Norovirus (NoV) is a major cause of food poisoning outbreaks in Korea. Most NoV outbreaks originate from environmental contamination, but bivalves such as oysters are also important vectors. Oyster Crassostrea gigas contamination by NoV has been reported in Korea, but no quantitative analyses of NoV...
Norovirus (NoV) is a major cause of food poisoning outbreaks in Korea. Most NoV outbreaks originate from environmental contamination, but bivalves such as oysters are also important vectors. Oyster Crassostrea gigas contamination by NoV has been reported in Korea, but no quantitative analyses of NoV have been performed. We investigated the NoV concentration in 21 oyster samples from a Korean commercial oyster-growing area with confirmed fecal contamination from January to December 2012, using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction. Additionally, we assessed the NoV concentration after heating to investigate the effects of heat treatment on NoV-infected oysters. In NoV-positive samples, the cycle threshold (Ct) values were 37.43-39.41 and 36.77-39.30, while viral concentrations were $8.97{\times}10^2-2.24{\times}10^2$ and $3.05{\times}10^2-7.47{\times}10^1$ copies/g for genogroups I and II, respectively. After heat treatment, NoV genogroup I decreased by 83.4%, 88.0%, 89.4% and 100% at $60^{\circ}C$, $68^{\circ}C$, $70^{\circ}C$, and $100^{\circ}C$, respectively, for 15 min, while genogroup II respectively decreased by 67.3%, 76.3%, 80.1%, and 89.8% under the same conditions.
Norovirus (NoV) is a major cause of food poisoning outbreaks in Korea. Most NoV outbreaks originate from environmental contamination, but bivalves such as oysters are also important vectors. Oyster Crassostrea gigas contamination by NoV has been reported in Korea, but no quantitative analyses of NoV have been performed. We investigated the NoV concentration in 21 oyster samples from a Korean commercial oyster-growing area with confirmed fecal contamination from January to December 2012, using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction. Additionally, we assessed the NoV concentration after heating to investigate the effects of heat treatment on NoV-infected oysters. In NoV-positive samples, the cycle threshold (Ct) values were 37.43-39.41 and 36.77-39.30, while viral concentrations were $8.97{\times}10^2-2.24{\times}10^2$ and $3.05{\times}10^2-7.47{\times}10^1$ copies/g for genogroups I and II, respectively. After heat treatment, NoV genogroup I decreased by 83.4%, 88.0%, 89.4% and 100% at $60^{\circ}C$, $68^{\circ}C$, $70^{\circ}C$, and $100^{\circ}C$, respectively, for 15 min, while genogroup II respectively decreased by 67.3%, 76.3%, 80.1%, and 89.8% under the same conditions.
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문제 정의
본 연구는 대체바이러스가 아닌 노로바이러스에 대한 직접적인 연구결과로서 감염된 굴의 가열처리 조건에 대한 농도변화를 보고하였다. 이러한 연구결과는 식품에서의 노로바이러스 처리에 관한 기초적인 결과로 모니터링에 의한 정량분석 결과와 함께 노로바이러스의 위해평가자료에 활용될 것으로 판단된다.
본 연구에서는 가열처리에 따른 노로바이러스 농도변화를 관찰하기 위하여 굴을 노로바이러스에 자연감염 시킨 후 가열처리조건별에 따라 노로바이러스의 농도변화를 분석하였다. 노로 바이러스 GI형 및 GII형의 초기농도가 7.
제안 방법
5 units/μL Enzyme Mix 1 μL, 5X RT buffer 5 μL, 10 mM dNTP 1 μL, 25 mM MgCl2 0.75 μL, 5 units/μL RNase inhibitor 0.25 μL, 10 μM primer 1 μL, 10 μM IC primer 0.5 μL, 10 μM probe 0.5 μL, IC RNA 1 μL 및 template RNA 5 μL로 반응액을 조성한 후, DW를 첨가하여 최종적으로 25 μL의 반응액을 조성하였다.
7일간 하수에 노출된 굴에서 노로바이러스 GI형과 GII형이 각각 이 7.22×103 및 2.43×103 copies/g 농도 감염된 것으로 확인되었으며, 이를 각 가열조건에 따라 처리하였다.
