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문제 정의
- 본 연구는 2012년에서 2013년에 걸쳐 국내 통영, 거제 인근의 양식중인 참굴의 유생 및 성패의 굴 허피스바이러스(ostreid herpesvirus)의 감염 여부를 PCR법으로 모니터링하여 그 결과를 분석한 것이다. 그 결과 유생, 사육수 그리고 참굴 성패에서도 바이러스를 확인하고 유전자 분석결과, OsHV-1 μVar형임을 밝혔다.
제안 방법
- 참굴의 유생과 성패의 DNA는 High Pure PCR Tempate Preparation Kit (Roche, Germany)와 그 매뉴얼에 따라 추출하였다.
- 사육수에서 DNA 추출은 Trizol (Ambion, USA)의 DNA 추출 매뉴얼에 따라 추출하였다. 0.
- 증폭이 확인된 PCR산물을 1% agarose gel에 전기영동으로 확인 후 High Pure PCR Product Preparation Kit (Roche, Germany)로 정제하였다. 정제된 DNA는 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 ligation 후 DH5ɑ competent cell (Solgent, Korea)에 transformation 하였다.
- 37℃ 항온배양기에 12시간 동안 균을 배양한 뒤 Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 Plasmid DNA를 추출하였으며, 전문 업체 Solgent사에 sequencing을 의뢰하여 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열은 BioEdit 소프트웨어 (Ver.7.2.0.)를 이용하여 유전적 유연관계를 확인하였다.
- , 2007)를 이용하여 염기서열 차이를 계통도로 나타내었다. 계통도 분석은 기존에 보고되어 GenBank에 등재된 허피스바이러스와 염기서열을 비교분석 하였다.
- 본 연구에서 분리된 총 10개의 바이러스와 GenBank에 등재된 ostreid herpesvirus의 유전자와 비교하여 계통수를 분석하였다[Fig. 3]. 이전 보고서들과 동일한 계통도 상으로 1990년대에서 2000년대 초 프랑스에서 발견된 허피스바이러스와 2008년 micro version을 포함하는 2개의 type으로 구분되었다(Renault, T et al.
- 2-step PCR은 1-step PCR산물 1㎕를 template DNA로 이용하였다. 각 PCR 증폭 산물은 0.5㎍/㎕ EtBr (Etihidium Bromide)이 첨가된 1% agarose gel을 사용하여 전기영동을 실시하였으며, band를 확인하여 증폭여부를 판단하였다.
- 증폭이 확인된 PCR산물을 1% agarose gel에 전기영동으로 확인 후 High Pure PCR Product Preparation Kit (Roche, Germany)로 정제하였다. 정제된 DNA는 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 ligation 후 DH5ɑ competent cell (Solgent, Korea)에 transformation 하였다. 37℃ 항온배양기에 12시간 동안 균을 배양한 뒤 Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 Plasmid DNA를 추출하였으며, 전문 업체 Solgent사에 sequencing을 의뢰하여 염기서열 분석을 실시하였다.
- 정제된 DNA는 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 ligation 후 DH5ɑ competent cell (Solgent, Korea)에 transformation 하였다. 37℃ 항온배양기에 12시간 동안 균을 배양한 뒤 Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 Plasmid DNA를 추출하였으며, 전문 업체 Solgent사에 sequencing을 의뢰하여 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열은 BioEdit 소프트웨어 (Ver.
대상 데이터
- 참굴의 성패는 2013년 8월~11월, 매달 1회 자란만 사량도 해역 2곳(st. 9, 10)에서 6개월에서 1년생 굴 성패 시료를 채취하였다. 다만 station 9의 9월 시료는 적조로 인해 sampling을 할 수 없었다.
- 다만 station 9의 9월 시료는 적조로 인해 sampling을 할 수 없었다. 성패의 시료는 패각 제거 후 췌장과 아가미를 포함한 조직을 이용하였다.
- 굴 허피스바이러스를 검출하기 위하여 C1, C6의 primer set (Batista, FM et al. 2007)와 C2, C6의 primer set (Renault, T & Arzul, I 2001)를 선정하였으며, PCR조건은 [Table 1]에 나타내었다.
- 참굴 유생과 사육수는 2012년 3월, 4월, 6월과 2013년 1월, 통영의 인공배양장인 station 1에서 매달 채취하였고, 2012년 5월과 2013년 4월에는 통영 및 거제 인근의 인공배양장 8곳(st. 1~8)에서 채취[Fig. 1]하여 4℃로 운반하고, 유생은 20㎛ mesh filter에 여과해서 깨끗한 해수로 3번 세척 후 원심분리를 해서 상층액은 버리고 유생만 모아 -70℃에 보관하였다.
