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문제 정의
- 주요 성분으로는 baicalin, baicalein, wogonin등이 알려져 있으며 특히 baicalin의 높은 항균력이 LCMS를 이용한 분석한 결과 확인되었다 [4]. 따라서 본 연구는 황금 추출물의 항균효과가 CTFA기준을 만족시킬 수 있을 것으로 기대하였다.
- 본 연구는 화장품 제품 (스킨 로션)에 대한 황금추출물의 항균효과와 맥문동 추출물의 보습효과를 확인하였다. 황금의 메탄올 추출물은 농도 1.
- 본 연구는 황금추출물의 방부효과가 기존의 파라벤류 방부제를 대체할 수 있는지를 검증함과 동시에 화장품에 보습기능을 추가하고자 하였다. 문헌 검토를 통해 맥문동(麥麥麥)을 보습용 한약재로 선택하였다.
제안 방법
- 그 후 각 petri dish에 10~15 mL의 melted agar medium을 넣어 적당히 흔들어 섞어준다. Melted agar medium 이 완전히 굳은 후, 35℃의 incubator에서 48시간 동안 배양시킨 후 나타난 콜로니수를 측정하였다. 이와 같이 하여 7일째까지 초기에 접종된 균 수의 99.
- SOD유사활성 (Superoxide dismutase-like activity) 평가실험에는 pyrogallol (Sigma-Aldrich Co., USA)을 사용하였고, 흡광도 측정은 UV/vis spectrophotometer (UV mini-1240, SHIMADZU, Japan)를 이용하였다. 세포형태변화는 Field Emission-Scanning Electron Microscope (LEO SUPRA 55, Carl Zeiss, Germany)로 관찰하였고, 맥문동의 보습력실험에서 수분측정에는 Moisture checker (MY-808S, SCALAR Corporation, Japan)를 사용하였다.
- Sampling한 균주를 건조한 분말시료를 3분간 Pt-coating후 FE-SEM (LEO SUPRA 55, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 ×100,000배율로 촬영하였다.
- 실험에 사용된 맥문동 (Liriope platyphylla) 잎은 맥문동 재배농가 (밀양, Korea)로부터 구입하여 흙과 이물질을 제거한 후 물로 세척하고 동결건조기로 건조하여 사용하였다. 건조된 맥문동 잎 (20 g)을 막자사발로 분쇄하여 분말상태로 만든 후, 증류수 (200 mL)와 1:10의 비율로 넣고 80에서 3시간 동안 속시렛 추출기로 (SEW 600, Changshin Science, Korea) 추출하였다. 동결건조 후 얻어진 맥문동 추출물 (0.
- 건조된 황금추출물 (1g±0.2)을 멸균된 3차 증류수 5 mL에 녹인 후, 이 용액을 원액 (즉 100 wt%)으로 하여 3차 멸균증류수로 다시 희석하여 실험에 사용된 농도 (0.1, 1.0, 5.0 및 10 wt%)의 황금추출액을 제조하였다.
- M-3 Method에 기준한 자세한 실험 내용은 다음과 같다: 화장품 (본 실험에서는 로션을 사용)에 정해진 수의 균(bacteria 는 1×106 CFU/mL, yeast 는 1×105 CFU/mL)을 접종하였다. 그 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 28일째 되는 날에 로션 1 mL를 주사기로 취하여 conical tube 에 넣고 희석액 (TEA broth) 9 mL 를 마이크로 피펫으로 넣어 10배로 희석한 후, 한 petri dish에 1 mL 그리고 다른 petri dish에 0.1 mL를 넣는다. 그 후 각 petri dish에 10~15 mL의 melted agar medium을 넣어 적당히 흔들어 섞어준다.
- 동결건조 후 얻어진 맥문동 추출물 (0.8g±0.2)을 3차 멸균증류수 4 mL에 녹인 후, 이 용액을 원액 (즉 100 wt%)으로 하여 3차 멸균증류수로 희석하여 50 wt%와 80 wt%의 맥문동추출액을 각각 제조하였다.
