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문제 정의
- 본 연구에서는 1999년 9월부터 2009년 8월까지 전국 각지의 신갈나무와 졸참나무 개체들을 대상으로 고도를 따라 올라가면서 채집조사와 동시에 육안으로 생육 및 분포상황을 관찰하였다. 조사 기간에 채집된 개체들의 표본은 서울 대학교 자연과학대학 생명과학부 표본관(SNU)에 확증표본으로 소장하였다.
- 본 연구에서는 우리나라에서 널리 분포하며 분류학적, 생태학적으로 중요한 수종인 신갈나무와 졸참나무를 대상으로 분포 특성을 파악하고, 두 종 간 잡종화에 의한 교잡이입 가능성을 지리산을 중심으로 고도에 따른 flavonoid compound의 화학조성 변이(phytochemical variation)를 통해 이해하고도 하였다.
제안 방법
- 2D-TLC와 HPLC profile을 이용한 flavonoid 조성 분석: 다수 개체의 분석을 위해 2D-TLC와 HPLC profile을 이용하여 flavonoid 조성을 분석하였다. 분석은 건조한 잎 3g 정도를 사용하였으며, 추출용액 양을 건조한 잎의 무게에 비례되게 낮추었을 뿐 추출 및 농축과정은 위의 full analysis와 동일한 방법으로 flavonoid 성분을 추출하였고, 2-D TLC의 spot의 위치, 진하기와 HPLC의 RT(retention time) 및 peak 높이를 이용하여 각 개체의 flavonoid 조성 성분을 정량·정성분석 하였다.
- 상기한 방법으로 일차 분리, 농축한 각 flavonoid sample은 2% HOAc에서 acetonitrile의 농도를 15%에서 30%로 27분에 걸쳐 변화시킨 gradient elution 방법(15~30% acetonitrile in 2% HOAc, flow rate 3㎖/min, 27 min cycle)을 사용하여 순수 분리, 정제하였으며, 분리가 잘 되지 않는 일부 compound의 분리, 동정을 위해서 gradient elution 방법을 약간 변형(15~31% acetonitrile in 2% HOAc, flow rate 3㎖/min, 33 min cycle)하거나 isocratic elution을 이용하였다. Flavonoid compound의 검출은 254 nm에서 0.5~1 a.u.f.s. sensitivity 로 수행하였으며, 각 peak의 absolute retention time은 stopwatch를 사용하여 측정하였다. HPLC상에서 분리된 flavonoid peak들은 그 구조 동정을 위해 각각 collection되었으며, 완전한 구조 동정을 위한 충분한 양을 확보하기 위하여 각 sample당 6~10회 반복하여 동일한 조건하에서 HPLC를 수행하였다.
- sensitivity 로 수행하였으며, 각 peak의 absolute retention time은 stopwatch를 사용하여 측정하였다. HPLC상에서 분리된 flavonoid peak들은 그 구조 동정을 위해 각각 collection되었으며, 완전한 구조 동정을 위한 충분한 양을 확보하기 위하여 각 sample당 6~10회 반복하여 동일한 조건하에서 HPLC를 수행하였다.
- , 1970; Markham, 1982)를 병행하였다. 가수 분해한 수용액은 EtOAc로 aglycone을 추출, 제거하였으며, 남은 수용액을 1~2방울 정도로 농축한 뒤 TLC를 사용하여 포함되어 있는 sugar를 동정하였다. Sugar 동정을 위한 TLC는 상기한 방법에 의해 얻어진 농축액을 standard sugar 들과 함께 cellulose TLC plate에 spotting 한 후, n-butanol-ethyl acetate-acetic acid-pyridine-water (35:35:5:25:15, v/v/v/v/v) 로 전개하였다(Park, 1987).
- 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 mild alkaline hydrolysis(Markham, 1982)를 수행하였다. 각 flavonoid compound에 결합되어 있는 sugar를 동정하기 위한 acid hydrolysis는 7% HCl 수용액을 사용하여 100℃의 water bath에서 60분 동안 수행하였으며, diglycoside의 경우 결합되어 있는 sugar의 순서를 밝히기 위해 partial hydrolysis (Mabry et al., 1970; Markham, 1982)를 병행하였다. 가수 분해한 수용액은 EtOAc로 aglycone을 추출, 제거하였으며, 남은 수용액을 1~2방울 정도로 농축한 뒤 TLC를 사용하여 포함되어 있는 sugar를 동정하였다.