(2003) (Table 1)을 참고로 하였으며 probe는 노로바이러스 및 IC에 FAM-TAMRA detector와 ROX-BHQ2 detector 적용하였다. GI형 및 GII형 각각에 IC를 첨가하여 duplex realtime RT-PCR을 실시하였으며 샘플마다 3회의 PCR 반응을 실시하였다.
Realtime RT-PCR 반응을 위하여 OneStep RT-PCR kit (QIAgen, USA) 및 RNase inhibitor (Ambion, USA) 시약을 사용하였다. 폴리오바이러스의 RNA를 Internal control RNA (IC, US FDA)로 첨가하여 반응이 적절히 이루어지는지 확인하였으며 음성대조군으로 RNase-free water를 사용하여 실험의 신뢰성을 확보하였다.
노로바이러스 유전자의 정량분석을 위한 표준곡선은 pET30a vector에 해당 유전자의 sequence (GI형 96 bp, GII형 98 bp)를 삽입하여 제작된 plasmid DNA (Tarara, Korea)를 이용하였다. plasmid DNA는 GI형과 GII형 각각 106-102 copies/reaction농도로 희석한 후 realtime RT-PCR을 실시하였으며, Thermal cycler dice realtime software (Takara, Japan)을 이용하여 표준 곡선을 산출하였다.
가열처리는 굴을 가열하여 섭취할 경우 굴에 미칠 수 있는 온도 및 바이러스의 외피단백질에 손상을 미칠 수 있는 온도 등을 고려하여 60, 68, 70 및 100°C의 4개의 구간으로 설정하였으며, 각각 15분간 항온수조에 오염된 굴을 반응시켰다(AlfanoSobsey et al., 2012; Nuanualsuwan et al., 2002).
굴에서 노로바이러스 분리는 Jothikumar et al. (2005)을 일부 변형하여 사용하였다. 즉 분리된 중장선에 3 g에 동량의 300 μg/mL Proteinase K solution (Promega, USA)을 첨가하였으며, 호모게나이저를 사용하여 완전히 균질화하였다.
노로 바이러스 GI형 및 GII형의 초기농도가 7.22×103 및 2.43×103 copies/g인 감염굴을 60, 68, 70, 100°C에서 각각 15분간 처리하였으며, 그 결과를 감소율로 나타내었다.
노로바이러스 유전자의 정량분석을 위한 표준곡선은 pET30a vector에 해당 유전자의 sequence (GI형 96 bp, GII형 98 bp)를 삽입하여 제작된 plasmid DNA (Tarara, Korea)를 이용하였다. plasmid DNA는 GI형과 GII형 각각 106-102 copies/reaction농도로 희석한 후 realtime RT-PCR을 실시하였으며, Thermal cycler dice realtime software (Takara, Japan)을 이용하여 표준 곡선을 산출하였다.
노로바이러스 정량분석을 위한 표준곡선은 GI 및 GII형 plasmid DNA를 각각 106-102 copies/reaction로 희석하여 분석하였다. 표준곡선의 선형분석 결과, GI형은 상관계수(R2) 0.
연구에서는 우리나라 굴의 주 생산지인 남해안에서 분변오염 정도가 높은 것으로 확인된 통영시 인평동 인근의 굴 양식장을 대상으로 2012년 1월부터 12월까지 1년간 노로바이러스에 대한 모니터링을 실시하였으며, real-time RT-PCR을 이용하여 바이러스 유전자를 정량적으로 분석하였다. 또한 노로바이러스에 감염된 굴의 가열처리 조건을 구명하기 위하여 가열처리 후 노로바이러스의 농도변화를 분석하였다.
반응조건으로 50°C 50분간 역전사 반응 후, 95°C에서 15분간 DNA를 변성하였다.
본 연구에서는 선행연구의 정성분석 결과를 보완하고자 realtime RT-PCR을 적용하였으며, 통영시 인평동 인근의 양식장 1지점에서 2012년 1월부터 12월까지 21회에 걸쳐 굴을 샘플링하여 노로바이러스를 분석하였다. 대상지점은 연중 분변 오염정도가 높은 것으로 확인되어(Shim et al.
