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문제 정의
- 아스타잔틴은 비타민 E와 β-카로틴보다 강한 자유 라디칼 소거활성을 가지고 있으며 [16, 17] 과산화상태에서 막의 인지질을 포함한 다른 지질들을 보호하는 기능을 가진 우수한 물질로 알려져 있으며 [18,19] LPS로 유도된 대식세포에서 NF-κB 활성을 저해하여 iNOS의 발현 및 NO, IL-6, TNF-α의 생성이 억제하는 것이 보고되었다 [20]. 따라서 본 연구에서는 홍게 껍질의 색소 추출물 및 그 용매 분획물을 제조하여 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl), peroxynitrite 소거능, DNA 산화능, 세포내 ROS 소거능, NO (nitric oxide) 생성 억제능, GSH (glutathione) 유도 효과를 측정하여 홍게 껍질 색소가 기능성 식품소재로서의 활용 가능성을 검토하고자 하였다.
- 본 연구는 홍게껍질 색소 성분의 항산화 활성 효과를 확인함으로써 우리나라 갑각류 껍질에 포함되어 있는 색소 성분의 중요성을 밝히고자 하였다. 실험 결과, 홍게껍질 색소 추출물의 peroxynitrite와 세포내 ROS 소거능 및 NO 생성 억제 효과와 genomic DNA 산화 방지능은 확인하였으나 DPPH 라디칼 소거효과는 크지 않았고, GSH 유도효과는 유의적으로 나타나지 않았다.
제안 방법
- 0.5~1.0 µg의 genomic DNA에 4 µL의 H2O와 600 M의 FeSO4, 0.5 mM의 H2O2를 각각 10 µL씩 가하여 genomic DNA 를 30분간 상온에서 산화시킨 뒤 130 mM의 EDTA를 가하여 반응을 중지시켰다.
- DHR 123 완충용액에 시료와 peroxynitrite를 첨가하고 실온에서 5분간 방치 후, Victor3 multilabel plate reader (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 λexcitation 485 nm, λemission 530 nm에서 측정하였다. Authentic peroxynitrite 대신에 SIN-1을 첨가하는 경우는 동일한 방법으로 실시하여 1시간동안 방치한 후 측정하였다. 이는 SIN-1이 NO와 O2-를 동시에 발생시켜 ONOO-를 생성시키는 화합물이기 때문에, DHR 123를 급속하게 산화시키는 authentic peroxynitrite와 다르게 DHR 123를 점진적으로 산화가 일어나게 하기 때문이다.
- Fig. 1은 시료의 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거능을 보여 주며 각 시료의 농도는 50, 100, 200 µg/mL에서 라디칼 소거능을 측정하였다.
- HT 1080 세포로부터 genomic DNA를 추출하여 각 시료로 처리한 후, H2O2와 FeSO4로 산화시켜 시료가 DNA 산화를 방지하는 정도를 측정하였다. Fig.
- LPS를 처리하여 NO 유도 후 생성되는 NO2-가 Griess 시약과 반응하여 색소 화합물을 생성하는 원리를 이용하였다. 시료 처리 후 LPS를 48시간 동안 처리하여 NO의 생성을 유도하였으며 시료를 처리하지 않고 LPS만 처리한 control과 LPS로 처리하지 않은 blank를 대조군으로 하여 백분율(%)로 비교하여 나타내었다.
- LPS에 의해 자극받은 Raw 264.7세포로부터 생성된 NO가 함유된 배지 50 µL와 Griess 시약 (0.1% N-1-naphtylenediamine : 1% sulfanilamide = 1:1) 50 µL를 반응시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하였다 [25].
- MeOH, n-BuOH 그리고 H2O 분획층을 얻었으며, 이들에 대한 ONOO- 소거 효과를 측정하였다.
- 소거 활성은 Kooy등의 방법에 따라 dihydrorodamine 123 (DHR 123)의 산화되는 정도를 측정함으로써 검색하였다 [22]. ONOO-는 DHR13과 반응하여 형광성 물질인 rhodamine 123으로 바뀌게 되므로, rodamine 123에 ONOO-와 SIN1을 처리하고 그 반응 생성물의 흡광도를 측정하여 시료의 peroxynitrite 소거능을 검토하였으며 대조군으로는 L-ascorbic acid와 penicillamine을 사용하였다.
