선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 논문은 해수 또는 수산물에 존재하는 장염비브리오의 정량을 위하여 most probable number (MPN)와 H-NS 유전자를 표적으로 하는 PCR assay 방법을 병행하여 해수 및 바지락 중의 장염비브리오 농도를 정량하는 조건을 검토하였다.
제안 방법
- H-NS 유전자를 표적으로 하는 PCR assay에 의한 장염비브리오 균체의 검출 최소농도를 검토하기 위하여 균체 농도를 반응액에 0.8×10⁴CFU에서 0.8×100 CFU 농도가 되도록 조정 하여 첨가하였다.
- 2 mL를 가하여 현탁 후 98℃에서 5분간 열처리 후 H-NS 유전자 증폭을 위한 PCR assay용 주형 DNA로 사용하였다. H-NS 유전자의 증폭산물이 확인된 시험관은 양성으로 판정하여 최확수(most probable number, MPN)에 적용하여 100 mL 또는 100 g 중에 존재하는 장염비브리오의 균수로 계산하였다.
- PCR assay에 의한 장염비브리오의 최소 검출농도를 측정하기 위하여 3% sodium chloride이 첨가된 Luria-Bertani (1% tryptone, 0.5% yeast-extract, 3% NaCl) broth 에서 하룻밤 배양한 장염비브리오 RIMD2210633 균주를 원심 분리(12,000 rpm, 2 min)하여 집균하였다. 여기에 1.
- 0 pmol이 되도록 조정하였으며, 반응액은총 50 µL가 되도록 하였다. PCR 조건은 95℃에서 1회 3분간열 변성 후 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 한 단위로 하여 이를 30회 반복하여 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA 산물은 1.
- 곰소만에서 생산되는 패류종인 바지락 중의 장염비브리오 농도를 측정하기 위하여 2013년 7월과 8월 2개월간 Fig. 1에 제시한 지점에서 바지락을 채취하여 총 6점의 바지락에 대해 장염비브리오의 농도를 MPN-PCR assay를 병행하여 측정하였다. 그결과 7월의 경우, 장염비브리오는 780-1,700 MPN/100 g (평균 1,193 MPN/100 g) 이였으며, 8월 시료에서는 1,700-2,100 MPN/100 g (평균 1,967 MPN/100 g)로 측정되었다.
- 01 mL씩 접종한 후 35℃에서 16시간 정치 배양하였다. 또한 바지락은 무균적으로 탈각 후 육 25 g을 멸균된 Waring Blender cup (Torrington, USA)에 넣고 여기에 9배 량의 멸균인산완충희석액 (phosphate buffered saline, pH7.4)을 첨가하여 90초 동안 균질화한 다음 10진법으로 적절한 단계까지 희석하여 해수와 동일 하게 3개 시험관법으로 접종한 후 35℃에서 16시간 정치 배양 하였다. 각 배양액 1.
- 0 mL를 eppendorf tube에 취해 원심분리(12,000 rpm, 2 min)한 후 배양액은 완전히 제거하여 균체를 회수하였다. 여기에 멸균 증류수 0.2 mL를 가하여 현탁 후 98℃에서 5분간 열처리 후 H-NS 유전자 증폭을 위한 PCR assay용 주형 DNA로 사용하였다. H-NS 유전자의 증폭산물이 확인된 시험관은 양성으로 판정하여 최확수(most probable number, MPN)에 적용하여 100 mL 또는 100 g 중에 존재하는 장염비브리오의 균수로 계산하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 1회 3분간열 변성 후 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 한 단위로 하여 이를 30회 반복하여 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 Vilber Lourmat (Bio-Paint ST4, Marne-la-Vallee, France) 사 Gel-Doc system으로 관찰하였다.