연구에서는 우리나라 굴의 주 생산지인 남해안에서 분변오염 정도가 높은 것으로 확인된 통영시 인평동 인근의 굴 양식장을 대상으로 2012년 1월부터 12월까지 1년간 노로바이러스에 대한 모니터링을 실시하였으며, real-time RT-PCR을 이용하여 바이러스 유전자를 정량적으로 분석하였다. 또한 노로바이러스에 감염된 굴의 가열처리 조건을 구명하기 위하여 가열처리 후 노로바이러스의 농도변화를 분석하였다.
, 2002). 오염된 굴은 패각을 분리하여 알굴 상태로 가열처리를 실시하였으며, 처리 후 즉시 노로바이러스 분석을 실시하였다.
우리나라에서 생산되는 굴은 남해안에 집중되어 있으며, 도심의 하수가 해역으로 유입될 가능성이 큰 통영시 인근의 굴 양식장을 대상으로 샘플링을 실시하였다(Fig. 1). 2012년 1월에서 12월까지 경상남도 통영시 인평동 인근 굴 양식장 1지점에서 총 21개의 참굴(Crassostrea gigas)을 샘플링 하였으며, 노로바이러스 분석을 위해 냉장상태로 실험실까지 운반하였다.
이 후 95°C 10초, 53°C 25초 및 62°C 70초간 반응을 45 cycle 반응시켰으며, PCR 반응은 Thermal cycler dice TP800 (Takara, Japan)를 이용하였다.
반응액은 3,000 g에서 5분간 원심분리 후 상등액을 RNA 추출에 사용하였다. 자연감염을 통해 노로바이러스가 검출된 샘플을 양성 대조군으로 사용하여 실험의 신뢰성을 확보하였다.
, 2012). 즉, 경남 통영시 일원에서 채취한 참굴(Crassostrea gigas)을 사각 채롱에 일정량씩 넣고 분변지표 생물인 분변계대장균의 농도가 높은 것으로 확인된 부산시 용호동 해상구조물에 시설하여 노로바이러스가 자연적으로 오염되도록 하였다.
Realtime RT-PCR 반응을 위하여 OneStep RT-PCR kit (QIAgen, USA) 및 RNase inhibitor (Ambion, USA) 시약을 사용하였다. 폴리오바이러스의 RNA를 Internal control RNA (IC, US FDA)로 첨가하여 반응이 적절히 이루어지는지 확인하였으며 음성대조군으로 RNase-free water를 사용하여 실험의 신뢰성을 확보하였다.
대상 데이터
1). 2012년 1월에서 12월까지 경상남도 통영시 인평동 인근 굴 양식장 1지점에서 총 21개의 참굴(Crassostrea gigas)을 샘플링 하였으며, 노로바이러스 분석을 위해 냉장상태로 실험실까지 운반하였다. 또한 샘플마다 10개체 이상의 각굴에서 중장선을 분리하였으며, 바이러스 분리전까지 -20°C 이하에 보관하였다.
2012년 1월에서 12월까지 경상남도 통영시 인평동 인근 굴양식장 1지점에서 총 21개의 참굴을 샘플링 하여 노로바이러스를 분석하였다.
가열처리에 따른 노로바이러스 농도변화를 분석하기 위한 굴의 바이러스 감염은 Naturally-contamination방법을 이용하여 인위적으로 감염시켰다(Oh et al., 2012). 즉, 경남 통영시 일원에서 채취한 참굴(Crassostrea gigas)을 사각 채롱에 일정량씩 넣고 분변지표 생물인 분변계대장균의 농도가 높은 것으로 확인된 부산시 용호동 해상구조물에 시설하여 노로바이러스가 자연적으로 오염되도록 하였다.
