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문제 정의
- 본 연구에서는 설악산에 분포하는 신갈나무와 졸참나무 개체들을 대상으로 분포 양상을 파악하고, 두 종간에 다양한 형태의 중간형이 보고되어 잡종화 가능성이 높으므로 이에 두 종 간의 잡종화에 의한 교잡이입 가능성을 고도에 따른 두 종 개체들의 flavonoid 조성 변이를 통해 이해하고자 하였다.
- 본 연구의 주 대상인 설악산 지역의 고도 별로 분포하는 신갈나무, 졸참나무 2종 32개체 및 두 종의 지역간 플라보노이드 조성 변이를 비교하기 위한 목적으로 포함된 남부지방인 지리산의 고지대 신갈나무 및 저지대 졸참나무 각 1개체 등 총 34개체에 대해 그 flavonoid 조성을 two-Dimentional Thin Layer Chromatography (2-D TLC)와 paper Chromatography (1-D PC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 사용하여 분석하였다(Fig. 1). 이들 개체 중 2종에 속하는 2개체의 재료는 flavonoid의 구조 동정을 위해 사용하였으며(full analysis), 나머지 개체들은 2-D TLC와 HPLC profile을 사용하여 그 flavonoid 조성을 확인하였다.
제안 방법
- 2D-TLC와 HPLC profile을 이용한 flavonoid 조성 분석: 다수 개체의 분석을 위해 2D-TLC와 HPLC profile을 이용하여 flavonoid 조성을 분석하였다.
- Flavonoid compound의 검출은 254 nm에서 0.5-1 a.u.f.s. sensitivity로 수행하였으며, 각 peak의 absolute retention time은 stopwatch를 사용하여 측정하였다.
- sensitivity로 수행하였으며, 각 peak의 absolute retention time은 stopwatch를 사용하여 측정하였다. HPLC상에서 분리된 flavonoid peak들은 그 구조 동정을 위해 각각 collection되었으며, 완전한 구조 동정을 위한 충분한 양을 확보하기 위하여 각 sample당 6-10회 반복하여 동일한 조건하에서 HPLC를 수행하였다.
- 가수분해한 수용액은 EtOAc로 aglycone을 추출, 제거하였으며, 남은 수용액을 1-2방울 정도로 농축한 뒤 TLC를 사용하여 포함되어 있는 sugar를 동정하였다.
- 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 mild alkaline hydrolysis [34]를 수행하였다. 각 flavonoid compound에 결합되어 있는 sugar를 동정하기 위한 acid hydrolysis는 7% HCl 수용액을 사용하여 100℃의 water bath에서 60분 동안 수행하였으며, diglycoside의 경우 결합되어 있는 sugar의 순서를 밝히기 위해 partial hydrolysis [31, 34]를 병행하였다. 가수분해한 수용액은 EtOAc로 aglycone을 추출, 제거하였으며, 남은 수용액을 1-2방울 정도로 농축한 뒤 TLC를 사용하여 포함되어 있는 sugar를 동정하였다.
- 그 결과 paper chromatogram 상에서 분리된 각 flavonoid band를 가늘게 자른 후 100% MeOH로 elution하여 농축, 여과한 후 이를 high performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 포함되어 있는 flavonoid compound들을 완전히 분리, 정제하였다.
- Sugar 동정을 위한 TLC는 상기한 방법에 의해 얻어진 농축액을 standard sugar들과 함께 cellulose TLC plate에 spotting 한 후, n-butanol-ethyl acetate-acetic acid-pyridine-water (35:35:5:25:15, v/v/v/v/v)로 전개하였다[41]. 그 결과 분리된 sugar spot들을 aniline hydrogen phthalate 용액으로 발색시켜 standard sugar와 그 spot위치 및 발색색깔을 비교하여 동정하였다[34]. 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 alkaline hydrosis[15]를 수행하였다.