- 각 추출물과 분획물, 대조군의 농도는 200, 100, 50, 10 µg/mL로 희석하여사용하였으며 ONOO- 소거 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 백분율 (%)로 나타내었다.
- 각 추출물과 용매 분획물은 200, 100, 50, 10 µg/mL의 농도로 희석하여 실험에 사용하였으며, 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 500 M의 H2O2로 처리한 control과 시료와 H2O2로 모두 처리하지 않은 blank를 실험에 사용하였고, DCF fluorescence 값은 0분부터 120분까지 30분 간격으로 측정하였다.
- 각각의 well에 농도별로 준비한 시료를 처리하여 37oC, 5% CO2 배양기에서 1시간 배양한 후, DCFH-DA를 제거하고 PBS로 씻은 후 2시간 동안 500 µM의 H2O2를 처리하였다.
- 76 g) 추출물을 얻었다. 각각의 추출물을 합한 후에 용매 분획을 실시하였다. 먼저 동량의 methylene chloride와 water의 혼합액을 만들어 층을 분리한 후, 분리된 methylene chloride 층을 2차 분획하여 n-hexane (1.
- 4는 200 µg/mL의 시료농도에서 대조군과 비교한 genomic DNA의 산화정도를 나타낸 것이다. 대조군으로는 시료로 처리하지 않고 산화시킨 control 과 시료, H2O2, FeSO4 모두 처리하지 않은 blank를 사용하였다. 실험 결과 조추출물에서는 acetone추출물과 MeOH추출물이 서로 비슷한 정도로 산화를 어느 정도 억제 시켰고, 분획물 중에서는 85% aq.
- 분석조건은 다음과 같다: column, Shiseido capcell Pack C18 (5 µm, 4.6×250 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA); detection wavelength, 450 nm; flow rate, 0.6 mL/min; 이동상은 MeOH: ACN: dichrolomethane을 44:44:12의 비로 11분 → 42:23:35의 비로 21분 → 44:44:12의 비로 분석하였다.
- 세포내 축적된 GSH함량은 thiol staining reagent인 mBBr (monobromobiman)을 이용하여 측정하였다. 비형광물질인 mBBr은 세포내 산화생성물을 제거하는 역할을 하는 GSH와 결합하여 형광을 나타내기 때문에, 이를 측정하여 GSH의 함량을 계산하였다.
- 성분분석은 Dionex P580 pump (Dionex. corporation, Sunnyvale, CA, USA)와 Varian 350 refractive index detector (Varian Analytical Instruments, Walnut Creek, CA, USA)로 구성된 high performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 수행하였다. 사용된 모든 유기용매는 사용하기전 정제하여 실험에 사용하였으며, L-ascorbic acid, 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), DL-2-amino-3-mercapto-3-methylbutanoic acid (DL-penicillamine), dihydrorhodamine 123 (DHR 123), 3-morpholinosydnonimine (SIN-1)과 2',7'-dichloro- dihydrofluorescein diacetate (DCF-DA)는 Sigma-Aldrich Co.
- 세포 내 자유라디칼 생성 정도는 Victor3 multilabel plate reader를 이용하여 λexcitation 485 nm, λemission 528 nm에서 DCF (2',7'-dichlorodihydrofluorescein) 형광강도를 측정하였다 [24].
- 세포내 축적된 GSH함량은 thiol staining reagent인 mBBr (monobromobiman)을 이용하여 측정하였다. 비형광물질인 mBBr은 세포내 산화생성물을 제거하는 역할을 하는 GSH와 결합하여 형광을 나타내기 때문에, 이를 측정하여 GSH의 함량을 계산하였다.
- 세포내 활성산소종 소거효과는 섬유육종 세포인 HT 1080을 사용하였으며, 형광물질인 DCF-DA가 세포내 생성된 자유 라디칼과 반응하여 형광물질인 DCF로 산화되는 원리를 이용하여 측정하였다. 각 추출물과 용매 분획물은 200, 100, 50, 10 µg/mL의 농도로 희석하여 실험에 사용하였으며, 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 500 M의 H2O2로 처리한 control과 시료와 H2O2로 모두 처리하지 않은 blank를 실험에 사용하였고, DCF fluorescence 값은 0분부터 120분까지 30분 간격으로 측정하였다.