- Placeb℃ream (대조군)은 위 크림에 맥문동 추출물을 첨가하지 않은 것이다. 맥문동 추출물을 함유한 크림을 팔 안쪽에 도포한 후 Moisture checker (Scalar, Japan)를 사용하여 30분 간격으로 총 6시간 동안 수분 보유량을 측정하였다. 측정을 실시하기 전에 피시험자에게 주의사항을 숙지하게 하였고, 피시험자들의 시험부위인 팔 안쪽을 세척하고 건조한 후 평가를 실시하였다.
- 맥문동 추출물의 보습력 측정은 50 wt% 및 80 wt%의 맥문동 추출물을 각각 다음과 같은 조성을 가진 크림에 첨가하여 항온항습 조건 (온도: 25±2℃, 상대습도: 43±2%)에서 시행하였다.
- , USA)을 사용하였고, 흡광도 측정은 UV/vis spectrophotometer (UV mini-1240, SHIMADZU, Japan)를 이용하였다. 세포형태변화는 Field Emission-Scanning Electron Microscope (LEO SUPRA 55, Carl Zeiss, Germany)로 관찰하였고, 맥문동의 보습력실험에서 수분측정에는 Moisture checker (MY-808S, SCALAR Corporation, Japan)를 사용하였다.
- 실험대상 미생물 (S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans 및 E. coli)을 황금추출물 (1.0 wt%)로 처리한 세포와 처리하지 않은 대조구 세포들의 형태를 비교하였다. 전계방출형 주사전자현미경 (FE-SEM)으로 비교 관찰한 결과 황금추출물로 처리된 균들의 세포막이 파괴된 것이 확인되었다 (Fig.
- 앞의 section에서 황금추출물과 혼합되어 challenge test에 사용된 맥문동의 보습력을 측정하였다. 환류추출장치를 이용하여 맥문동 잎 20 g으로부터 추출물 0.
- 두 경우에 사용한 실험 절차는 동일하다. 원통형 플라스틱 용기 (100 mL) 20개에 스킨로션을 각각 50 g씩 넣고 4가지 미생물 및 5가지 방부제 조건 (황금추출물 농도 4가지와 paraben이 사용된 control)에서 CTFA의 M-3방법에 의거해서 challenge test를 진행하였다. 미생물 중 bacteria (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa)는 1×106 CFU/mL를 접종하고 yeast인 Candida albicans는 1×105 CFU/mL를 접종하였다.
- 전자의 경우 실험절차는 clean bench (VS-1400, Vision Scientific Co., Ltd.) 안에서 100 mL의 원통형 플라스틱 용기에 스킨로션 50 g을 넣고 0.1, 1.0, 5.0 및 10 wt%의 황금추출물 500 µL를 각각 첨가하고 멸균된 spatula로 교반한 후, CTFA의 M-3 방법에 따라 15 mL conical tube에 10배로 희석하여 challenge test를 진행하였다.
- 접종된 미생물수가 CTFA법에서 규정한 방부력 테스트 기준 (즉, 7일 이내에 접종 미생물수의 99.9 %가 사멸해야 함)이하로 감소하기 위해 필요한 황금추출물의 농도를 결정하였다. 실험에 사용된 황금추출물 농도는 0.
- 맥문동 추출물을 함유한 크림을 팔 안쪽에 도포한 후 Moisture checker (Scalar, Japan)를 사용하여 30분 간격으로 총 6시간 동안 수분 보유량을 측정하였다. 측정을 실시하기 전에 피시험자에게 주의사항을 숙지하게 하였고, 피시험자들의 시험부위인 팔 안쪽을 세척하고 건조한 후 평가를 실시하였다.
- 맥문동 추출물의 보습력 측정은 50 wt% 및 80 wt%의 맥문동 추출물을 각각 다음과 같은 조성을 가진 크림에 첨가하여 항온항습 조건 (온도: 25±2℃, 상대습도: 43±2%)에서 시행하였다. 크림의 조성은 glycerine 7.0 mL, 1,3-BG 5.0 mL, xanthan gum 0.1 g, TEA 0.2 g, methyl paraben 0.1 g, ceto-stearyl alcohol 2.0 g, glyceryl-stearate/PEG-100 stearate 1.5 g, bees wax 1.0 g, glyceryl monostearate 1.0 g, squalane 8.0 g, caprylic capric triglyceride 5.0 g, paraffin wax 2.5 g, dimethicone 0.3 mL, 여기에 D.W.를 가해서 총 100 mL로 하였다. Placeb℃ream (대조군)은 위 크림에 맥문동 추출물을 첨가하지 않은 것이다.