- 농축된 추출액은 chloroform과 ethyl acetate (EtOAc)를 사용하여 flavonoid compound만을 추출하였으며, 그 결과 얻어진 flavonoid compound를 포함하는 EtOAc fraction을 다시 rotary vacuum evaporator를 사용하여 소량으로 농축, cellulose thin layer chromatography plate (Merck, thickness 100 μm, 20 cm × 20 cm)에 소량 spotting한 뒤 이를 TBA (tert.-butanol-acetic acid-water, 3:1:1, v/v/v)와 15% HOAc (15% acetic acid in water)를 용매로 하여 2차원 전개시켜 UV light 하에서 각 분류군에 분포하는 flavonoid compound의 profile을 확인하였다.
- 그 결과 분리된 sugar spot들을 aniline hydrogen phthalate 용액으로 발색시켜 standard sugar와 그 spot위치 및 발색색깔을 비교하여 동정하였다[34]. 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 alkaline hydrosis[15]를 수행하였다.
- value, UV light에서의 색깔 및 HPLC 상에서의 RT (retention time), co-chromatography 등의 방법[17, 31, 34, 36, 41]을 이용하여 그 구조를 동정하였다. 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 mild alkaline hydrolysis [34]를 수행하였다. 각 flavonoid compound에 결합되어 있는 sugar를 동정하기 위한 acid hydrolysis는 7% HCl 수용액을 사용하여 100℃의 water bath에서 60분 동안 수행하였으며, diglycoside의 경우 결합되어 있는 sugar의 순서를 밝히기 위해 partial hydrolysis [31, 34]를 병행하였다.
- 분석은 건조한 잎 3 g 정도를 사용하였으며, 추출용액 양을 건조한 잎의 무게에 비례되게 낮추었을 뿐 추출 및 농축과정은 위의 full analysis와 동일한 방법으로 flavonoid 성분을 추출하였고, 2-D TLC의 spot의 위치, 진하기와 HPLC의 RT (retention time) 및 peak 높이를 이용하여 각 개체의 flavonoid 조성 성분을 정량 · 정성분석 하였다.
- 상기한 방법으로 일차 분리, 농축한 각 flavonoid sample은 2% HOAc에서 acetonitrile의 농도를 15%에서 30%로 27분에 걸쳐 변화시킨 gradient elution 방법(15- 30% acetonitrile in 2% HOAc, flow rate 3ml/ min, 27 min cycle)을 사용하여 순수 분리, 정제하였으며, 분리가 잘 되지 않는 일부 compound의 분리, 동정을 위해서 gradient elution 방법을 약간 변형(15-31% acetonitrile in 2% HOAc, flow rate 3ml/ min, 33 min cycle)하거나 isocratic elution을 이용하였다.
- 1). 이들 개체 중 2종에 속하는 2개체의 재료는 flavonoid의 구조 동정을 위해 사용하였으며(full analysis), 나머지 개체들은 2-D TLC와 HPLC profile을 사용하여 그 flavonoid 조성을 확인하였다.
- -butanol-acetic acid-water, 3:1:1, v/v/v)와 15% HOAc (15% acetic acid in water)를 용매로 하여 2차원 전개시켜 UV light 하에서 각 분류군에 분포하는 flavonoid compound의 profile을 확인하였다. 이후, 상기한 2-dimensional TLC 상에서 확인된 flavonoid compound를 분리하기 위하여 동일 EtOAc fraction을 Whatman 3MM chromatography paper위에 가는 band 모양으로 streaking한 후 15% HOAc를 solvent로 하여 1차원으로 전개시켰다. 그 결과 paper chromatogram 상에서 분리된 각 flavonoid band를 가늘게 자른 후 100% MeOH로 elution하여 농축, 여과한 후 이를 high performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 포함되어 있는 flavonoid compound들을 완전히 분리, 정제하였다.
- 지리산 및 설악산에 분포하는 신갈나무 및 졸참나무 2종 34개체의 flavonoid 조성을 분석한 결과, 이 개체들의 잎 추출액으로부터 모두 24가지의 서로 다른 flavonoid compound들이 분리, 동정되었으며, 이들의 화학구조, UV spectral data 및 2D TLC상에서의 Rf 값, HPLC 상에서의 retention time, UV light 하에서 색깔 등의 화학적 특성은 Fig. 2와 Table 1, 2에 수록하였다. 또한, 이들 compound들의 2D TLC상에서의 mobility는 Fig.