- 해수채취는 만조 시 각 조사지점에서 표층용 채수기를 사용하여 멸균된 250 mL 광구병에 직접 채취하였으며, 바지락은 간조 시 각 조사지점에서 채취도구를 사용하여 직접 채취하였다. 채취한 해수 및 바지락 시료는 얼음이 채워진 아이스박스에 넣어 10℃ 이하로 유지하여 실험실로 운반한 후 미생물시험을 실시하였다. 해수의 수온, pH, 염분 및 용존산소는 수질분석기(YSI556 multiprobe system; Yellow Springs, YSI Life Science, OH, USA)를 사용하여 현장에서 측정하였다.
- 해수 및 패류시료 중의 장염비브리오 정량을 위해 Recommended Procedures for the Sea Water and Shellfish (APHA, 1970)에 준하여 시험하였다. 해수는 최종농도 2%의 sodium chloride이 첨가된 alkaline peptone water (Merck, Darmstadt, Germany) 10 mL에 3개 시험관법으로 10, 1, 0.1 및 0.01 mL씩 접종한 후 35℃에서 16시간 정치 배양하였다. 또한 바지락은 무균적으로 탈각 후 육 25 g을 멸균된 Waring Blender cup (Torrington, USA)에 넣고 여기에 9배 량의 멸균인산완충희석액 (phosphate buffered saline, pH7.
- 채취한 해수 및 바지락 시료는 얼음이 채워진 아이스박스에 넣어 10℃ 이하로 유지하여 실험실로 운반한 후 미생물시험을 실시하였다. 해수의 수온, pH, 염분 및 용존산소는 수질분석기(YSI556 multiprobe system; Yellow Springs, YSI Life Science, OH, USA)를 사용하여 현장에서 측정하였다.
- 해수는 2013년 6월부터 11월까지 전라북도 곰소만 해역 5곳의 조사지점에서 매월 1회씩 총 6회에 걸쳐 채취하였으며, 바지락은 3곳의 조사지점에서 2013년 7월과 8월 총 2회 채취하였다. 해수채취는 만조 시 각 조사지점에서 표층용 채수기를 사용하여 멸균된 250 mL 광구병에 직접 채취하였으며, 바지락은 간조 시 각 조사지점에서 채취도구를 사용하여 직접 채취하였다. 채취한 해수 및 바지락 시료는 얼음이 채워진 아이스박스에 넣어 10℃ 이하로 유지하여 실험실로 운반한 후 미생물시험을 실시하였다.
대상 데이터
- 전라북도 부안군 곰소만 표층 해수 중의 장염비브리오 농도를 측정하기 위하여 최확수법과 H-NS 유전자의 primer set를 사용한 PCR assay의 병용에 의해 2013년 6월부터 11월까지 6개월동안 총 30개의 해수 시료를 대상으로 장염비브리오의 농도를 측정하였다. 각 해수 시료의 온도, 염분, pH 및 용존산소에 대한 측정치는 Table 2에 제시하였다.
- 1에 제시하였다. 해수는 2013년 6월부터 11월까지 전라북도 곰소만 해역 5곳의 조사지점에서 매월 1회씩 총 6회에 걸쳐 채취하였으며, 바지락은 3곳의 조사지점에서 2013년 7월과 8월 총 2회 채취하였다. 해수채취는 만조 시 각 조사지점에서 표층용 채수기를 사용하여 멸균된 250 mL 광구병에 직접 채취하였으며, 바지락은 간조 시 각 조사지점에서 채취도구를 사용하여 직접 채취하였다.
이론/모형
- 균수 측정은 현탁액 10 µL를 counting chamber (Paul Marienfeld Gmbh&Co, KG Lauda-Konigshofen, Germany)에 넣고 광학현미경(Olympus CX31RBSF, Olympus Optical Co., LTD. Tokyo, Japan)하에서 균수를 직접 계측하여 계산하였으며 적절한 농도까지 10진법으로 희석하여 PCR assay에 사용하였다.
- 유전자 증폭에는 EmeraldAmp GT PCR Master Mix (Takara, Japan)를 사용하였다. hns 및 toxR 프라이머의 최종농도는 반응액에 각각 2.