이 후 95°C 10초, 53°C 25초 및 62°C 70초간 반응을 45 cycle 반응시켰으며, PCR 반응은 Thermal cycler dice TP800 (Takara, Japan)를 이용하였다. 본 연구에 사용된 primer 및 probe는 Kageyama et al. (2003) (Table 1)을 참고로 하였으며 probe는 노로바이러스 및 IC에 FAM-TAMRA detector와 ROX-BHQ2 detector 적용하였다. GI형 및 GII형 각각에 IC를 첨가하여 duplex realtime RT-PCR을 실시하였으며 샘플마다 3회의 PCR 반응을 실시하였다.
성능/효과
GI 및 GII형 모두 높은 온도에서 처리할 경우 더 높은 감소효과를 나타내는 것으로 확인되었지만, 100°C에서 처리한 GI형의 경우를 제외하고는 가열처리 후에도 일부 유전자가 검출되는 것으로 나타났다(Table 3).
GI형의 경우 전 구간에서 80% 이상의 감소율을 나타내었으며, GII형은 67-90%의 감소율을 나타내었다. GI 및 GII형 모두 높은 온도에서 처리할 경우 더 높은 감소효과를 나타내는 것으로 확인되었지만, 가열처리 후에도 일부 유전자가 검출되는 것으로 나타났다. 바이러스는 72°C 이상의 온도로 처리할 경우 외피단백질이 파괴된다고 알려져 있으나, 본 연구에서는 100°C에서 15분 처리시에도 바이러스의 유전자가 검출되는 것으로 나타났다.
가장 높은 농도로 검출된 샘플은 GI형이 8.97×102 copies/g으로 검출되었으며 가장 낮은 농도로 검출된 샘플은 GII형이 7.47×101 copies/g으로 검출되었다(Table 2).
노로바이러스에 감염된 굴을 각 구간별로 가열처리하여 realtime RT-PCR로 분석한 결과 Ct value는 GI형이 37.07-37.71, GII형이 35.46-37.07로 나타났으며, 이를 표준곡선에 대입하여 계산된 노로바이러스의 농도는 GI형이 1.18×103-7.42×102, GII형이 7.94×102-2.48×101 copies/g으로 나타났다.
노로바이러스의 농도는 60, 68, 70°C에서 처리한 결과 GI형이 각각 83.4, 88.0, 89.4% 감소되었으며, GII형은 60, 68, 70, 100°C에서 각각 67.3, 76.3, 80.1, 89.8% 감소되는 것으로 나타났다.
모니터링 결과, 2012년 1월에서 12월까지 총 21개의 샘플 중 8개의 샘플에서 노로바이러스가 검출되어 38% (8/21)의 검출율을 나타내었다. 유전형별로는 GI형이 24% (5/21), GII형이 29% (6/21)의 검출율을 나타내었으며, 14% (3/21)의 샘플에서 GI형과 GII형이 동시에 검출되었다.
47×101 copies/g으로 나타났다. 모든 샘플이 103 copies/g 이하의 농도에서 검출되었으며, 102 copies/g보다 낮은 농도로 검출된 샘플이 9.5% (2/21)로 확인되었다. 이와 유사한 연구로 영국의 자료에 따르면 2009년부터 3년간 영국에서 생산된 굴의 76% (643/844)가 노로바이러스에 오염된 것으로 나타났으며, 바이러스의 농도는 102 copies/g 이상이 36.
바이러스는 72°C 이상의 온도로 처리할 경우 외피단백질이 파괴된다고 알려져 있으나, 본 연구에서는 100°C에서 15분 처리시에도 바이러스의 유전자가 검출되는 것으로 나타났다.
모니터링 결과, 2012년 1월에서 12월까지 총 21개의 샘플 중 8개의 샘플에서 노로바이러스가 검출되어 38% (8/21)의 검출율을 나타내었다. 유전형별로는 GI형이 24% (5/21), GII형이 29% (6/21)의 검출율을 나타내었으며, 14% (3/21)의 샘플에서 GI형과 GII형이 동시에 검출되었다. 시기별로는 1-5월, 12월에 집중적으로 검출되는 경향을 나타내었다(Table 2).
