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문제 정의
- 본 연구는 formalin으로 유도한 안면부 통증모델에서 사물탕의 반복투여가 통증행위 반응를 조절하는 지 관찰하고, 통증의 신호 전달경로에서 항염증과 항산화 인자들의 발현에 대한 사물탕의 영향을 알아보고자 하였다. 사물탕의 4가지 단일성분에 대한 각각의 연구에서도 이러한 항염증, 항산화는 증명되고 있다.
- 이러한 내용을 바탕으로 본 연구에서는 포르말린으로 유도된 실험동물의 염증성 통증행위반응에 사물탕이 미치는 영향을 확인하고, 또한 통증신호의 전달과정에서 중요한 인자인 p38 MAPK와 iNOS와 산화적 스트레스의 주요 인자인 NOX4 발현의 변화를 단백정량분석법으로 평가함으로써 사물탕의 항염증과 항산과 효능을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 1차 Ab는 p38 MAPK rabbit mAb, iNOS, NOX4, β-actin monoclonal antibody(Cell Signaling Technology, INC. USA)을 각각 1:2,000, 1:500, 1:500, 1:20,000의 비율로 5% skim milk에 희석하여 사용하였고, p38MAPK, iNOS, NOX4의 2차 Ab인 anti-rabbit IgG(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 b-actin의 2차 Ab는 horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG를 각각 1:8,000, 1:3,000, 1:3,000, 1:10,000의 비율로 sodium azide를 제외한 5% skim milk에 희석시켜 사용 하였다.
- 천연물 재료들은 (천궁, 당귀, 작약, 숙지황)은 부산진 전통약재시장(Busan, Korea)을 통해 구입하였다. 4개의 천연물 약초를 각 5 g 씩을 저울로 정확히 달고 2,000 ml 증료수와 혼합하여 3시간동안 Bio-150을 이용하여 열수추출하였다(DaeHan median, Korea). 총 추출양 200 ml 를 4℃ 냉장보관 하여 실험에 이용하였다.
- Formalin test은 이전 연구에서 사용된 방법과 동일하게 수행하였다[15]. 5% formalin(50 ㎕)을 실험동물(n=6)의 오른쪽 수염부 피하에 주입 직 후부터 5분단위로 누적하여 총 45분간 행위반응을 관찰하였고, 약물이 주입된 안면부를 문지르거나 긁는 행위를 통증 지표로 간주하였다.
- 교반기(WISD, SHO 2D, korea) 위에서 blocking buffer(1X PBST, 탈지분유, sodium azide)로 2시간 blocking하고 7분간 5회에 걸쳐 1X PBST(10X PBST, D.W, 0.1% Tween20)로 수세 후 p38MAPK, NOX4, iNOS, β-actin Anti body(Ab)를 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켰다.
- 사물탕 추출물은 신경아교세포 (glia cell)에서 lipopolysaccharide (LPS)/phor-bol 12-myristate 13-acetate (PMA)의 처리로 증가된 nitric oxide(NO)의 생성과 iNOS(induceble nitric oxide synthase)의 발현을 억제하였고[2], PMA와 A23187 (Ca-ionophore)로 활성화된 HMC-1(Human mast cell-1)에 대해 사물탕 투여군은 proinflammatory cytokine인 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha) 와 IL-6(interleukin-6)를 억제시켜 비만세포(mast cell) 활성을 조절하였다[3].
- 균질화 이후 원심분리기(Hanil science, korea)로 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 세포 찌거기를 제거한 상층액을 X-ma 분광광도계 (Human Cor, Korea)로 595nm에서 단백질 흡광도를 측정하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준화하여 Bio-Rad Protein assay kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하였다.
- 1% Tween20)로 수세 후 p38MAPK, NOX4, iNOS, β-actin Anti body(Ab)를 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켰다. 수세 후 2차 Ab를 교반기 위에서 2시간 실온 부착하였고 발현은 ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 분석하였다. 1차 Ab는 p38 MAPK rabbit mAb, iNOS, NOX4, β-actin monoclonal antibody(Cell Signaling Technology, INC.
- 실험동물은 아무런 처치를 하지 않은 대조군(n=6), formalin 투여군(n=6)과 실험군(n=6)으로 분류하였다. 실험군은 3일간 연속으로 실험동물의 왼쪽아래의 복부에 사물탕(3.5 mg/1 mL)을 복강주사(Intraperitoneal injection)하였고, 3일차 사물탕 주입 후 30분 경과시점에 오른쪽 안면부에 5% formalin(50 ㎕)를 주입하였다.
- 실험동물은 아무런 처치를 하지 않은 대조군(n=6), formalin 투여군(n=6)과 실험군(n=6)으로 분류하였다. 실험군은 3일간 연속으로 실험동물의 왼쪽아래의 복부에 사물탕(3.
- W)를 혼합하여 10분간 95℃에서 가열 시키고 2분간–20에서 보관, 원심 후 voltex로 다시 혼합하였다. 준비된 단백질 sample은 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylaminde gel에 18.5 ㎕로 loading 후 70 V, 100 V,110 V에서 각각 30분, 1시간 30분, 1시간 40으로 전압을 조절하면서 작동시켰다. Gel에서 nitrocellulose membrane으로 단백질을 옮기기 위해 100 V로 2시간동안 이동시켰고, 전체 단백질 패턴을 확인하기 위해 Ponceau 용액으로 확인 후 증류수에 10분간 세척하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(240～280g)를 사용하였다. 12시간 주/야 순환주기 및 23-24℃의 일정한 환경을 유지하면서 물과 사료는 자유로이 공급하였다.
