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문제 정의
- 천연물은 예로부터 퇴행성 뇌 질환 등의 다양한 질병에 대한 치료 및 예방을 목적으로 사용되었다. 이러한 천연물은 적은 부작용 및 높은 순응도로 인해 이용이 증가하는 추세이다.
제안 방법
- HT22 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37 oC의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Glutamate에 의해 유도된 독성에 대한 뇌신경세포 보호 활성을 측정하고자 MTT assay를 시행하였다. HT22세포를 48-well plate에 4.
- HPLC를 이용한 화합물 함량 분석 − 청호에서 세 화합물, stigmasterol, campesterol 그리고 daucosterol의 함량을 분석 하기 위해 HPLC를 이용하였다(Fig. 5).
- HPLC를 이용한 화합물 함량 분석− HPLC를 이용하여 분리된 세 화합물의 함량을 분석하였다.
- HT22 세포 배양 및 뇌신경세포 보호 활성 측정 − 청호 추출물과 hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 층과 청호에서 분리한 stigmasterol, campesterol 및 daucosterol의 glutamate로 유발된 독성에 의한 HT22 세포에 대한 보호 활성을 측정하였다.
- HT22세포를 48-well plate에 4.02×103 cells/well의 농도로 분주하여 23시간 배양한 후 시료(10, 50, 100 µM), trolox(positive control)를 30 µl씩 처리하였으며, 1시간 배양 후 1.8 mM glutamate 30 µl를 처리하였다.
- Hexane 분획(29.54 g)을 silica gel open column(40×5 cm, 70~230 mesh)에 걸어 CHCl3 :MeOH(100:1→0:1, v/v)의 조성으로 chromatography를 실시하여 6개의 소분획(A~F)으로 나누었다.
- Phytosterol의 분리정제 − 많은 유효 성분의 보존과 추출 공정의 효율을 높이기 위해 80% MeOH에서 초음파 추출 법을 이용하여 청호 추출물을 얻었다.
- 본 연구에서 청호로부터 3종류의 phytosterol(stigmasterol, campesterol, daucosterol)을 분리하였으며 1H NMR, 13C NMR 등의 분광학적 방법 및 문헌 조사를 통해 그 구조를 규명하였다.
- 본 연구에서는 청호의 hexane층으로부터 phytosterol인 stigmasterol, campesterol 및 daucosterol을 분리, 동정하였으며 HT22 cell에서 glutamate로 유도된 산화적 스트레스로부터 뇌신경 세포 보호활성을 평가하였다.
- 세포 내 ROS량 측정 − 청호에서 분리한 화합물 중 뇌신 경세포 보호 활성을 나타낸 stigmasterol에 대한 ROS 생성 억제 활성 측정하였다.
- 세포 내 Reactive Oxygen Species(ROS) 생성 측정− HT22 세포에서 glutamate에 의해 유발된 ROS를 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)를 사용하여 측정하였다.
- 세포 내 칼슘 이온(Ca 2+) 생성의 측정− HT22 세포 내칼슘 이온(Ca 2+)를 측정하기 위해, Fura-2AM을 사용하였다.
- 세포 내 칼슘이온(Ca 2+) 측정 − ROS 활성을 유도하는 세포 내 Ca 2+ 이온 량을 측정하였다.
- Daucosterol(3)은 연한 노란색 결정으로 분리되었다. 세화합물은 1H 및 13C-NMR 데이터와 문헌상의 데이터를 비교하여 구조를 동정하였다. 24-28)
- 소분획 B(19 g)를 CHCl3:MeOH(100:1→0:1, v/v)의 조성으로 silica gel column chromatography(74×3 cm, 70~230 mesh)를 실시하여 TLC 분석을 통해 9개의 소분획(Ba~Bi)을 얻었다.
- 소분획 Bc를 hexane:EtOAc(70:1→1:2, v/v)의 조성으로 silica gel column chromatography(55×2.8 cm, 70~230 mesh)를 실시하여 20개의 소분획(Bc1~Bc20)을 얻었으며, 소분획 Bc9에서 화합물 1(122.3 mg)과 2(27.6 mg)를 얻었다.
- Phytosterol의 분리정제 − 많은 유효 성분의 보존과 추출 공정의 효율을 높이기 위해 80% MeOH에서 초음파 추출 법을 이용하여 청호 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물을 감압 농축한 후, 증류수에 현탁하여 동량의 hexane, CHCl3 , EtOAc, BuOH를 순차적으로 가해 분획하였으며 hexane 분획을 column chromatography로 분리하여 화합물 1-3을 얻었다(Fig. 1).
- 22 g의 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물을 증류수에 현탁한 후 동량의 hexane을 가하고 진탕 방치하여 hexane 분획(32.66 g)을 얻었다. 같은 방법으로 수층에 동량의 CHCl3를 가하고 진탕 방치하여 CHCl3 분획(86.
- 이후 10 µM DCF-DA를 처리하고 1시간 배양하고 1% Triton X-100을 처리하여 형광 분석기를 통해 488 nm의 들뜸 파장과 530nm의 방출 파장에서 측정하였다.
- 청호 추출물, 각 분획층 그리고 분리된 화합물을 대상으로 HT22 세포에서 glutamate에 의해 유도된 뇌신경 세포 사멸에 대한 보호 활성을 평가하였다. 측정 결과, 청호 추출물과 hexane 분획층은 glutamate에 의해 유도된 세포 사멸을 억제하였으며, 세 화합물 중 stigmasterol이 glutamate 유도성 독성에 대해 100 µM에서 61.
- 추출 및 분획 − 구입한 청호 10.2 kg에 80% MeOH를 가하고 90분씩 3회 초음파 추출 하였으며 감압 농축하여 445.22 g의 추출물을 얻었다.