- 가 Griess 시약과 반응하여 색소 화합물을 생성하는 원리를 이용하였다. 시료 처리 후 LPS를 48시간 동안 처리하여 NO의 생성을 유도하였으며 시료를 처리하지 않고 LPS만 처리한 control과 LPS로 처리하지 않은 blank를 대조군으로 하여 백분율(%)로 비교하여 나타내었다.
- 그리고 시료 50 µL와 제조한 DPPH용액을 혼합하여 10분간 상온에서 반응시킨 후 518 nm에서 흡광도를 측정한다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 유리 라디칼 소거 활성을 백분율로 나타내었으며, 대조군의 UV-Vis 흡광도는 0.94 ~0.97이 되도록 조정하였다. 그리고 3회 반복하여 실험하여 얻은 결과를 평균한 값으로 나타내었다.
- 홍게 껍질 (1 kg)을 분쇄기로 분쇄 후 1차는 아세톤 (acetone) 용매로 2차는 메탄올 (MeOH) 용매로 침지 후 여과하는 방식을 사용하여 4일에 걸쳐 각각 2회씩 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출물을 감압회전증발기 (rotavapor)를 이용하여 용매 제거를 한 후, 아세톤 (4.84 g) 추출물과 메탄올 (14.76 g) 추출물을 얻었다. 각각의 추출물을 합한 후에 용매 분획을 실시하였다.
- 전기영동을 마친 gel은 5 µg/mL EtBr에 20~30분간 염색시켜 UV를 통해 산화된 정도를 확인하여 사용된 시약의 농도와 양을 조절하여 실험하였다 [23].
- 본 실험에서는 2011년 동해안 폐기물로 나온 홍게 껍질을 건조하여 분쇄한 후 색소 추출물 및 분획물을 농도를 달리하여 제조하였다. 홍게 껍질 (1 kg)을 분쇄기로 분쇄 후 1차는 아세톤 (acetone) 용매로 2차는 메탄올 (MeOH) 용매로 침지 후 여과하는 방식을 사용하여 4일에 걸쳐 각각 2회씩 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출물을 감압회전증발기 (rotavapor)를 이용하여 용매 제거를 한 후, 아세톤 (4.
- 홍게 껍질 추출물의 항염증 효과를 알아보기 위해 염증 유발인자인 NO생성 억제율을 확인하였다. Fig.
대상 데이터
- Louis, USA)에서 구입하였다. 그리고 peroxinitrite (ONOO-)와 astaxanthin 표준시약은 각각 Santa-cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, USA)와 Cayman (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에서는 2011년 동해안 폐기물로 나온 홍게 껍질을 건조하여 분쇄한 후 색소 추출물 및 분획물을 농도를 달리하여 제조하였다. 홍게 껍질 (1 kg)을 분쇄기로 분쇄 후 1차는 아세톤 (acetone) 용매로 2차는 메탄올 (MeOH) 용매로 침지 후 여과하는 방식을 사용하여 4일에 걸쳐 각각 2회씩 추출하였다.
- 사용된 모든 유기용매는 사용하기전 정제하여 실험에 사용하였으며, L-ascorbic acid, 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), DL-2-amino-3-mercapto-3-methylbutanoic acid (DL-penicillamine), dihydrorhodamine 123 (DHR 123), 3-morpholinosydnonimine (SIN-1)과 2',7'-dichloro- dihydrofluorescein diacetate (DCF-DA)는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 genomic DNA는 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit (Bioneer Inc., Alameda, CA, USA)를 이용하여 HT 1080 세포로부터 추출하였다. 추출한 genomic DNA는 260 nm와 280 nm의 파장에서 그 흡광도를 측정하여 순도와 농도를 정량한 후, -20oC에서 냉동보관하여 사용하였다.
- 인간섬유육종 세포주인 HT 1080 세포와 쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포는 한국세포주 은행 (KCLB, Korean cell line Bank)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin과 10% FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 37oC, 5% CO2 배양기 (Forma scientific, Japan)에서 배양하였다.
