Amyloid ${\beta}-peptide$에 의해 유도되는 세포사멸을 보호하는 물질을 검색하기 위하여 250여 식물 재료 및 식품성분으로부터 스크리닝한 결과 가장 효과가 있는 시금치 추출물을 이용하여 뇌신경세포사멸(neuronal cell death)을 어느 정도 보호할 수 있는지를 알아보았다. 시금치 추출물이 항산화 활성과 acetylcholinesterase 활성에 대한 저해효과는 시금치 추출물 처리농도가 높을수록 유의적으로 높게 나타났다. 과산화수소와 amyloid ${\beta}-peptide$에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포주의 세포사멸에 대한 시금치추출액의 억제효과를 살펴본 결과, 과산화수소에 의한 세포사멸에 대하여 시금치 추출물은 억제효과를 나타내었으나, amyloid ${\beta}-peptide$의 경우는 세포사멸억제효과를 나타내지 않았다.
Amyloid ${\beta}-peptide$에 의해 유도되는 세포사멸을 보호하는 물질을 검색하기 위하여 250여 식물 재료 및 식품성분으로부터 스크리닝한 결과 가장 효과가 있는 시금치 추출물을 이용하여 뇌신경세포사멸(neuronal cell death)을 어느 정도 보호할 수 있는지를 알아보았다. 시금치 추출물이 항산화 활성과 acetylcholinesterase 활성에 대한 저해효과는 시금치 추출물 처리농도가 높을수록 유의적으로 높게 나타났다. 과산화수소와 amyloid ${\beta}-peptide$에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포주의 세포사멸에 대한 시금치추출액의 억제효과를 살펴본 결과, 과산화수소에 의한 세포사멸에 대하여 시금치 추출물은 억제효과를 나타내었으나, amyloid ${\beta}-peptide$의 경우는 세포사멸억제효과를 나타내지 않았다.
To investigate the potential therapeutic value of a plant extract against amyloid ${\beta}-peptide-induced$ cell damage, we first screened extracts of 250 herbs, and finally selected a water extract of Spinacia oleracea for further study. This extractshowed the potential to inhibit the re...
To investigate the potential therapeutic value of a plant extract against amyloid ${\beta}-peptide-induced$ cell damage, we first screened extracts of 250 herbs, and finally selected a water extract of Spinacia oleracea for further study. This extractshowed the potential to inhibit the reactions of oxidants. We measured the angiotensin-converting-enzyme (ACE) inhibitory activity of the extract, and assessed the ability of the extract to protect neuronal cells from chemical-induced cell death. SH-SY5Y neuroblastoma cells were used in this assay. The extract exerted protective effects on $H_2O_2-induced$ cell death, when $H_2O_2$ was used at 100 M, 200 M, and 500 M (protection of 87%, 73%, and 58%, respectively). When 50 M of amyloid ${\beta}-peptide$ was added to the test cells, however, the extract had no protective effect on cell death. The extract inhibited ACE activity in a dose-dependent manner, and exhibited potent protection against the deleterious effects of $H_2O_2$. In sum, these results suggest that a water extract of Spinacia oleracea has the potential to afford protection against chemical-induced neuronal cell death, and the extract may be useful in the treatment of neurodegenerative diseases. The precise molecular mechanism of neuroprotection is under investigation.
To investigate the potential therapeutic value of a plant extract against amyloid ${\beta}-peptide-induced$ cell damage, we first screened extracts of 250 herbs, and finally selected a water extract of Spinacia oleracea for further study. This extractshowed the potential to inhibit the reactions of oxidants. We measured the angiotensin-converting-enzyme (ACE) inhibitory activity of the extract, and assessed the ability of the extract to protect neuronal cells from chemical-induced cell death. SH-SY5Y neuroblastoma cells were used in this assay. The extract exerted protective effects on $H_2O_2-induced$ cell death, when $H_2O_2$ was used at 100 M, 200 M, and 500 M (protection of 87%, 73%, and 58%, respectively). When 50 M of amyloid ${\beta}-peptide$ was added to the test cells, however, the extract had no protective effect on cell death. The extract inhibited ACE activity in a dose-dependent manner, and exhibited potent protection against the deleterious effects of $H_2O_2$. In sum, these results suggest that a water extract of Spinacia oleracea has the potential to afford protection against chemical-induced neuronal cell death, and the extract may be useful in the treatment of neurodegenerative diseases. The precise molecular mechanism of neuroprotection is under investigation.