- 이후, 상기한 2-dimensional TLC 상에서 확인된 flavonoid compound를 분리하기 위하여 동일 EtOAc fraction을 Whatman 3MM chromatography paper 위에 가는 band 모양으로 streaking한 후 15% HOAc를 solvent로 하여 1차원으로 전개시켰다. 그 결과 paper chromatogram 상에서 분리된 각 flavonoid band를 가늘게 자른 후 100% MeOH로 elution하여 농축, 여과한 후 이를 high performance liquid chromatography(HPLC)를 사용하여 포함되어 있는 flavonoid compound들을 완전히 분리, 정제하였다.
- Sugar 동정을 위한 TLC는 상기한 방법에 의해 얻어진 농축액을 standard sugar 들과 함께 cellulose TLC plate에 spotting 한 후, n-butanol-ethyl acetate-acetic acid-pyridine-water (35:35:5:25:15, v/v/v/v/v) 로 전개하였다(Park, 1987). 그 결과 분리된 sugar spot들을 aniline hydrogen phthalate 용액으로 발색시켜 standard sugar 와 그 spot위치 및 발색색깔을 비교하여 동정하였다(Markham, 1982). 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 alkaline hydrolysis(Isobe et al.
- 농축된 추출액은 chloroform과 ethyl acetate (EtOAc)를 사용하여 flavonoid compound만을 추출하였으며, 그 결과 얻어진 flavonoid compound를 포함하는 EtOAc fraction은 다시 rotary vacuum evaporator 를 사용하여 소량으로 농축하여, cellulose thin layer chromatography plate(Merck, thickness 100 µm, 20 cm × 20 cm)에 소량 spotting한 뒤 이를 TBA(tert.-butanolacetic acid-water, 3:1:1, v/v/v)와 15% HOAc(15% acetic acid in water)를 용매로 하여 2차원 전개시켜 UV light 하에서 각 분류군에 분포하는 flavonoid compound의 profile 을 확인하였다.
- 그 결과 분리된 sugar spot들을 aniline hydrogen phthalate 용액으로 발색시켜 standard sugar 와 그 spot위치 및 발색색깔을 비교하여 동정하였다(Markham, 1982). 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 alkaline hydrolysis(Isobe et al., 1980)를 수행하였다.
- , 2000a; 2000b)을 이용하여 그 구조를 동정하였다. 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 mild alkaline hydrolysis(Markham, 1982)를 수행하였다. 각 flavonoid compound에 결합되어 있는 sugar를 동정하기 위한 acid hydrolysis는 7% HCl 수용액을 사용하여 100℃의 water bath에서 60분 동안 수행하였으며, diglycoside의 경우 결합되어 있는 sugar의 순서를 밝히기 위해 partial hydrolysis (Mabry et al.
- 분석은 건조한 잎 3g 정도를 사용하였으며, 추출용액 양을 건조한 잎의 무게에 비례되게 낮추었을 뿐 추출 및 농축과정은 위의 full analysis와 동일한 방법으로 flavonoid 성분을 추출하였고, 2-D TLC의 spot의 위치, 진하기와 HPLC의 RT(retention time) 및 peak 높이를 이용하여 각 개체의 flavonoid 조성 성분을 정량·정성분석 하였다.
- 8㎜ × 30㎝)을 사용하였다. 상기한 방법으로 일차 분리, 농축한 각 flavonoid sample은 2% HOAc에서 acetonitrile의 농도를 15%에서 30%로 27분에 걸쳐 변화시킨 gradient elution 방법(15~30% acetonitrile in 2% HOAc, flow rate 3㎖/min, 27 min cycle)을 사용하여 순수 분리, 정제하였으며, 분리가 잘 되지 않는 일부 compound의 분리, 동정을 위해서 gradient elution 방법을 약간 변형(15~31% acetonitrile in 2% HOAc, flow rate 3㎖/min, 33 min cycle)하거나 isocratic elution을 이용하였다. Flavonoid compound의 검출은 254 nm에서 0.
