treated with decursin($15.1{\mu}M$). In order to understand the apoptosis-mechanism by decursin, we examined the gene expression of bcl-2(anti-apoptotic), bax(pro-apoptotic) and p53(tumor suppressor)after treating the THP-1 cells with decursin(10, 50 and $100{\mu}M$). It was found bcl-2 gene was decreased dose dependently, the expression level of bax gene of THP-1 cells treated with $100{\mu}M$ of decursin was about 3 times higher than those of control, and p53 gene was increased In the same concentration($100{\mu}M$), p53 gene was increased dose dependent manner. In protein express, bcl-2 and p53 protein showed a tendency to decrease. bax was increased about 4 fold. Therefore decursin is a useful chemotherapeutic agent against leukemia.
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문제 정의
이와같이 여러 효능을 보이는 당귀 decursin의 연구에서 백혈병세포에 대한 연구가 진행되었지만 세포의 미토콘드리아에 의한 내재성 apoptosis pathway에 작용하는 단백질로 세포자연사를 일으키기도 하고 억제 시키는 역할을 하는 단백질 종류를 모두 갖고 있는 Bcl family에 대한 연구 거의 진행되지 않아서 본 연구에서는 decursin의 백혈병과 임파종에 미치는 세포독성 중 Bcl family에 대한 효능에 초점을 맞추어 연구를 진행하였다.
Cell viability 측정 − 계대배양중인 U937, HL60, MOLT4, 및 THP-1 세포를 96 well plate에 5×104 cells/well이 되도록 세포수를 조정한 다음, 1% DMSO에 녹인 decursin 시료(최종농도-10, 50, 100 μM)를 첨가하여 24시간 동안 37ºC의 5% CO2 배양기 내에서 배양하였다.
각각의 cycle은 94ºC에서 30초간 denaturation시킨 후, 58°C에서 30초간 annealing시키고, 72ºC에서 30초간 extension시켰다. PCR product는 1% agarose gel에서 전기영동하고 LoadingSTAR(DYNEBio Co.)로 염색하여 UV transilluminator(OPTIMA, JAPAN)로 관찰하였다. PCR에 사용된 primer는 Table I과 같다.
RNA 분리 및 유전자 증폭(RT-PCR) − THP-1 세포(3×106 cells/well)에 1% DMSO에 녹인 10, 50, and 100 μM의 Decursin 시료를 첨가한 후, 24시간 동안 배양하고 RNA를 분리하였다.
발색된 각 well의 흡광도를 ELISA reader를 이용해서 570 nm에서 측정하고 대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율로 환산하였다. 각 세포의 IC50 값은 sigmaplot software를 사용하여 분석하였다.25)
그 후 각 1차 항체를 overnight 반응(1:1000, 4ºC)하고 TBS-T(0.05% Tween 20)으로 4회 세척하고 goat anti-rabbit IgG-HRP conjugated antibody(1:5000)을 1시간 동안 반응시켰다.
단백질 분리 및 웨스턴 블로팅 − 계대배양중인 THP-1 세포(5×106 cells/well)에 10, 50, 및 100 μM의 Decursin 시료를 첨가한 후, 24시간 동안 배양하고 1% NP-40 lysis buffer(+PMSF, pepstatin A, 및 aprotinin protease inhibitor)를 사용하여 단백질을 추출하였다.
1 N HCl에 녹인 10% SDS 100 μL로 용해시켜 18시간동안 은박지로 빛을 차단하였다. 발색된 각 well의 흡광도를 ELISA reader를 이용해서 570 nm에서 측정하고 대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율로 환산하였다. 각 세포의 IC50 값은 sigmaplot software를 사용하여 분석하였다.
배양종료 4시간 전에 5 mg/mL 농도로 PBS(pH 7.4)에 희석된 MTT용액 20 μL를 각 well에 처리하고, 0.1 N HCl에 녹인 10% SDS 100 μL로 용해시켜 18시간동안 은박지로 빛을 차단하였다.
4 g의 추출물을 얻었다. 이 추출물을 증류수와 MeOH 혼합액(9:1)에 현탁시킨 후 동량의 CHCl3, EtOAc 및 n-BuOH를 이용, 순차적으로 분획하여 각각 CHCl3(9.7 g), EtOAc(2.7 g) 및 n-BuOH(7.8 g)분획물을 얻었다. CHCl3 분획물 일부(5.