- 해수 및 패류시료 중의 장염비브리오 정량을 위해 Recommended Procedures for the Sea Water and Shellfish (APHA, 1970)에 준하여 시험하였다. 해수는 최종농도 2%의 sodium chloride이 첨가된 alkaline peptone water (Merck, Darmstadt, Germany) 10 mL에 3개 시험관법으로 10, 1, 0.
성능/효과
- 1×102MPN/100 mL로 측정 되었다는 보고도 있는데 이 결과는 곰소만 해수보다 약 10배 정도 낮은 수치이다. Table 2의 결과를 종합해 보면 해수 중의 염분, pH 및 용존산소와 장염비브리오의 검출농도와는 상관관계는 희박하였다. 또한 해수채취 지점에 따른 장염비브리오 농도에는 약간의 차이는 있었지만 대체로 안정적으로 분포하고 있었다.
- 45배 정도 높은 것으로 확인되었다. 결과적으로 해수보다는 바지락에 약 2.5배 정도 높은 농도로 장염비브리오가 존재하는데 이는 바지락의 먹이섭취 방식인 여과섭식 때문에 바지락 체내에 장염비브리오의 축적이 용이하였거나 또는 바지락의 생활환경인 저질이 해수보다 영양성분이 많아 장염비브리오 증식에 유리하게 작용하였을 가능성이 제기된다. DePaola et al.
- 또한 toxR 프라이머에 의한 PCR assay 결과도 H-NS와 동일하게 확인되었다(자료미제시). 결론적으로 PCR assay를 위한 반응액 중의 장염비브리오 농도가 8 CFU 이상이면 검출은 가능하다고 판단되는 결과이며 이는 기존의 보고와 유사한 결과이다(Wei et al., 2014). 장염비브리오는 세대시간이 어느 세균보다 빠르고 최소 검출한계의 균 농도가 8 CFU 이상이면 검출이 가능하기 때문에 적절한 배지를 이용하여 매우 짧은 시간 증균 하여도 장염비브리오 검출에는 문제는 없을 것으로 판단된다.
- 또한 해수채취 지점에 따른 장염비브리오 농도에는 약간의 차이는 있었지만 대체로 안정적으로 분포하고 있었다. 결론적으로 해수에서 장염비브리오의 검출농도는 해수의 온도와 상관관계가 가장 밀접하여 해수의 온도가 높아질수록 장염비브리오 농도는 높아지고 수온이 낮아지면 장염비브리오의 농도도 함께 낮아지는 것으로 확인되었다. 수온이 16℃ 이하인 11월의 경우에는 장염비브리오의 검출은 거의 확인되지 않았으며 이는 기존의 보고와 거의 동일한 결과이다(Kaneko and Colwell, 1975).
- 9 MPN/100 mL)로 측정되었다. 곰소만 해수 중의 장염비브리오 농도는 수온이 가장 높은 8월에 가장 높게 측정되었으며 수온 저하와 동반하여 장염비브리오의 농도도 낮아지는 것으로 확인되었다. DePaola et al.
- 수온은 6월에 21-23℃ 였으나 점점 상승하여 8월에는 30℃ 전후로 가장 높게 측정되었으며 이후 점차 하락하여 11월에는 15-16℃ 전후로 측정되었다. 염분과 pH는 월별에 따른 차이는 거의 나타나지 않는 안정한 값을 나타내었으며, 용존산소는 수온이 높은 8월이 다른 월에 비해 가장 낮게 측정되었다. 해수 채취지점이 곰소만으로 한정되어 있기 때문에 정점에 따른 수온, 염분, pH 및 용존산소 등의 수치는 거의 차이가 없는 것으로 파악되었다.
- 염분과 pH는 월별에 따른 차이는 거의 나타나지 않는 안정한 값을 나타내었으며, 용존산소는 수온이 높은 8월이 다른 월에 비해 가장 낮게 측정되었다. 해수 채취지점이 곰소만으로 한정되어 있기 때문에 정점에 따른 수온, 염분, pH 및 용존산소 등의 수치는 거의 차이가 없는 것으로 파악되었다. 장염비브리오의 농도는 수온이 21-23℃ 전후인 6월의 경우 20-78 MPN/100 mL (평균 48.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.