- 피시험자들의 시험부위인 팔 안쪽을 세척하고 건조한 후 맥문동 추출물을 함유한 크림 0.2 g을 팔 안쪽 1 cm2 정도의 면적에 도포한 후 항온항습 조건(온도: 25±2℃, 상대습도: 43±2%)에서 Moisture checker (Scalar, Japan)를 사용하여 30분 간격으로 수분 보유량 (skin moisture capacity)을 측정하였고 실험은 총 6시간 동안 계속되었다.
- 앞의 section에서 황금추출물과 혼합되어 challenge test에 사용된 맥문동의 보습력을 측정하였다. 환류추출장치를 이용하여 맥문동 잎 20 g으로부터 추출물 0.8 g을 얻었고 이것을 멸균증류수 4 mL에 녹인 것을 맥문동 추출물 원액 (100 wt%)으로 하였다. 보습력 측정에 사용된 조건은 네 가지로서 50 wt% 및 80 wt%의 맥문동 추출물 0.
- 황금(黃黃)추출물의 항균력이 추출물의 농도가 높아짐에 따라 커지는 것을 확인하기 위해서 0.0, 0.1, 1.0, 10 wt% 농도의 황금추출액에 대하여 35℃에서 24시간 배양시킨 다음 clear zone의 직경을 측정하였다 (Fig. 1). 황금추출물 0.
- 본 연구는 화장품 제품 (스킨 로션)에 대한 황금추출물의 항균효과와 맥문동 추출물의 보습효과를 확인하였다. 황금의 메탄올 추출물은 농도 1.0 wt%에서 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, 그리고 Candida albicans 의 네 균주 모두에 대하여 CTFA (The Cosmetics, Toiletry, and Fragrance Association)가 규정하는 방부능력 기준을 충족시켰다. 황금ㄹ추출물은 또한 낮은 농도 (0.
- 황금추출물 처리 후 세포형태의 변화를 관찰하기 위해서 S. aureus, P. aeruginosa와 E. coli가 각각 접종된 50 mL Nutrient broth와 C. albicans이 접종된 50 mL TrypticaseTM Soy agar 배지를 250 mL플라스크에 각각 담아 12시간 배양 후 O.D.가 1.0일 때 황금추출물 (1.0 wt %) 500 µL를 넣고 24시간 동안 shaking incubator (200 rpm, 35℃)에서 배양 후 전계방출형 주사전자현미경 (Field Emission-Scanning Electron Microscope)으로 관찰하였다.
- 후자 즉 황금추출물과 맥문동 추출물의 혼합물을 사용한 경우에는 황금추출물 500 µL와 80 wt%의 맥문동추출물 125 µL를 함께 첨가하였으며 그 외의 실험절차는 황금추출물만 첨가한 경우와 동일하였다.
대상 데이터
- 이 테스트를 challenge test 로 명명한다. 균주는 gram-positive 균인 Staphylococcus aureus, fermentative gram-negative 균인 Escherichia coli, non-fermentative Gram-negative 균인 Pseudomonas aeruginosa 그리고 yeast 인 Candida albicans를 사용하였다. M-3 Method에 기준한 자세한 실험 내용은 다음과 같다: 화장품 (본 실험에서는 로션을 사용)에 정해진 수의 균(bacteria 는 1×106 CFU/mL, yeast 는 1×105 CFU/mL)을 접종하였다.
- 황금을 화장품 방부제로 사용할 경우 고려할 사항으로 보습기능이 저하될 수 있다는 한의학적 관점이 있다. 따라서 황금의 항균능력을 방해하지 않으면서 보습효능을 가지는 제2의 한약재로서 한의학 문헌검토 결과 맥문동을 선택하였다. 맥문동은 백합과에 속하는 다년생 상록 초본으로 폴리페놀 화합물과 플라보노이드를 함유하고 있으며 동양의약의 처방에 따르면 맥문동탕이 마른기침, 목이 쉬었을 때, 피부건조 등에 처방되는 것으로 알려져 있다 [5].