추출한 단백질을 Bradford 법을 이용해 정량한 후 well 당 10 μg씩 loading한 후 7.5% SDS-polyacrylamide gel을 통해 SDS-PAGE를 시행하였다.
3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)와 Nonidet P-40(NP-40)는 Amresco 사, DMSO, agarose와 기타 시약은 SigmaAldrich 사, 웨스턴 블로팅에 사용한 단클론항체(Bcl-2, Bax,p53와 β-actin 항체)는 Cell Signaling(MA, USA)와 SigmaAldrich에서 구입하였다. 그리고 RT-PCR에 사용한 Trizolreagent와 polymerase chain reaction(PCR) kit는 각 Invitrogen(USA)과 Takara(Japan) 사에서 구입하여 사용하였다.
세포주 및 재료 − 본 실험에 사용한 세포주로서는 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 분양받은U937(인간 조직구성 림프종), HL60(인간 급성 전골수성 백혈병), MOLT4(인간 급성 림프아구성 백혈병) 및 THP-1(인간 급성 단구성 백혈병) 세포를 사용하였으며, RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), phosphate buffered saline(PBS), antibiotics는 GibcoBRL(Gaithersburg, MD).
실험재료 − 본 실험에 사용된 당귀(Angelica gigas Nakai)은 2015년 3월에 광명당(울산)에서 규격품을 구입하였다.
데이터처리
통계처리 − 통계처리는 student’s t-test로 하였으며, p<0.05 이하를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
cells/well)에 1% DMSO에 녹인 10, 50, and 100 μM의 Decursin 시료를 첨가한 후, 24시간 동안 배양하고 RNA를 분리하였다. Total RNA 분리는 TRIzol reagent를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다.26) cDNA는 PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis kit와 oligo dT primer를 이용하여 합성하였고, EmeraldAmp GT PCR Master Mix(Takara bio.
성능/효과
2) 몇 가지 암 세포주(HepG2, HeLa, MCF7, SW626)에서 당귀 유기용매의 추출물은 용매에 따라 다른 효과를 보이지만 일반적으로 강한 효능을 보였다.
6). Fig. 4에서 확인한 세포자연사와 종양억제 유전자의 양상과 유사하게 단백질에서도 세포자연사를 촉진, 종양억제를 유도하는 경향을 보여 세포자연사가 진행되었음을 확인할 수 있었다. Kim 등(2015)은 decursin은 K562, U937 인간 백혈병세포에서 세포의 성장, 증식에 영향을 주는 PKCα를 감소시켜 세포독성을 증가시키는 것으로 확인하였다.
THP-1세포의 세포자연사 관련 단백질(bax, bcl-2, p53단백질) 발현양상 − THP-1 세포주에 decursin(10, 50, 100 μM)에 대한 apoptosis 관련인자(bcl-2, bax), p53 단백질의 발현양상을 western blot을 통해 확인한 결과, THP-1세포에서 decursin의 Bcl family에 대한 영향이 발견되었다.
THP-1세포의 세포자연사 관련 유전자(p53, bax, bcl-2 유전자) 발현양상 − THP-1 세포주에 decursin(10, 50, 100μM)에 대한 apoptosis 관련인자(bcl-2, bax), 종양 억제유전자(p53)의 발현양상을 RT-PCR을 통해 확인한 결과, decursin을 첨가한 모든 군에서 처리하지 않은 대조군에 비해 bax와 p53 mRNA 유전자가 발현이 증가하였고, 특히 decursin100 μM 처리군에서 bax 유전자가 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다.
4배 증가하는 유의적인 경향을 보였다. 결론적으로, 당귀에서 분리한 decursin은 THP-1세포에서 apoptosis 관련인자인 bax, bcl-2, p53이 관여하여 세포자연사를 일으키고 유의적인 세포독성을 보였다.
그리고 종양억제유전자인 p53은 100 μM에서 2배 이상 증가하였으며 이런 양상은 단백질 발현 현상에서도 비슷한 경향을 보여 bcl-2는 감소, bax는 10 μM와 50 μM 처리군은 약 2.5배-3배, 100 μM 처리군에서는 4배 이상 증가, p53은 100 μM 처리군에서 1.4배 증가하는 유의적인 경향을 보였다.