데이터처리
- 검출된 시료와 NCBI에 등록된 alignment된 염기서열을 Clustalx 1.83 소프트웨어와 Mega4 소프트웨어(Tamura, K et al., 2007)를 이용하여 염기서열 차이를 계통도로 나타내었다. 계통도 분석은 기존에 보고되어 GenBank에 등재된 허피스바이러스와 염기서열을 비교분석 하였다.
성능/효과
- 2013년에는 1월과 4월에 2번의 모니터링 결과, 모두 음성으로 확인되었다. 2012년 4월, 5월 및 2013년 4월에는 통영과 거제지역 8곳의 인공배양장을 모니터링한 결과, station 1을 제외한 7곳의 인공배양장에서는 유생과 사육수에서 모두 음성으로 확인하였다[Table 2-A].
- 분리된 유전자 type 1~3과 이전에 보고된 유전자의 염기서열 유사도를 비교한 결과, type 1은 2011-KR과 제일 유사도(99.8%)가 높았고 type 2, 3에서는 99.8%로 2010-AUS과 제일 유사도가 높았다. FR- reference와는 3가지 type 모두 유사도(96.
- 8%로 2010-AUS과 제일 유사도가 높았다. FR- reference와는 3가지 type 모두 유사도(96.2 ~96.3%)가 제일 낮은 것을 확인하였다[Table 3]. 본 연구에서 분리한 굴 허피스바이러스는 mortality가 높은 OsHV-1 μVar형으로 밝혀졌다.
- 그 결과 유생, 사육수 그리고 참굴 성패에서도 바이러스를 확인하고 유전자 분석결과, OsHV-1 μVar형임을 밝혔다.
- , 2012). 본 실험에서 분리된 바이러스는 2008년 이후 굴의 대량 폐사에 원인이 되는 genotype인 2008- FR-microVar 및 2011-KR-microVar에 가까운 것으로 확인되었다.
- 그 결과 유생, 사육수 그리고 참굴 성패에서도 바이러스를 확인하고 유전자 분석결과, OsHV-1 μVar형임을 밝혔다. 또한, 참굴 유생, 사육수 및 참굴 성패에서 분리된 바이러스의 유전적인 차이는 없는 것으로 확인되어 해수 및 성패에서 분리된 바이러스가 굴 유생 바이러스와 동일한 것으로 추정된다. 즉 Le Deuff, R.
- 본 연구에서 분리한 굴 허피스바이러스는 mortality가 높은 OsHV-1 μVar형으로 밝혀졌다.
- 이번에 분리된 바이러스의 유전자는 ostreid herpesvirus micro version-1(OsHV-1 μVar)와 같은 ostreid herpesvirus인 FR-reference의 355번 서열부터 13개의 deletion을 확인하였고 이는 이전 국내에서 보고된 2건의 OsHV-1의 유전서열과도 동일하였다.
- 분리된 유전자의 염기서열 분석결과 크게 3가지 type으로 구분되었다. 가장 많이 나온 type 1은 2012년 4월, 5월의 유생 및 사육수와 2013년의 8, 9월 성패에서 분리되었으며 2012년 6월의 유생과 사육수의 448번에서 다른 염기서열을 보여 type 2로, 2013년 10월과 11월의 굴 성패에서도 479번 염기서열이 다른 시료와 달라 type 3으로 구분하였고 기존에 보고되어 GenBank에 등재된 국가별 허피스바이러스 서열을 비교하여 [Fig. 2]에 alignment 한 결과를 나타내었다. 이번에 분리된 바이러스의 유전자는 ostreid herpesvirus micro version-1(OsHV-1 μVar)와 같은 ostreid herpesvirus인 FR-reference의 355번 서열부터 13개의 deletion을 확인하였고 이는 이전 국내에서 보고된 2건의 OsHV-1의 유전서열과도 동일하였다.
후속연구
- (1996)의 보고처럼 굴 성패나 해수를 통해 OsHV-1 μVar 감염 및 이동 가능성이 있어 인공 배양장에서는 모패 및 유입수 등의 사전 바이러스검사를 실시하는 것이 필요하다고 사료된다. 그러나 정확한 바이러스의 감염 경로를 파악하기 위해서는 좀 더 많은 유전자의 분석이 요구되며 해수 중에서 바이러스의 생존조건과 수직감염 조건 등에 대해서도 많은 연구가 필요할 것이다. 본 연구에서 수행된 바이러스 계통분석 및 염기서열 분석을 포함한 굴 허피스바이러스의 모니터링 결과는 질병연구 및 관리에 유용한 자료가 될 것이다.
- 그러나 정확한 바이러스의 감염 경로를 파악하기 위해서는 좀 더 많은 유전자의 분석이 요구되며 해수 중에서 바이러스의 생존조건과 수직감염 조건 등에 대해서도 많은 연구가 필요할 것이다. 본 연구에서 수행된 바이러스 계통분석 및 염기서열 분석을 포함한 굴 허피스바이러스의 모니터링 결과는 질병연구 및 관리에 유용한 자료가 될 것이다.
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