- 맥문동은 폴리페놀 화합물과 플라보노이드를 함유하고 있고 마른 기침, 쉰 목, 피부건조 등에 처방되고 있다 [5]. 맥문동 잎이 뿌리에 비해 폴리페놀 화합물과 프라보노이드 화합물을 더 많이 함유한 것으로 알려져 있기 때문에 [5] 본 연구에서는 잎 부위를 사용하였다. 본 연구를 통해 맥문동의 보습효과를 확인하였으며 또한 맥문동 추출물의 추가로 인해 황금의 항균작용이 저해되지 않음을 확인하였다.
- 맥문동은 백합과에 속하는 다년생 상록 초본으로 폴리페놀 화합물과 플라보노이드를 함유하고 있으며 동양의약의 처방에 따르면 맥문동탕이 마른기침, 목이 쉬었을 때, 피부건조 등에 처방되는 것으로 알려져 있다 [5]. 맥문동은 일반적으로 뿌리를 사용하는 경우가 많은데 본 실험에서는 뿌리에 비해 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 화합물함량이 더 높은 것으로 알려져 있는 잎을 구하여 실험하였다 (밀양, Korea).
- 본 연구는 황금추출물의 방부효과가 기존의 파라벤류 방부제를 대체할 수 있는지를 검증함과 동시에 화장품에 보습기능을 추가하고자 하였다. 문헌 검토를 통해 맥문동(麥麥麥)을 보습용 한약재로 선택하였다. 맥문동은 폴리페놀 화합물과 플라보노이드를 함유하고 있고 마른 기침, 쉰 목, 피부건조 등에 처방되고 있다 [5].
- 2)을 3차 멸균증류수 4 mL에 녹인 후, 이 용액을 원액 (즉 100 wt%)으로 하여 3차 멸균증류수로 희석하여 50 wt%와 80 wt%의 맥문동추출액을 각각 제조하였다. 보습력 측정실험에서는 50 wt%와 80 wt% 추출물을 사용하고 challenge test에는 80 wt%의 맥문동 추출물을 사용하였다.
- 실험에 사용된 맥문동 (Liriope platyphylla) 잎은 맥문동 재배농가 (밀양, Korea)로부터 구입하여 흙과 이물질을 제거한 후 물로 세척하고 동결건조기로 건조하여 사용하였다. 건조된 맥문동 잎 (20 g)을 막자사발로 분쇄하여 분말상태로 만든 후, 증류수 (200 mL)와 1:10의 비율로 넣고 80에서 3시간 동안 속시렛 추출기로 (SEW 600, Changshin Science, Korea) 추출하였다.
- 황금 10 g (대아약업사, Daegu, Korea)을 80% 메탄올 (50 mL)과 1:5비율로 혼합하여 70℃에서 24시간 동안 속시렛 추출기로 (Soxhelet Device SEW 600, Changshin Science, Korea) 추출하여, 그 추출물을 동결건조하여 보관 및 사용하였다. 건조된 황금추출물 (1g±0.
- 황금추출액의 항균력 실험에 그람양성균인 Staphylococcus aureus (ATCC 6538), 그람음성균인 Escherichia coli (ATCC 8739)와 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), 그리고 yeast인 Candida albicans (ATCC 10231)를 다림제약 (Dalim biotech Co., Hwaseong, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 계대배양을 위한 액체배지로 S.
이론/모형
- SOD 유사활성은 Marklund 방법에 따라 측정하였다 [7]. 각 시료용액 0.
- 본 연구는 미국화장품협회의 CTFA (The Cosmetics, Toiletry, and Fragrance Association)규정 중 M-3 방법 (The Method for Preservation Testing of Water-Miscible Personal Care Products)을 기준으로 테스트하였다 [6]. 이 테스트를 challenge test 로 명명한다.