- 천연물 재료들은 (천궁, 당귀, 작약, 숙지황)은 부산진 전통약재시장(Busan, Korea)을 통해 구입하였다. 4개의 천연물 약초를 각 5 g 씩을 저울로 정확히 달고 2,000 ml 증료수와 혼합하여 3시간동안 Bio-150을 이용하여 열수추출하였다(DaeHan median, Korea).
데이터처리
- 모든 결과는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시하였다.
- 실험결과의 통계 분석은 다중 그룹에서 반복측정자료의 분산분석법과 LSD post-hoc test를 이용하였다. 통계적인 비교를 위해 통계적 유의성의 표준값은 p<0.
성능/효과
- 2회로 나타났다. Formalin의 안면부 주입은 아무런 처치를 하지 않은 대조군에 비해 통증행위반응이 증가하였으며, 3일간 반복투여한 사물탕군에서는 통증행위반응이 현저히 감소하였다[Fig 1A]. 3일간 saline을 투여한 대조군에서의 행위반응(441.
- LPS로 유도한 내독소혈증으로 증가한 iNOS와 NO는 p38 MAPK의 억제제에 의해 감소되었고[25], 또한 iNOS 억제제인 S-methylisothioureap는 monododium iodoacetate으로 유도한 골관절염 통증모델에서 NO의 생성을 억제시키고 열성과민반응과 기계적 이질통을 감소시켰다[26]는 연구 결과는, iNOS의 생성은 p38 MAPK의 조절을 통해 염증성 통증발생 및 전도에 관여한다고 설명할 수 있다. 본 연구에서 formalin에 의해 증가한 iNOS의 생성이 사물탕에 의해 감소되었다는 결과는 사물탕이 p38 MAPK/iNOS의 통증신호전달경로를 조절함으로써 통증 완화 효과를 나타내었다고 설명될 수 있다.
- 본 연구에서 전신 투여한 사물탕은 통증행위반응의 감소와 함께 뇌와 연수의 p38 MAPK의 활성이 경감됨을 보여주었고, 이러한 결과는 사물탕에 의한 안면부 통증 조절에 p38 MAPK의 관련성을 입증한 결과이다. p38 MAPK의 활성은 ATP에 의해 활성화되어 p-p38 MAPK로 전환되고, 관련 kinase와 NF-κB와 같은 전사인자를 활성화시킨다고 알려져 있다[6].
- 사물탕의 항염증효과에 따른 안면부 염증성 통증의 조절은 p38 MAPK과 iNOS의 억제를 통해 확인되었다. 실험동물의 안면부에 주입한 포르말린은 통증신호의 전달경로인 p38 MAPK 및 iNOS의 증가와 함께 통증행위 반응을 유발시켰으며, 사물탕의 투여는 p38 MAPK/iNOS 경로를 억제함으로써 안면부 통증을 완화시킨 것으로 사료된다.
- 뿐만 아니라 최근 연구에서 신경병증성 통증모델의 실험동물의 뇌와 척수에서 증가한 p38 MAPK와 p-p38 MAPK의 발현은 ketamine의 진정효과로 인해 두 단백질 모두 감소하였다[23]. 이러한 연구결과를 바탕으로 formalin에 의한 조직손상으로 발현되는 염증성 통증발생 및 전도가 중추성 p38 MAPK의 활성 억제에 의해 조절될 수 있다는 것을 알 수 있다.
- 이러한 연구결과와 마찬가지로, 본 연구에서도 사물탕의 투여는 formalin에 의해 유도된 안면부 통증행위반응을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였고, 사물탕이 안면부 염증성 통증의 신호전달을 매개하는 여러 인자들의 조절을 통해 안면부 통증행위반응에 관여함을 증명하였다.
- 실험동물의 안와하신경 결찰로 유도한 안면부 이질통은 p38 MAPK의 억제제인 SB203580의 복강투여로 이질통이 감소되었고[8], Freund's Complete Adjuvant(CFA)에 의해 유도된 악관절 통증모델에서 SB203580의 소뇌연수조 투여는 실험동물의 이질통을 유의하게 감소시켰다[9]. 이러한 연구는 다양한 원인으로 발생하는 안면부 통증신호의 전달에 p38 MAPK 활성화가 중요한 인자임을 증명하였다.
후속연구
- 또한 사물탕은 NOX4억제를 통한 항산화적 특성을 나타내었다. 이러한 내용을 바탕으로 사물탕의 항염증, 항산화적 효과는 안면부 통증의 치료에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대되는 바이다.
- 또한 사물탕 각각의 재료의 추출물은 높은 superoxide dismutase(SOD) 유사활성과 우수한 아질산염 소거능에 대한 보고가 있으며[4], 본 연구실의 최근 보고에 따르면, 사물탕의 단회투여는 실험동물의 안면부 통증행위반응 조절에 유의한 효과를 나타내었다[5]. 이러한 내용을 종합해 보면 사물탕의 여러 가지 약리적 작용과 함께 항염증 및 항진정 효과를 보여줌으로써 통증발생 및 조절에 기여할 것으로 사료된다.
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