- 2시간 후에 세포를 PBS로 세척한 후, 1% Triton X-100를 처리하여 세포를 추출한다. 칼슘 이온(Ca 2+)형광 분석기를 통해 400 nm 의 들뜸 파장과 535 nm의 방출 파장에서 형광 측정하였다.
대상 데이터
- Co.(Eggenstein, Germany)로부터 구입하였다. Glutamate와 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbboxylic acid(trolox), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma(St.
- NMR 분석을 위해 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.(U.S.A.)의 CDCl3와 DMSO-d6를사용하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)과 fetal bovine serum(FBS)은 Gibco BRL.
- (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였다. Glutamate와 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbboxylic acid(trolox), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma(St. Louis, U.S.A.)로부터 구입하여 사용하였다.
- HT22 세포 배양 및 뇌신경세포 보호 활성 측정 − 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포는 서울대학교로부터 분양받아 사용하였다.
- HT22 세포 배양 및 뇌신경세포 보호 활성 측정 − 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포는 서울대학교로부터 분양받아 사용하였다. HT22 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37 oC의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Glutamate에 의해 유도된 독성에 대한 뇌신경세포 보호 활성을 측정하고자 MTT assay를 시행하였다.
- NMR spectrum은 Bruker Avance 400(400MHz, Germany)을 사용하여 측정하였다.
- 시약 및 기기 − 추출 및 분획에 사용된 methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol은 DAE JUNG(Korea)에서 구입하였다. TLC plates(Silica gel 60 F254)와 silica gel(70-230 mesh)는 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. NMR 분석을 위해 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
- 시약 및 기기 − 추출 및 분획에 사용된 methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol은 DAE JUNG(Korea)에서 구입하였다.
- 실험 재료 − 본 연구에서 사용된 청호는 서울 경동시장에서 구입하여 사용하였으며, 대전대학교 서영배 교수님을 통해 동정하였고 청호 표본은(NO. CJ064M)는 강원대학교에 보관하였다.
데이터처리
- 24시간 배양 후에 배지를 제거하고 MTT assay를 시행하여 microplate reader를 사용하여 570nm에서 OD값을 측정하였다. 뇌세포 보호 활성은 relative protection(%)으로 나타내었으며 통계처리는 ANOVA test를 적용하였다.
성능/효과
- HPLC를 이용하여 세 화합물의 함량을 평가한 결과, campesterol이 가장 많이 포함되어 있었으며, daucosterol이가장 적게 포함되어 있었다.
- glutamate를 처리한 세포 내의 칼슘 이온량 측정 결과, 135.25%로 증가하였으나, 100 µM 농도의 stigmasterol을 처리시 100.27%의 칼슘 이온량이 측정되어 glutamate에 의해 처리된 세포의 칼슘 이온량과 비교하여 유의적으로 감소시켰다(Fig. 4).
- 205 nm에서는 daucosterol 그리고 254 nm에서는 campesterol과 daucosterol 을 분석하였다. 분석 결과, stigmasterol은 0.42%, campesterol 은 1.95% 그리고 daucosterol은 0.23%를 포함하는 것으로 확인되었다.
- 6,31) Stigmasterol의 뇌신경세포 보호 기전을 밝히기 위해 뇌신경 세포 내의 ROS량과 Ca 2+ 량을 측정하였으며, stigmasterol은 ROS량과 세포 내 Ca 2+ 량을 유의적으로 억제시켰다. 위 결과를 바탕으로, stigmasterol의 뇌신경세포 보호 활성은 ROS 축적 및 세포 내 Ca 2+ 량의 억제를 통해 활성을 나타내는 것으로 사료된다. 위의 결과를 통해, 청호의 뇌신경 세포 보호 활성은 stigmasterol의 뇌신경 세포 보호 활성과 관련 있는 것으로 사료된다.
- 위 결과를 바탕으로, stigmasterol의 뇌신경세포 보호 활성은 ROS 축적 및 세포 내 Ca 2+ 량의 억제를 통해 활성을 나타내는 것으로 사료된다. 위의 결과를 통해, 청호의 뇌신경 세포 보호 활성은 stigmasterol의 뇌신경 세포 보호 활성과 관련 있는 것으로 사료된다. 추가적으로 stigmasterol의 glutamate 대한 신경 세포 보호의 추가적인 기전 연구가 필요하다고 사료된다.
- 청호의 분획층 중 hexane 층이 뇌 신경세포 보호 활성을 나타내었으며, 분리된 화합물 중 stigmasterol 이 50, 100 µM에서 각각 53.48%와 61.57%의 세포보호 활성을 나타내어 농도 의존적으로 높은 활성을 나타내었다 (Fig. 2).
- 측정 결과, glutamate를처리한 세포의 ROS량은 대조군에 비해 113.12% 가 증가하였으나, 50 µM와 100 µM 농도의 stigmasterol를 처리한 세포에서는 각각 99.11%와 97.45%로 glutamate에 의해 증가된 ROS량을 감소시켰다(Fig. 3).
- 측정 결과, 청호 추출물과 hexane 분획층은 glutamate에 의해 유도된 세포 사멸을 억제하였으며, 세 화합물 중 stigmasterol이 glutamate 유도성 독성에 대해 100 µM에서 61.57%의 높은 보호 활성을 나타내었다.
후속연구
- 위의 결과를 통해, 청호의 뇌신경 세포 보호 활성은 stigmasterol의 뇌신경 세포 보호 활성과 관련 있는 것으로 사료된다. 추가적으로 stigmasterol의 glutamate 대한 신경 세포 보호의 추가적인 기전 연구가 필요하다고 사료된다.
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