- 천연항균물질에 대한 연구의 예로 알칼로이드, 후라보노이드, 피토알렉신, 항균펩티드의 항균작용이 보고되었다 [3]. 본 연구에서는 한약재 중에서 꿀풀과의 다년생 초본식물인 황금 (黃黃)의 메탄올 추출물에 대하여 방부력 테스트를 진행하였는데 미국화장품협회 (The Cosmetics, Toiletry, and Fragrance Association, CTFA)의 방법을 기준으로 하였다. 황금 (Scutellaria baicalensis George)의 뿌리는 노란색을 띠며 동양의학 문헌에 각종 염증에 대한 효과가 알려져 왔다.
- 황금추출물의 항균력을 disk method를 이용하여 확인하였다. Petri dish 뚜껑을 열고 지름 8 mm의 멸균된 고무 원통을 올려 놓아 황금추출액이 떨어질 자리를 차지하게 한 후 S.
성능/효과
- 10 wt%의 황금추출물의 경우 control과 비슷한 속도로 2일째에 99.9%의 감소율에 도달하였다 (Fig.
- 0 및 10 wt%) CTFA 방부기준을 충족하였다. 10 wt%의 황금추출물일 때 4일째에 기준에 도달하였고 0.1 wt%의 황금추출물도 7일째에 기준에 도달하였다 (Fig. 2(C)).
- 3%에 도달하였다. 180분 이후 수분 함량이 점차 감소하였으나 6시간이 지났을 때에도 32.6%와 39.1%의 수분함량이 유지되었다. 이 실험결과는 맥문동잎 추출물은 피부의 수분함량을 높여줄 뿐만 아니라 수분함량이 비교적 오랫동안 지속되는 데 도움이 되는 것을 보여주었다.
- 6). 50 wt%와 80 wt%의 맥문동 잎 추출물을 함유한 크림을 도포하였을 때 실험시작 후 180분까지 수분 함량이 꾸준히 증가하여 최고값인 39.1%와 45.3%에 도달하였다. 180분 이후 수분 함량이 점차 감소하였으나 6시간이 지났을 때에도 32.
- C. albicans 사멸에 대하여도 사용된 황금추출물 농도 모두 (0.1, 1.0, 5.0 및 10 wt%) CTFA 방부기준을 충족하였다. 10 wt%의 황금추출물일 때 4일째에 기준에 도달하였고 0.
- 0, 10 wt%의 황금추출물은 4일째에 기준점에 도달하여 control보다 빠른 감소율을 보였다. Control, 0.1, 1.0, 5.0, 10 wt% 황금추출물 모두 28일째까지 균 수가 증가하지 않았으므로 CTFA의 기준에 충족하는 것을 확인하였다(Fig. 2(D)).
- 1 wt%)에서도 맥문동의 항균효과 감소가 전혀 관찰되지 않았다. E. coli도 전체실험 농도범위 (0.1~10 wt%)에서 90~95%의 높은 항균효과를 유지하였다. 다만 C.
- P. aeruginosa 사멸에 대해서는 실험에 사용된 모든 황금추출물 농도인 0.1, 1.0, 5.0 및 10 wt%에서 CTFA 방부기준이 충족되었다. 10 wt%의 황금추출물의 경우 control과 비슷한 속도로 2일째에 99.
- S. aureus의 경우 control은 5일째, 10 wt%는 2일째, 5 wt%는 4일째, 1 wt%는 6일째에 CTFA의 기준인 99.9 % 사멸기준에 도달하였다. 0.
- 0 wt% 또는 그 이상이어야 4가지 미생물에 대하여 CTFA의 기준이 모두 충족되었기 때문이다. 결과적으로 황금의 항균효능에 대한 맥문동 추출물의 영향은 무시할 수준이라고 결론 지을 수 있다.
- 0 wt%이었다. 균주별로 구별하여 보면 세 균주 (E. coli, P. aeruginosa, C. albicans)의 경우에는 실험에 사용된 모든 황금추출물 농도 (0.1~10 wt%)에서 CTFA 방부기준이 충족되었으나 S. aureus는 황금 추출물 농도가 0.1 wt%로 낮았을 때 기준에 충족되지 않았다. 이것은 S.