이러한 연구들에서 MCV나 FCV를 65°C에서 2분 또는 72°C 1분간 가열하였을 경우 감염가가 6.7 Log10 이상 감소한다는 보고가 있어 본 연구의 가열처리 후 검출된 노로바이러스들도 상당수는 감염력을 상실했을 것으로 판단된다.
표준곡선의 선형분석 결과, GI형은 상관계수(R2) 0.999, 기울기가 -3.286으로 나타났으며, GII형의 경우 상관계수(R2) 0.998, 기울기는 –3.348로 나타났다(Fig. 2).
후속연구
또한 본 연구에서 가열처리에 사용된 굴은 자연감염을 통해 다소 높은 농도의 바이러스가 감염된 굴이므로 실제 해역에서 분리되는 농도와 같이 초기농도가 낮은 샘플은 가열처리에 따라 그 감소율이 더 높아질 수 있을 것이다. 따라서 바이러스의 감염농도를 조절하여 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.
9%로 보고한 바 있다 (EFSA, 2012). 따라서 본 연구에서의 샘플링 지점은 분변오염 정도가 높은 곳임을 고려하면 검출된 노로바이러스의 농도가 높지 않은 것으로 판단할 수 있으나, 이러한 결과는 단기간의 국소적인 결과이므로 우리나라에서 굴이 생산되는 해역에 대한 집중적인 조사가 필요 할 것으로 판단된다.
7 Log10 이상 감소한다는 보고가 있어 본 연구의 가열처리 후 검출된 노로바이러스들도 상당수는 감염력을 상실했을 것으로 판단된다. 또한 본 연구에서 가열처리에 사용된 굴은 자연감염을 통해 다소 높은 농도의 바이러스가 감염된 굴이므로 실제 해역에서 분리되는 농도와 같이 초기농도가 낮은 샘플은 가열처리에 따라 그 감소율이 더 높아질 수 있을 것이다. 따라서 바이러스의 감염농도를 조절하여 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.
이러한 연구결과는 식품에서의 노로바이러스 처리에 관한 기초적인 결과로 모니터링에 의한 정량분석 결과와 함께 노로바이러스의 위해평가자료에 활용될 것으로 판단된다. 또한 식품에서의 노로바이러스 식중독의 감염농도를 구명하기 위하여 지속적인 정량분석과 역학조사가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
본 연구는 대체바이러스가 아닌 노로바이러스에 대한 직접적인 연구결과로서 감염된 굴의 가열처리 조건에 대한 농도변화를 보고하였다. 이러한 연구결과는 식품에서의 노로바이러스 처리에 관한 기초적인 결과로 모니터링에 의한 정량분석 결과와 함께 노로바이러스의 위해평가자료에 활용될 것으로 판단된다. 또한 식품에서의 노로바이러스 식중독의 감염농도를 구명하기 위하여 지속적인 정량분석과 역학조사가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
노로바이러스란 분류상 어디에 속하며 피막의 유무는 어떠한 바이러스인가?
노로바이러스는 Caliciviridae에 속하며 피막이 없는 바이러스로 대략 7.6 kb의 단일가닥 RNA로 구성되어 있다.
노로바이러스의 유전자는 어떻게 구성되는가?
노로바이러스는 Caliciviridae에 속하며 피막이 없는 바이러스로 대략 7.6 kb의 단일가닥 RNA로 구성되어 있다. 이 바이러스는 크게 5개의 genogroup (GⅠ-GⅤ)으로 분류되고 있으며, 이들 중 GⅠ, GⅡ 및 GⅣ genogroup이 사람에게 식중독을 일으킨다고 알려져 있다.
노로바이러스는 몇 개의 genogroup으로 분류되는가?
6 kb의 단일가닥 RNA로 구성되어 있다. 이 바이러스는 크게 5개의 genogroup (GⅠ-GⅤ)으로 분류되고 있으며, 이들 중 GⅠ, GⅡ 및 GⅣ genogroup이 사람에게 식중독을 일으킨다고 알려져 있다. 노로바이러스는 10-100개의 소량 입자로도 감염을 유발시킬 수 있으며, 인체 감염시 많은 수의 바이러스가 배출되는 특징이 있다(Koopmans et al.
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