당귀로부터 분리 정제한 decursin의 세포에 미치는 영향을 알아본 결과, 3종류의 백혈병세포와 1종류의 림프종 세포 모두 높은 독성을 보였으나 그 중 THP-1세포가 가장 독성이 높았으며(IC50: 15.1 μM), apoptosis 관련 mRNA 수준을 확인한 결과 bcl-2는 100 μM 처리군에서 50%이상 감소, bax는 약 2배로 증가하였다.
2). 따라서, decursin를 처리한 경우 1가지 림프종과 3가지 백혈병세포에서 모두 유의적으로 생존율을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. Park 등(2007)은 당귀에서 decursin을 정제하여 대장암, 유방암, 간암, 신장암세포에 처리하였을 때 다른 추출물이나 분획물에 비해 성장 억제 효능을 보였다.
4). 본 실험에 사용한 4가지 세포주 중 세포생존율이 가장 유의적으로 억제되는 THP-1 세포주에서 세포자연사와 종양억제에 관련 있는 3가지 유전자(bcl-2, bax, p53)가 모두 대조군에 비해 bcl-2, p53 유전자는 증가, bax 유전자는 감소되어 세포자연사가 진행되고 있다고 추측된다. Decursin은 2000년대 초반부터 많은 연구가 진행되어 왔으며 종양을 억제시키는 PKC activator, 종양세포의 apoptosis G1 arrest와 anti-androgen 효과와 androgen receptor의 길항작용이 있다고 알려져 있고, 이런 anti-androgen효과와 다른 항암 효과기전을 이용하여 전립선암의 예방과 치료의 목적으로 개발이 활발하다.
세포생존율(MTT Assay) − 계대배양 한 U937, HL60, MOLT4, THP-1 세포주에 decursin을 첨가해서 세포 생존율을 측정한 결과, 4가지 세포 모두 농도의존적으로 세포독성의 효과가 보였으며, 모든 세포에서 IC50값이 40 μM 이하로 나타났다.
종양억제유전자인 p5328)은 decursin의 농도의존적으로 발현이 증가하는 양상을 보였으며 특히 100 μM 처리군에서 대조군보다 2배 이상 증가하였다(Fig. 4).
특히 100 μM decursin 처리군에서 bax 단백질이 대조군에 비해 3배 이상 증가하였고(Fig. 5), 동일한 농도(100 μM)의 decursin 처리군에서는 p53 단백질 발현이 대조군보다 유의적으로 증가하였다(Fig. 6).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
여러 세포주에 대한 decursin의 효능에는 어떤 종류가 있는가?
여러 가지 세포주에 대한 항산화, 항균, 혈소판 응집억제, 세포 독성, 항전이 효과, 기억력 개선에 효능이 있다.10,13-19)최근 세포독성 분야에서는 decursin의 B16F10 melanoma 세포20)와 PC12 부신 갈색세포종 세포21)에 대한 연구가 보고되어있으며, 백혈병 세포주에 대한 연구는 Kim HH등(2005)22,23)은 K562, U937 세포에 세포증식과 분화에 관여하는 PKC에 대한 연구가 진행되었고, 인간 KBM-5 백혈병세포에 처리하여 caspase family의 활성화, PARP 분할유도,COX-2가와 survivin의 억제를 시켜 apoptosis를 유도하는 작용을 하였다.
당귀는 무엇인가?
당귀(Angelica gigas Nakai)는 한국, 중국, 일본에서 서식하는 다년생 식물로, 중국에서는 전통적으로 당귀의 뿌리를 약재로 사용한다. 꽃이 피기 전 당귀의 뿌리를 건조시켜 사용한 것이 조혈작용에 효과가 있는 것으로 보고되었다.
백혈병의 종류는 어떻게 구분되는가?
백혈병은 미성숙 백혈구의 비정상적인 증식으로 인한 암으로 4가지 형태로 구분이 된다. 이는 급성 림프아구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia; ALL), 만성 림프구성 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia; CLL), 급성 골수성백혈병(Acute myelogenous leukemia; AML) 및 만성 골수성 백혈병(Chronic myelogenous leukemia; CML)로서 급성백혈병은 림프아구 나 골수아구 같은 미성숙 혈액세포의 비정상 적인 증식이 이루어져있으며, 즉시 치료가 필요하다.
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