- Table 1에서 100%라는 데이터는 해당 실험조건에서 맥문동 추가로 인한 항균효과 저하가 전혀 없음을 나타내며 %수치가 낮을수록 맥문동에 의한 항균감소효과가 높음을 나타낸다. 데이터를 보면 실험대상 4 균주에 모두에 대하여 황금의 농도가 높을수록 맥문동에 의한 항균감소효과가 미미해져서 5.0 wt%와 10 wt%의 황금추출물 농도실험의 경우 모든 데이터가 90~100%임을 알 수 있다. 특히 P.
- 즉 맥문동 추출물의 첨가로 인해서 황금의 항균효과가 저해되지 않았다. 또한 맥문동에 의한 보습효능은 피부도포 후 6시간까지 적정 수준으로 유지되었다. 따라서 기존의 파라벤류의 화장품 방부제를 대체하여 황금 추출물을 사용할 때 맥문동 추출물을 동시에 첨가해 주는 것이 황금 추출물의 방부제 효능을 유지하면서 동시에 피부의 보습효과를 주는 좋은 전략으로 사료된다.
- 모든 균주에 대한 결과를 종합하여 볼 때 4가지 미생물에 대하여 CTFA의 기준을 모두 충족시키는 황금추출물의 농도는 1.0 wt%이었다. 균주별로 구별하여 보면 세 균주 (E.
- 0 및 10 wt%이었으며 35℃의 incubator에서 배양하였다. 배양을 시작한 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 28일째 되는 날에 각각 취한 1 mL씩의 샘플에 포함된 살아있는 미생물 수를 측정하여 CTFA의 방부기준 (7일째까지 초기 접종 균 수의 99.9%가 사멸해야 하며 그 후 28일째까지 그 수가 증가하지 않아야 한다)을 만족시키는 황금추출물의 농도를 확인하였다.
- 본 연구를 통해 맥문동의 보습효과를 확인하였으며 또한 맥문동 추출물의 추가로 인해 황금의 항균작용이 저해되지 않음을 확인하였다.
- 실험 전체 시간대에 걸쳐 맥문동 잎 추출물의 농도가 0% (placebo)에서 50 wt% 및 80 wt%로 높은 경우에 대하여 측정된 수분함량 (skin moisture capacity)이 높았다 (Fig. 6). 50 wt%와 80 wt%의 맥문동 잎 추출물을 함유한 크림을 도포하였을 때 실험시작 후 180분까지 수분 함량이 꾸준히 증가하여 최고값인 39.
- 4). 이 결과는 황금추출물의 방부효과가 미생물의 세포막 손상 메커니즘임을 보여준다.
- 0 wt%)로 처리한 세포와 처리하지 않은 대조구 세포들의 형태를 비교하였다. 전계방출형 주사전자현미경 (FE-SEM)으로 비교 관찰한 결과 황금추출물로 처리된 균들의 세포막이 파괴된 것이 확인되었다 (Fig. 4). 이 결과는 황금추출물의 방부효과가 미생물의 세포막 손상 메커니즘임을 보여준다.
- 01 wt%)에서도 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었다. 황금추출물과 함께 맥문동 추출물을 첨가하였을 때에도 네 균주 모두에 대하여 CTFA의 기준이 충족되는 황금추출물의 농도는 1.0 wt%이었다. 즉 맥문동 추출물의 첨가로 인해서 황금의 항균효과가 저해되지 않았다.
- 황금추출물의 항산화 능력을 검증하기 위하여 황금추출물 농도 0.01, 0.1, 1.0, 5.0 wt%에 대하여 SOD 유사활성을 측정한 결과 가장 낮은 농도인 0.01 wt%에서도 70%의 활성을 나타내었으며, 농도가 증가할수록 효과가 증가하여 5.0 wt% 황금추출물의 경우 84%의 높은 활성을 나타내었다 (Fig. 5). 이러한 황금 추출물의 SOD 유사활성 능력은 비교대상인 다른 과실, 채소 농축액의 능력보다 매우 높았다.
- aureus 수가 지속적으로 감소하였으나 기준에 충족되지는 않았다. 황금추출물이 5.0 wt% 이상 사용되었을 경우 paraben이 사용된 control보다 더 빠른 속도로 CTFA 기준을 충족하였다 (Fig. 2(A))
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