- 지리산의 저지대와 고지대에 고도 별로 분포하는 신갈나무, 졸참나무 2종 32개체 및 설악산, 소백산, 마니산에 분포하는 신갈나무, 졸참나무 5개체 등 총 37개체에 대해 그 flavonoid 조성을 two-Dimentional Thin Layer Chromatography (2-D TLC)와 paper Chromatography(1-D PC), High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 사용하여 분석하였다(Figure 1). 이들 개체 중 신갈나무 4개체, 졸참나무 2개체 등 6개체의 재료는 flavonoid의 구조 동정을 위해 사용하였으며(full analysis), 그 나머지 개체들은 2D-TLC와 HPLC profile을 사용하여 그 flavonoid 조성을 확인하였다.
- -butanolacetic acid-water, 3:1:1, v/v/v)와 15% HOAc(15% acetic acid in water)를 용매로 하여 2차원 전개시켜 UV light 하에서 각 분류군에 분포하는 flavonoid compound의 profile 을 확인하였다. 이후, 상기한 2-dimensional TLC 상에서 확인된 flavonoid compound를 분리하기 위하여 동일 EtOAc fraction을 Whatman 3MM chromatography paper 위에 가는 band 모양으로 streaking한 후 15% HOAc를 solvent로 하여 1차원으로 전개시켰다. 그 결과 paper chromatogram 상에서 분리된 각 flavonoid band를 가늘게 자른 후 100% MeOH로 elution하여 농축, 여과한 후 이를 high performance liquid chromatography(HPLC)를 사용하여 포함되어 있는 flavonoid compound들을 완전히 분리, 정제하였다.
- 지리산의 저지대와 고지대에 고도 별로 분포하는 신갈나무, 졸참나무 2종 32개체 및 설악산, 소백산, 마니산에 분포하는 신갈나무, 졸참나무 5개체 등 총 37개체에 대해 그 flavonoid 조성을 two-Dimentional Thin Layer Chromatography (2-D TLC)와 paper Chromatography(1-D PC), High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 사용하여 분석하였다(Figure 1). 이들 개체 중 신갈나무 4개체, 졸참나무 2개체 등 6개체의 재료는 flavonoid의 구조 동정을 위해 사용하였으며(full analysis), 그 나머지 개체들은 2D-TLC와 HPLC profile을 사용하여 그 flavonoid 조성을 확인하였다.
- 추출 및 일차정제(Extraction and preliminary purification): Flavonoid compound의 추출 및 일차 정제는 Park(1987) 및 Mun and Park(1995)의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 상온에서 건조시킨 약 5~10 g의 잎을 분쇄하여 이로부터 85% aqueous methanol(MeOH) 200 ml로 2회, 50% MeOH 200 ml로 1회씩 상온에서 각각 12시간 flavonoid compound를 추출한 뒤, 이를 여과하여 rotary vacuum evaporator로 농축시켰다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 1999년 10월 및 2000년 9~10월에 본 연구의 주 대상지인 지리산 화엄계곡~코재~노고단~주능선 임걸령 구간에서 고도별로 채집한 신갈나무, 졸참나무 32개체와 2000년 9월 설악산 오색~대청봉 구간, 2000년 9월 마니산, 2002년 10월 소백산에서 채집한 신갈나무, 졸참나무 5개체 등 2종에 속하는 총 37개체를 재료로 사용하였다. 지리산 외 지역의 신갈나무 및 졸참나무 개체들은 소수로, 두 종의 종간 변이 및 종내 개체군간 지역적 변이 비교를 위한 것이다.
- 본 연구에서는 1999년 9월부터 2009년 8월까지 전국 각지의 신갈나무와 졸참나무 개체들을 대상으로 고도를 따라 올라가면서 채집조사와 동시에 육안으로 생육 및 분포상황을 관찰하였다. 조사 기간에 채집된 개체들의 표본은 서울 대학교 자연과학대학 생명과학부 표본관(SNU)에 확증표본으로 소장하였다.
- 본 연구에서는 1999년 9월부터 2009년 8월까지 전국 각지의 신갈나무와 졸참나무 개체들을 대상으로 고도를 따라 올라가면서 채집조사와 동시에 육안으로 생육 및 분포상황을 관찰하였다. 조사 기간에 채집된 개체들의 표본은 서울 대학교 자연과학대학 생명과학부 표본관(SNU)에 확증표본으로 소장하였다.