- 추출 및 일차정제(Extraction and preliminary purification): Flavonoid compound의 추출 및 일차 정제는 Park [41] 및 Mun and Park [36]의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 상온에서 건조시킨 약 5-10 g의 잎을 분쇄하여 이로부터 85% aqueous methanol (MeOH) 200 ml로 2회, 50% MeOH 200 ml로 1회씩 상온에서 각각 12시간 flavonoid compound를 추출한 뒤, 이를 여과하여 rotary vacuum evaporator로 농축시켰다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 1999년 10월부터 2007년 7월까지 본 연구의 주 대상지인 설악산(양양, 속초) 및 지리산(구례, 남원)의 신갈나무와 졸참나무 개체들을 대상으로 고도를 따라 올라가면서 채집조사와 동시에 육안으로 생육 및 분포상황을 관찰하였다. 조사 기간에 채집된 개체의 표본은 서울대학교 자연과학대학 생명과학부 표본관(SNU)에 확증표본으로 소장하였다.
- 본 연구에서는 2000년 9월 본 연구의 주 대상지인 설악산 오색-대청봉 구간에서 채집한 신갈나무와 졸참나무 개체들 및 설악산 기슭인 속초의 저고도 지대에서 채집한 신갈나무 개체들, 그리고 1999년 10월 및 2000년 9-10월 지리산에서 채집된 신갈나무 및 졸참나무 개체들을 사용하였다. 지리산의 신갈나무와 졸참나무의 flavonoid 분석은 두 종의 flavonoid 조성의 종간 변이 및 종내 개체군간 지역적 변이의 비교를 위한 것이다.
- 본 연구에서는 1999년 10월부터 2007년 7월까지 본 연구의 주 대상지인 설악산(양양, 속초) 및 지리산(구례, 남원)의 신갈나무와 졸참나무 개체들을 대상으로 고도를 따라 올라가면서 채집조사와 동시에 육안으로 생육 및 분포상황을 관찰하였다. 조사 기간에 채집된 개체의 표본은 서울대학교 자연과학대학 생명과학부 표본관(SNU)에 확증표본으로 소장하였다.
- 지리산의 신갈나무와 졸참나무의 flavonoid 분석은 두 종의 flavonoid 조성의 종간 변이 및 종내 개체군간 지역적 변이의 비교를 위한 것이다. 채집된 개체들의 표본은 서울대학교 자연과학대학 생명과학부 표본관(SNU)에 확증표본으로 소장하였다.
이론/모형
- 구조 동정 (Structural identification): HPLC에서 분리 정제한 각 flavonoid compound는 UV spectral analysis, acid 및 alkaline hydrolysis, partial hydrolysis, cellulose TLC 상에 서의 Rf value, UV light에서의 색깔 및 HPLC 상에서의 RT (retention time), co-chromatography 등의 방법[17, 31, 34, 36, 41]을 이용하여 그 구조를 동정하였다. 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 mild alkaline hydrolysis [34]를 수행하였다.
성능/효과
- 이러한 경향은 또한 지리산 지역의 신갈나무와 졸참나무의 종간 차이에서도 나타난다(Table 3). Compound 23의 경우도 compound 14의 함유 양상과 유사하게 졸참나무와 동소적으로 분포하는 저지대 신갈나무의 경우 거의 모든 개체들이 compound 23을 함유하는 것으로 확인되었다(Table 3). 이러한 현상은 동소적으로 함께 생육하는 상대 종(신갈나무↔졸참나무)과 유사한 flavonoid compound 조성을 갖는 경향을 나타낸 상기 언급한 compound 3, 4, 6, 14에서의 현상과 동일한 양상이다(Table 3).