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문제 정의
또한 superoxide 등의 radical이 생체막을 통과하지 못하는 반면 이들은 생체막을 통과할 수 있으며, transition metal(Fe2+, Gu2+) 이 존재할 때는 Fenton 반응에 의해서 반응성 이 매우 큰 hydtoxyl radical로 환원될 수 있다(23). 따라서 과산화수소를 처리한 후 SH-SY5Y에 대한 시금치 추출물의 세포 사멸 억제를 알아보았다. 먼저 과산화수소를 농도별로 처 리하여 MIT assay를 실시하였다.
본 연구에서는 시금치 추출물에 대하여 뇌 속의 cholinagic neurotransmitter 인 acetylcholine 의 수준을 조절하는 acetylcholinesterase의 저해효과를 검토하고, 과산화수소와 Aβ로부터 유도된 SH-SY5Y세포에서의 세포사멸 억제 효과를 검토하였다.
이러한 amyloid P-peptide에 의해 유도되는 세포사멸의 회복을 조사하기 위해 본 실험에서는 인간 유래의 뇌종양 세포인 SH-SY5Y에 amyloid Q-peptide(25-35)를 농도별 처리하여 MTT assay로 시금치 추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다(Fig. 5). 그 결과 amyloid β-peptide(25-35) 의 농도에 따라 세포 사멸이 증가하는 것을 볼 수 있었고, 50 pM의 amyloid Q-peptide를 처리했을 때 대조군에 비해 약 40%의 세포 사멸율을 나타내었다.
가설 설정
A : Protection of hydrogen peroxide-induced cell damage by SO extract. B : Cell viability was determined by MTT assay.
제안 방법
Acetylcholinesterase (AChE) 의 활성은 Ellman 등(18)의 방법을 응용하여 450 nm에서 효소반응초기부터 5분간의 흡광도 변화를 측정하여 산출하였다. 시료의 AChE 억제활성도는 시료를 가하지 않은 상태의 효소활성도로부터 환산하였다
Amyloid -peptide에 의해 유도되는 세포사멸을 보호하는 물질을 검색하기 위하여 25g 식물 재료 및 식품 성분으로부터 스크리닝한 결과 가장 효과가 있는 시금치 추출물을 이용하여 뇌신경세포사멸(neuronal cell death)을 어느 정도 보호할 수 있는지를 알아보았다. 시금치 추출물이 항산화 활성과 acetylcholinesterase 활성 에 대한 저해효과는 시금치추출물 처리농도가 높을수록 유의적으로 높게 나타났다.
4). 농도별 과산화수소에 따른 시금치 추출물의 세포 보호능을 살펴보았다. 100 11M의 과산화수소를 처리했을 때 시금치 추출물은 87%의 상대적인 세포생존율을 보여 과산화수소 단독처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다.
따라서 과산화수소를 처리한 후 SH-SY5Y에 대한 시금치 추출물의 세포 사멸 억제를 알아보았다. 먼저 과산화수소를 농도별로 처 리하여 MIT assay를 실시하였다. 농도별 과산화수소에 따른 세포 사멸 정도를 알아본 결과 100, 200, 및 500 μM 농도별로 과산화수소를 처리한 군에서는 대조군에 비해 세포가 각각 57, 37, 및 28%의 생존율을 보여 과산화수소 농도가 증가함에 따라 세포사멸율도 증가한다는 것을 알 수 있었다(Fig.
반응액에 추출물을 혼합한 후 40분 동안 10분 간격으로 560nm에서 흡광도를 측정하여 상대적인 환원력을 비교하였다 (17).
세포는 RPMI-1640 배지에 10% FBS (fetal bovine serum; GIBCO) 와 1% antibiotics (penicillin/ streptomycin; Sigma Chemical)을 첨가하여 37℃의 5% CO2 incubator(Model No. MCO175; Sanyo, Tokyo, Japan)에서 배 양하면서, 48-72 시간에 한 번씩 계대 배 양하였으며, 세포주는 10 passage를 넘지 않았다.
시금치 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH 및 FRAP assay를 실시하였다 (Fig. 1, 2). 그 결과, 기존의 알려진 항산화 물질인 BHT(butylated hydroxytolune, Sigma)의 DPPH radical 소거 활성 은 72%로 나타났으며 시금치 추출물 1, 3, 5 pL를 처리함에 따라 각각 8, 17, 및 20%의 소거활성을 나타냈다(Fig.
대상 데이터
Acetylcholinesterase, acetylthiocholine iodide, diothio-bis- 2-nitrobenzoic acid (DTNB), hydrogen peroxide (H2O2), β-amyloid protein(25-35)는 Sigma사로부터 구입하였고, cell proliferation kit I은 Roche사로부터, CCK-8 kit는 Dojindo (Tokyo) 사로부터 구입하였다. 그 외에 본 실험에 사용된 모든 시 약은 분석 용 특급(Guaranteed grade)으로 사용하였다.