데이터처리
- 이는 SIN-1이 NO와 O2-를 동시에 발생시켜 ONOO-를 생성시키는 화합물이기 때문에, DHR 123를 급속하게 산화시키는 authentic peroxynitrite와 다르게 DHR 123를 점진적으로 산화가 일어나게 하기 때문이다. Blank는 0.3 N NaOH를 사용하였고, 실험은 삼중으로 행하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율로 계산하였다.
- 97이 되도록 조정하였다. 그리고 3회 반복하여 실험하여 얻은 결과를 평균한 값으로 나타내었다. 시료는 100% 에탄올에 용해시켜 사용하였다 [21].
- 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석 (ANOVA)을 행한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균 (mean) ± 표준오차 (standard error of mean, SEM)로 표시하였다.
- 05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균 (mean) ± 표준오차 (standard error of mean, SEM)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 statistic analysis system v9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 처리하였다.
이론/모형
- ONOO- 소거 활성은 Kooy등의 방법에 따라 dihydrorodamine 123 (DHR 123)의 산화되는 정도를 측정함으로써 검색하였다 [22]. ONOO-는 DHR13과 반응하여 형광성 물질인 rhodamine 123으로 바뀌게 되므로, rodamine 123에 ONOO-와 SIN1을 처리하고 그 반응 생성물의 흡광도를 측정하여 시료의 peroxynitrite 소거능을 검토하였으며 대조군으로는 L-ascorbic acid와 penicillamine을 사용하였다.
- 세포 내 자유라디칼 생성 정도는 DCF-DA assay로 측정하였다. 섬유 육종 세포 HT 1080은 96 well plate에 5×103 cells/ well로 분주하여 24시간 동안 37oC, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, Hank's balanced salt solution (HBSS)으로 희석한 20µM의 2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate (DCF-DA, fluorescence probe)를 첨가하여 20분간 배양하였다.
성능/효과
- 100 µg/mL의 농도에서 60분을 기준으로 홍게 껍질 추출물의 ROS 소거능은 MeOH 추출물 (51%)이 acetone 추출물 (37%)보다 좋았으며 농도감소에 따른 소거능 감소의 정도도 MeOH 추출물이 acetone 추출물의 소거능 감소보다 더 작았다.
- Authentic ONOO-에 대한 소거효과도 acetone 추출물보다 MeOH 추출물이 더 좋은 소거효과를 나타내었으며 200 µg/ mL의 농도에서 약 60%의 소거율을 보여 주었다.
- HPLC로 분석한 결과 홍게 껍질의 총 carotenoid 함량은 홍게껍질 100 g 당 157.5 µg 함유하고 있는 것으로 확인되어 홍게 껍질의 총 carotenoid 함량비는 약 0.16%인 것으로 계산되었다.
- MeOH 분획물이 가장 좋은 소거효과를 나타내어 200 µg/mL의 농도에서 authentic peroxynitrite와 SIN-1에서 유도된 peroxynitrite에 대해서 각각 약 80%와 65%의 소거활성을 보여주었다 (Fig. 2, 3).
- 특히, 85% aq.MeOH 용매 분획물이 높은 peroxynitrite 및 세포내 ROS 소거율, 그리고 genomic DNA 산화 억제능을 보여 주어 새로운 항산화 제로서의 이용 가능성을 보여 주었다. 지금까지 아스타잔틴은 양식산업에서 연어류의 착색제로 이용되어 왔으며 최근에는 항산화, 항암 등의 생리활성이 발견되어 기능성 물질로도 연구가 진행되고 있다 [34].
- 50 µg/mL의 농도에서 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, water 분획은 각각 16.8, 17.8, 16.9, 9.6%의 낮은 소거능을 보였으며 농도를 증가시켜도 대조군 BHA에 비해서 라디칼 소거능은 크게 증가하지 않았다. 문헌에 의하면 아스타쟌틴의 DPPH 라디칼 소거능은 25 µg/mL의 농도에서 15%의 낮은 소거능을 보인 것으로 보고되었다 [28].
- 실험 결과 조추출물에서는 acetone추출물과 MeOH추출물이 서로 비슷한 정도로 산화를 어느 정도 억제 시켰고, 분획물 중에서는 85% aq.MeOH과 n-BuOH 분획이 가장 좋은 산화 억제력을 보였다.