- Flavonoid 분석 결과, 한국산 신갈나무와 졸참나무는 flavonoid 조성에 있어 차이가 있는 것으로 밝혀졌으며, 각 종은 종내 변이가 존재하는 것으로 나타났다(Table 3). 신갈나무의 flavonoid 조성은 acylated flavonol인 acylated kaempferol 3-O-glucoside, acylated quercetin 3-O-galactoside 및 acylated quercetin 3-O-glucoside (compounds 9, 16-17)가 다량 나타나며, diglycoside인 quercetin 3-O-arabinosylglucoside (compound 15)가 분포한다는 점에서 졸참나무의 flavonoid 조성과 구분된다.
- 본 연구 대상 두 종, 신갈나무(Q. mongolica)와 졸참나무(Q. serrata)는 형태적으로 뚜렷이 구분되는 분류군으로서, 신갈나무는 견과의 크기와 모양, 각두 및 포린의 크기와 모양, 잎의 형태, 크기, 잎 상하면의 털의 종류 및 분포 양상, 소지의 직경 및 소지의 털에 있어서 졸참나무와 뚜렷이 차이가 나며, 이는 한국산 참나무아속 6종에 대한 주성분분석에서 기여율이 가장 높은 주성분 1과 2를 축으로 한 배열에서도 두 종은 뚜렷이 구분되어 위치한다[43].
- 설악산 신갈나무 개체들 중 졸참나무와 동소적으로 분포하는 저지대 신갈나무의 경우 거의 모든 개체들이 compound 14를 함유하며 일부 개체(‘속초 IV신갈’)는 졸참나무처럼 다량(+++) 함유하는 것으로 확인되었다(Table 3).
- Compound 6 (Kaempferol 3-O-rhamnoside)은 신갈나무에 비해 rhamnosyl flavonol compound가 상대적으로 다량 나타나는 졸참나무의 flavonoid 조성 특징을 잘 드러내는 compound들(compounds 6, 14, 23) 중의 하나로, 신갈나무 개체들 중 일부 개체들에 소량 또는 극소량으로 나타나나, 졸참나무의 경우 전 개체에서 나타나며, 이러한 경향은 지리산 지역의 신갈나무와 졸참나무의 종간 차이에서도 확인된다(Table 3). 설악산 신갈나무 개체들은 compound 6을 함유함에 있어서 개체 간 변이를 나타내며 졸참나무와 동소적으로 분포하는 저지대 신갈나무 개체들의 compound 6 함유량이 고지대 개체들보다 훨씬 높은 것이 확인되었다(Table 3). 동소적으로 분포하는 상대 종(신갈나무↔졸참나무)과 유사한 flavonoid compound 조성을 갖는 이러한 양상은 compound 3, 4의 경우와 비슷하다(Table 3).
- 신갈나무와 졸참나무 간에 서로 교배가 잘 일어나며 상기한 바와 같이 두 종간 유전자 교류가 자주 일어나고 있음을 암시하는 결과로 볼 때, 형태적으로 신갈나무와 졸참나무의 중간적인 특징을 나타내며 다양한 형태 변이를 나타내는 물참나무(Q. crispula Blume = Q. grosseserrata Blume)는 신갈나무와 졸참나무 두 종을 부모종으로 하는 교잡에 의해 생겼을 가능성이 높으며, 따라서 본 연구 결과는 물참나무를 독립된 종 또는 신갈나무의 변종(Q. mongolica var. crispula = Q. mongolica var. grosseserrata)으로 인식한 Chung [6], Lee [27] 및 Lee [28]의 견해보다는 신갈나무와 졸참나무 간의 잡종분류군으로 인식한 Lee [23, 26], Chang [4] 및 Park [42]의 견해와 부합된다.
- 2, Table 2). 이들 sugar는 모두 3-OH group에 결합되어 있었으며, 이중 glucose는 mono- 또는 diglycoside의 형태로 분석된 모든 개체에서 가장 흔하게 나타났다(Fig. 2, Table 2, 3). 또한 compound 7 및 19는 flavonol glycoside이었으나 극히 소량 존재하여 결합되어 있는 sugar를 동정하지 못하였다(Table 2).
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