이론/모형
- 구조 동정 (Structural identification): HPLC에서 분리 정제한 각 flavonoid compound는 UV spectral analysis, acid 및 alkaline hydrolysis, partial hydrolysis, cellulose TLC 상에서의 Rf value, UV light에서의 색깔 및 HPLC 상에서의 RT(retention time), co-chromatography 등의 방법(Mabry et al., 1970; Markham, 1982; Park, 1987; Mun and Park, 1995; Kim et al., 2000a; 2000b)을 이용하여 그 구조를 동정하였다. 또한 acylated flavonoid compound의 존재를 확인하기 위하여 일부 compound에 대한 mild alkaline hydrolysis(Markham, 1982)를 수행하였다.
성능/효과
- compound 22는 신갈나무 개체들에 소량, 극소량 함유되어 있거나 또는 전무하기도 하는 등 개체 간에 변이가 있으나, 졸참나무의 경우 거의 전 개체에서 다량으로 나타나며, 이러한 두 종간 조성의 차이는 지리산 외 지역에서도 확인된다(Table 3). Compound 22의 경우에도 compounds 6, 14의 함유 양상과 유사하였는데, 졸참나무와 동소적으로 분포하는 신갈나무 개체들 중 여러 개체가 compound 22를 함유하였으며, 반대로 졸참나무와 동소적이지 않은 고지대 신갈나무 개체들은 거의 compound 22를 함유하지 않는 것으로 나타났다(Table 3). 이 역시 동소적으로 분포하는 두 종의 개체들이 상대 종 (신갈나무↔졸참나무)과 유사한 flavonoid compound 조성을 갖는 경향을 보이는 것으로 이러한 양상은 compounds 3, 4, 6, 14에서의 양상과 비슷하다(Table 3).
- Compound 3(Kaempferol 3-O-arabinoside I)의 경우 신갈나무 잎에는 ‘+’의 량으로 함유되어 있으나 졸참나무의 잎에는 개체에 따라 ‘+’ 또는 ‘tr’로 상대적으로 적은 량이 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 이러한 것은 지리산 외 지역의 신갈나무와 졸참나무의 종간 차이에서 잘 확인된다(Table 3).
- Flavonoid 분석 결과, 한국산 신갈나무와 졸참나무는 flavonoid 조성에 있어 차이가 있는 것으로 밝혀졌으며, 각종은 종내 변이가 존재하는 것으로 나타났다(Table 3). 신갈나무의 flavonoid 조성은 acylated flavonol인 acylated kaempferol 3-O-glucoside(compound 9), acylated quercetin 3-O-galactoside 및 acylated quercetin 3-O-glucoside (compounds 16-17)가 다량 나타나며, diglycoside인 quercetin 3-O-arabinosylglucoside (compound 15)가 분포한다는 점에서 졸참나무의 flavonoid 조성과 구분된다(Tables 2, 3).
- Arabinose는 pyranose와 furanose의 두가지 고리형(ring form)이 있으며(Williams and Harborne, 1994), Rf값 등 화학적 성질이 서로 다른 4가지 형의 quercetin 3-O-arabinoside가 있는 것이 보고되어 있다(Hattori, 1962). 또한 quercetin 3-O-arabinoside I, II 외에도 본 연구 결과에서는 신갈나무, 졸참나무 두 종의 개체들로부터 서로 다른 Rf값을 갖는 kaempferol 3-O-arabinoside I, II, III(compounds 4-6)가 검출되었다. 이들 compound들에 대해 Mild alkaline hydrolysis(Markham, 1982)를 수행한 결과, 이들은 Rf값의 변화가 없었으며, H2O2 oxidation을 수행한 결과 arabinose가 검출되었다.
- 또한, 지리산 및 기타지역에서 분포하는 신갈나무 및 졸참나무 2종 37개체로부터 서로 다른 4 종류의 acylated flavonoid compound(compounds 9, 16-17, 23)가 분리 동정되었다(Tables 2, 3). 이들 compound에 대해 alkaline hydrolysis(Markham, 1982)를 수행한 결과, compound 9는 kaempferol 3-O-glucoside로, compound 16과 17은 각각 quercetin 3-O-galactoside, quercetin 3-O-glucoside로 변화하였으며, 또한 compound 23은 myricetin 3-O-glucoside로 각각 변화하였다.