RPMI-1640, fetal bovine serum, streptomycin-penicillin 등의 세포 배 양용 시 약들은 Gibco BRL (Grand Island, USA) 에서, 배양조는 Commg(Rochester, USA)에서 구입하였으며, Human neuroblastoma SH-SY5Y cell linee American Type Culture Collection (Rockville, USA)에서 구입하였다. 세포는 RPMI-1640 배지에 10% FBS (fetal bovine serum; GIBCO) 와 1% antibiotics (penicillin/ streptomycin; Sigma Chemical)을 첨가하여 37℃의 5% CO2 incubator(Model No.
본 실험에 사용된 시금치는 시내 대형 농산물 전문 유통단지에서 구입하였으며, 60도에서 건조한 다음, 일반 가정용 homogenizer로 미세하게 가루를 만든 후, 분말 1 g당 증류수 1 mL를 넣고 60℃에서 24시간 동안 추출하였다. 추출물을 원심 분리하여 상등액만을 실험에 사용하였다.
이론/모형
Amyloid p-peptide0]] 의해서 유도되는 세포 사멸을 억제할 수 있는지 상기에서 설명한 MTT assay를 이용하여 실험하였다. 배양 세포들을 96 well plate에 4 x 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24시간 후 amyloid j3-peptide(25-35) 단독처리와 추출물을 함께 처리하여 48 시간동안 배양하였다.
Mi l assay 에서 세포 수 측정은 cell proliferation kit Ⅰ (Roche)를 사용하여 실험하였다. 배양 세포들을 96 well plate에 4 X 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24시간 후과산화수소 단독처리와 시금치 추출물을 함께 처리하여 24 시 간동안 배 양하였다.
배양 세포들을 96 well plate에 4 x 104 cells/mL 수준으로 접종하여 24시간 후 amyloid j3-peptide(25-35) 단독처리와 추출물을 함께 처리하여 48 시간동안 배양하였다. 배 양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay에 의하여 측정하였으며, 세포의 생존율은 과산화수소 무첨가구의 흡광도에 대한 시료 첨가구의 상대적인 %로 나타내었다.
성능/효과
농도별 과산화수소에 따른 시금치 추출물의 세포 보호능을 살펴보았다. 100 11M의 과산화수소를 처리했을 때 시금치 추출물은 87%의 상대적인 세포생존율을 보여 과산화수소 단독처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 200 μM 과산화수소를 처리했을 때 시금치 추출물은 73%의 상대적인 생존율을 보여 과산화수소 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다.
100 11M의 과산화수소를 처리했을 때 시금치 추출물은 87%의 상대적인 세포생존율을 보여 과산화수소 단독처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 200 μM 과산화수소를 처리했을 때 시금치 추출물은 73%의 상대적인 생존율을 보여 과산화수소 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 500 μM의 과산화수소를 처리했을 때는 시금치 추출물은 58%정도의 상대적인 세포생존율을 보여 낮은 농도의 과산화수소를 처리했을 때보다는 세포보호능이 적게 나타났다.
200 μM 과산화수소를 처리했을 때 시금치 추출물은 73%의 상대적인 생존율을 보여 과산화수소 단독 처리했을 때보다 세포생존율이 높은 것으로 나타났다. 500 μM의 과산화수소를 처리했을 때는 시금치 추출물은 58%정도의 상대적인 세포생존율을 보여 낮은 농도의 과산화수소를 처리했을 때보다는 세포보호능이 적게 나타났다.
6에서 ferric tripyridyltriazine (Fein-TPTZ) complex가 reducing agent에 의해서 ferrous tripyridylttiazine (Fen-TPTZ) complex로 될 때 흡광도를 측정하는 것이다. FRAP assay 결과, 시금치추출물의 처리시 추출물의 농도가 높을수록, 그리고 시간이 경과할수록 환원력이 증가되는 것을 볼 수 있었다.
시금치 추출물이 항산화 활성과 acetylcholinesterase 활성 에 대한 저해효과는 시금치추출물 처리농도가 높을수록 유의적으로 높게 나타났다. 과산화수소와 amyloid epeptide에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포주의 세포사멸에 대한 시금치추출액의 억제효과를 살펴본 결과, 과산화수소에 의한 세포사멸에 대하여 시금치추출물은 억제효과를 나타내었으나, amyloid Q-peptide의 경우는 세포사멸억제효과를 나타내지 않았다.