- SIN-1을 처리하였을 때, 조추출물에서는 MeOH 추출물이 acetone 추출물보다 뛰어난 소거 활성을 보였으며, 200 µg/mL 농도에서 약 60%의 소거율을 보였다.
- 문헌에 의하면 아스타쟌틴의 DPPH 라디칼 소거능은 25 µg/mL의 농도에서 15%의 낮은 소거능을 보인 것으로 보고되었다 [28]. 따라서 아스타쟌틴이나 그 유도체들을 주성분으로 함유하는 색소추출물의 용매분획들이 낮은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 것은 문헌치와 잘 일치하는 것으로 판단된다.
- 6 mL/min; 이동상은 MeOH: ACN: dichrolomethane을 44:44:12의 비로 11분 → 42:23:35의 비로 21분 → 44:44:12의 비로 분석하였다. 시료를 분석한 결과 HPLC 크로마토그램에서 retention time 6.3 min, 7.1 min, 7.5 min에서 세 개의 피크들이 나타났다.
- 대조군으로는 시료로 처리하지 않고 산화시킨 control 과 시료, H2O2, FeSO4 모두 처리하지 않은 blank를 사용하였다. 실험 결과 조추출물에서는 acetone추출물과 MeOH추출물이 서로 비슷한 정도로 산화를 어느 정도 억제 시켰고, 분획물 중에서는 85% aq.MeOH과 n-BuOH 분획이 가장 좋은 산화 억제력을 보였다.
- 대부분은 세포질에 존재하면서 외부로부터의 산화 스트레스나 생체내 자유라디칼을 제거하는 역할을 한다 [32]. 실험 결과 추출물과 분획층은 모두 유의적인 GSH 유도 효과를 나타내지 않았다. 문헌에 보고된 바에 의하면 HepG2-C8 cell세포에서 아스타쟌틴의 농도가 3.
- 본 연구는 홍게껍질 색소 성분의 항산화 활성 효과를 확인함으로써 우리나라 갑각류 껍질에 포함되어 있는 색소 성분의 중요성을 밝히고자 하였다. 실험 결과, 홍게껍질 색소 추출물의 peroxynitrite와 세포내 ROS 소거능 및 NO 생성 억제 효과와 genomic DNA 산화 방지능은 확인하였으나 DPPH 라디칼 소거효과는 크지 않았고, GSH 유도효과는 유의적으로 나타나지 않았다. Peroxynitirite와 ROS 소거능은 85% aq.
- 추출물의 NO 생성 억제능은 200 µg/mL와 100 µg/mL의 농도에서 acetone 추출물이 약 40%의 억제능을 보였고, MeOH 추출물에서는 각 농도별로 크게 차이가 없는 25~35% 정도의 억제능을 보였다.
후속연구
- 지금까지 아스타잔틴은 양식산업에서 연어류의 착색제로 이용되어 왔으며 최근에는 항산화, 항암 등의 생리활성이 발견되어 기능성 물질로도 연구가 진행되고 있다 [34]. 본 연구결과는 그 동안 폐기물로 분류되어 버려지던 홍게껍질을 재활용하면 항산화제 혹은 항산화능을 가진 착색제 및 식품첨가제 등으로 개발될수 있는 가능성이 있음을 제시하여 준다. 추후의 지속적인 연구를 통하여 항산화 및 항염증 효과를 가진 새로운 건강기능성 물질을 분리하여 고부가가치화 할 수 있다면 폐기물의 재활용이란 친환경적인 측면에서도 의미가 있을 것이다.
- 본 연구결과는 그 동안 폐기물로 분류되어 버려지던 홍게껍질을 재활용하면 항산화제 혹은 항산화능을 가진 착색제 및 식품첨가제 등으로 개발될수 있는 가능성이 있음을 제시하여 준다. 추후의 지속적인 연구를 통하여 항산화 및 항염증 효과를 가진 새로운 건강기능성 물질을 분리하여 고부가가치화 할 수 있다면 폐기물의 재활용이란 친환경적인 측면에서도 의미가 있을 것이다.
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