- 본 연구에서 사용된 신갈나무의 대부분 개체는 전형적인 신갈나무이지만, 극히 일부 개체의 경우 잎과 열매의 형태나 생육형은 거의 신갈나무와 동일하나 잎 상·하면의 기부 일부분에 졸참나무의 성모 및 단모가 드물게 나타나거나 소지에 아주 드물게 단모가 나타난다.
- 본 연구의 한국산 신갈나무와 졸참나무 2종은 flavonoid 조성은 적은 수의 compound(compounds 5, 7, 15, 22)에 있어서 정성적인 차이(드물게 예외적인 개체가 있으나)와 함께 상기한 바와 같이 정량적인 차이가 나며, 종내 개체 간에는 고도에 따라서 정량적 또는 정성적인 조성 변이가 관찰되었다(Table 3).
- 신갈나무와 졸참나무 간에 서로 교잡이 일어나며 상기한 바와 같이 두 종간 유전자 교류와 함께 교잡 이입현상이 빈번이 일어나고 있음을 암시하는 본 연구결과로 볼 때, 형태적으로 신갈나무와 졸참나무의 중간적인 특징을 나타내며 다양한 형태 변이를 나타내는 물참나무는 신갈나무와 졸참나무 두 종을 부모종으로 하는 교잡에 의해 생겼을 가능성이 높은 것으로 판단된다. 그러므로 본 연구 결과는 물참나무를 독립된 종(Q.
- ). 종합적으로, 신갈나무와 졸참나무는 서로 다른 분포양상을 보이며 신갈나무가 내륙적이면서 대륙성 기후 입지의 특성을 갖고 냉온대 산지대를 중심으로 생육하는 입지 특성을 갖는 반면, 졸참나무는 한반도 남부 저산지대의 해발고도가 낮고 온난하며 상대적으로 해양성 기후를 나타내는 입지 특성을 갖는다(Kim and Lee, 2006; Kim, 2013; J. Park, Pers. Observ.). 그러나, 두 종은 특정한 높은 고지대를 제외한 우리나라 전 지역에서 동소적으로 함께 생육하며, 두 종간 교잡이 일어나는 것으로 알려져 있다(Lee, 1961a; 1961b; Chang and Lee, 1984; Park et al.
- 지리산 고지대의 신갈나무 개체들은 compound 4를 함유하나 고도가 낮아지면서 이들 신갈나무 개체들은 졸참나무처럼 compound 4를 함유하고 있지 않거나 소량 함유하며, 반면 신갈나무와 동소적으로 생육하는 졸참나무 개체들 중 일부는 소량(‘+’) 또는 극소량(‘tr’)을 함유하는 것으로 나타났다(Table 3).
- compound 6은 지리산 지역의 지리산 신갈나무 개체들에는 소량, 극소량 함유되어 있거나 또는 전무하나, 졸참나무의 경우 전 개체에서 나타나며, 이 또한 지리산 외 지역의 신갈나무와 졸참나무의 종간 차이에서도 확인된다(Table 3). 지리산 신갈나무 개체들은 compound 6을 함유함에 있어서 개체 간 변이를 나타내나며 졸참나무와 동소적으로 분포하는 신갈나무 개체들(해발 400~1200 m)은 대체로 compound 6을 함유하나 고지대(해발 1200 m 이상; 노고단-임걸령의 졸참나무가 생육하지 않는 고산지대)의 신갈나무는 거의 함유하지 않는 것으로 확인되었다(Table 3). 동소적으로 분포하는 두 종의 개체들이 상대 종(신갈나무↔졸참나무)과 유사한 flavonoid compound 조성을 갖는 경향을 보이는 이러한 양상은 compounds 3, 4에서와 비슷하다(Table 3).
- 지리산 졸참나무 개체들은 compound 14를 함유함에 있어서 고도별 변이를 나타내며 신갈나무와 동소적으로 분포하는 고지대 졸참나무의 일부 개체들(‘코재 12, 14, 15, 17졸참’)은 신갈나무처럼 소량 함유하는 것으로 확인되었다(Table 3).
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