5). 그 결과 amyloid β-peptide(25-35) 의 농도에 따라 세포 사멸이 증가하는 것을 볼 수 있었고, 50 pM의 amyloid Q-peptide를 처리했을 때 대조군에 비해 약 40%의 세포 사멸율을 나타내었다. 또한 대조군의 정상세포들이 신경돌기를 가지고 있는 것과는 달리 부정형이었으며, 세포들이 well 중앙으로 모여 엉기는 모습이 관찰되었고, amyloid B-peptide의 처리 농도가 높을수록 이 러 한 경향이 뚜렷하게 나타났다.
1, 2). 그 결과, 기존의 알려진 항산화 물질인 BHT(butylated hydroxytolune, Sigma)의 DPPH radical 소거 활성 은 72%로 나타났으며 시금치 추출물 1, 3, 5 pL를 처리함에 따라 각각 8, 17, 및 20%의 소거활성을 나타냈다(Fig. 1). Kang 등(19)이 밤꽃 추출물의 전자공여능을 비교한 결과 17.
먼저 과산화수소를 농도별로 처 리하여 MIT assay를 실시하였다. 농도별 과산화수소에 따른 세포 사멸 정도를 알아본 결과 100, 200, 및 500 μM 농도별로 과산화수소를 처리한 군에서는 대조군에 비해 세포가 각각 57, 37, 및 28%의 생존율을 보여 과산화수소 농도가 증가함에 따라 세포사멸율도 증가한다는 것을 알 수 있었다(Fig. 4). 농도별 과산화수소에 따른 시금치 추출물의 세포 보호능을 살펴보았다.
그 결과 amyloid β-peptide(25-35) 의 농도에 따라 세포 사멸이 증가하는 것을 볼 수 있었고, 50 pM의 amyloid Q-peptide를 처리했을 때 대조군에 비해 약 40%의 세포 사멸율을 나타내었다. 또한 대조군의 정상세포들이 신경돌기를 가지고 있는 것과는 달리 부정형이었으며, 세포들이 well 중앙으로 모여 엉기는 모습이 관찰되었고, amyloid B-peptide의 처리 농도가 높을수록 이 러 한 경향이 뚜렷하게 나타났다. 다음으로 50 μM amyloid β-peptide와 시금치 추출물을 함께 처리하면 오히려 대조구보다 더 낮은 세포 생존율을 보였는데, 이는 antioxidant에 의해서 radical이 제거되는 경우도 있지만, 오히려 radical 반응이 연쇄적으로 유발되어 세포 사멸이 더 많이 유도된 것으로 보이나 자세한 분자기전은 더욱 많은 연구가 되어야 명확해 질 것으로 추측된다.
수 있는지를 알아보았다. 시금치 추출물이 항산화 활성과 acetylcholinesterase 활성 에 대한 저해효과는 시금치추출물 처리농도가 높을수록 유의적으로 높게 나타났다. 과산화수소와 amyloid epeptide에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포주의 세포사멸에 대한 시금치추출액의 억제효과를 살펴본 결과, 과산화수소에 의한 세포사멸에 대하여 시금치추출물은 억제효과를 나타내었으나, amyloid Q-peptide의 경우는 세포사멸억제효과를 나타내지 않았다.
2%의 저해활성을 나타내고 있었으나, 그 외 추출물에서는 10% 이하의 활성을 나타내거나 또는 활성을 전혀 나타내지 않았다. 이러한 연구추세에 따라 시금치 추출물의 AChE 활성에 미치는 영향을 분석해 본 결과, 시금치추출물의 첨가 농도가 높을수록 AChE 를 저해하는 활성 이유의 적으로 증가하였다(Fig. 3). 이미 시판되고 있는 Tacrine, Donepezil, Rivastigmine 등의 AChE inhibitor를 인지기능이 손상된 환자에게 투여함으로써 뇌중의 acetylcholine 함량을 증가시켰고 이는 곧 알츠하이머병 환자들에게서인지 기능과 학습 기능의 개선이 있었다는 많은 연구 보고가 있는 점으로 미루어 볼 때 시금치 추출물도 in vitro에서 AChE 를 저해하는 활성이 있다고 판단된다(22).
후속연구
또한 대조군의 정상세포들이 신경돌기를 가지고 있는 것과는 달리 부정형이었으며, 세포들이 well 중앙으로 모여 엉기는 모습이 관찰되었고, amyloid B-peptide의 처리 농도가 높을수록 이 러 한 경향이 뚜렷하게 나타났다. 다음으로 50 μM amyloid β-peptide와 시금치 추출물을 함께 처리하면 오히려 대조구보다 더 낮은 세포 생존율을 보였는데, 이는 antioxidant에 의해서 radical이 제거되는 경우도 있지만, 오히려 radical 반응이 연쇄적으로 유발되어 세포 사멸이 더 많이 유도된 것으로 보이나 자세한 분자기전은 더욱 많은 연구가 되어야 명확해 질 것으로 추측된다.
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