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문제 정의
- 레몬오일을 이용한 대부분의 연구들은 시너지 블랜딩을 이용한 향기요법과 마사지 요법 등의 미용학적 연구들로서 레몬오일을 단독으로 사용한 항 천식 및 항염증 효능에 대한 논문은 보고된 바 없다. 따라서 레몬 오일(Citrus Medica Limonum;CML)이 기도과민성과 더불어 혈액학적 변화와 혈액 내 세포분화 비율에 미치는 영향, 혈청 내 사이토카인의 변화, 폐 조직을 관찰하여 알레르기성 천식 생쥐 모델에 미치는 영향을 조사함으로서 천식 치료제로서의 가능성을 제시하고자 한다.
- 본 연구는 이러한 실정에서 천식을 효율적으로 중재할 수 있는 대안으로 보완대체요법 가운데 아로마테라피를 택하여 레몬 오일의 항염증 효과 및 항 천식효과에 미치는 효과를 규명하기 위해 시도되었다. 레몬오일을 이용한 대부분의 연구들은 시너지 블랜딩을 이용한 향기요법과 마사지 요법 등의 미용학적 연구들로서 레몬오일을 단독으로 사용한 항 천식 및 항염증 효능에 대한 논문은 보고된 바 없다.
- 천식환자에게 기도과민성 정도와 기관지 호산구수의 상관관계는 이미 알려진 사실로 보고되고 있는 바[9] 본 연구에서 CML을 흡입시킨 BALB/C Mice의 호산구의 빈도를 측정해보았다. 그 결과 [Fig.
제안 방법
- t)하였다. 3주째부터 분무기를 이용하여 1% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3 회씩 2주 동안 비강 및 기도내로 흡입시키고 최종 1주간은 2% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3 회씩 흡입시켰다. 이때 대조군에는 PBS 또는 Alum 만을 주사, OVA를 흡입시켰다[Fig.
- 즉 Penh값은 Pause-PIF/PEF와 같으며, 여기서 Pause=(Te-TR)/Tr로서 PIF는 peak inspiratory flow, PEF는 peak expiratory flow, Te는 expiratory time, Tr은 relaxation time으로 Biosystem XA software(Buxco Research System, Wilmington, USA)를 이용하여 분석하였다. 6주간 2.5% OVA inhallation 24시간 후에, 농도별 Methachololo (Sigma)수용액을 50, 25, 12.56.25, 3.125 mg/ml의 농도로 분무하고, 각각의 농도에 대한 기도의 반응성은 10분 동안 연속적으로 모니터링으로 체크하였다.
- CML이 OVA/Alum으로 전신 감작된 마우스의 알레르기성 기관지 천식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 BALB/c에 OVA/Alum으로 감작시켜 CML을 투여한 후 MCH로 기도 과민성에 미치는 효과를 측정하였고 폐 조직에 H&E/M&T, PAS로 염색하여 조직의 변화를 관찰하고 혈액과 혈청 내의 백혈구 수치의 변화, 백혈구 내호산구, 호염기구의 각 빈도와 사이토카인의 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- H&E(Hemotoxylin&Eosin) 염색과 M&T (Massom’s Trichrome) 염색을 위해 BALB/c의 폐조직을 떼어내어, 정상군에 비교한 손상정도를 0∼2의 Index 값을 준 다음 조직 부분의 세기관지와 폐포, 그리고 세포부분의 감염과 혈액세포의 침윤정도를 알아보는 H&E염색과 그리고 M&T 염색에 의한 콜라겐 침착정도를 분석하였다.
- TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30 분간 방치한 후 50 ㎕의 stop 용액을 처리한 후 ELISA kit (R&D system)을 이용하여 ELISA reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 폐를 떼어내어 즉시 10% formaldehyde 용액에 고정한 후 세절하여 흐르는 물에 8 시간 수세한 다음, epoxy 에 포매하고, 이것을 microtome으로 절편을 만들어 표준 방법에 의하여 Hematoxylin & Eosin과 collagen deposition염색인 Masson-Trichrome 염색을 수행하였다. 그리고 배상세포를 관찰하기 위하여 PAS 염색을 하여 400x의 광학현미경에서 관찰하였다.
- 정상군은 천식유발이 잘 되었는지를 비교하기 위한 군으로 아무런 처치를 하지 않았다. 대조군은 약물의 효능을 비교하기 위해 OVA/ALUM을 복강 내 주사하여 전신 감작시킨 후 OVA를 흡입시켰다. 실험군은 아로마오일을 생리식염수에 CML0.
- 본 연구는 4집단 즉, 정상군(Normal Group), 대조군(Control Group), 양성대조군(Rolipram Group), 실험군(CML Group)에 대한 6주 동안의 실험 전, 후 기도과민성에 미치는 효과, 혈액학적 변화에 미치는 효과, 혈청 내 사이토카인의 변화, 조직의 변화는 다음과 같은 결과를 나타내었다.
- 생쥐의 생명유지기능(vital function)을 담당하는 호흡기계에서 기도저항수치(Penh)에 미치는 영향을 검토하고 신체기능에 대한 안전성 평가를 목적으로 하는 Plethysmograph (BUXCO Biosystem XA, USA)는 기도 저항수치 측정시험을 무마취의 시험동물을 whole body chamber에 넣어 놓은 상태에서 기도과민성의 측정은 whole body plethysmographs인 Biosystem XA (Buxco research system, Wilmington, NC, USA) 장비를 사용하여 실시하였다. 즉 Penh값은 Pause-PIF/PEF와 같으며, 여기서 Pause=(Te-TR)/Tr로서 PIF는 peak inspiratory flow, PEF는 peak expiratory flow, Te는 expiratory time, Tr은 relaxation time으로 Biosystem XA software(Buxco Research System, Wilmington, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 대조군은 약물의 효능을 비교하기 위해 OVA/ALUM을 복강 내 주사하여 전신 감작시킨 후 OVA를 흡입시켰다. 실험군은 아로마오일을 생리식염수에 CML0.3%로 희석한 후 nebulizer(Buxco. USA)를 이용하여 3주간 3회 100ml씩 30분간 흡입박스 (아크릴제작, 30cm x 45cm)에 분무하였다. 양성 대조군으로는 Rolipram을 3mg/kg으로 매일 I.
- p)로 주사하여 전신감작을 시킨다. 이후 2주째에 생쥐를 마취한 후 난알부민 (500 ug/ml) 100 ㎕를 기도투여 (i.t)하였다. 3주째부터 분무기를 이용하여 1% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3 회씩 2주 동안 비강 및 기도내로 흡입시키고 최종 1주간은 2% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3 회씩 흡입시켰다.
- 생쥐의 생명유지기능(vital function)을 담당하는 호흡기계에서 기도저항수치(Penh)에 미치는 영향을 검토하고 신체기능에 대한 안전성 평가를 목적으로 하는 Plethysmograph (BUXCO Biosystem XA, USA)는 기도 저항수치 측정시험을 무마취의 시험동물을 whole body chamber에 넣어 놓은 상태에서 기도과민성의 측정은 whole body plethysmographs인 Biosystem XA (Buxco research system, Wilmington, NC, USA) 장비를 사용하여 실시하였다. 즉 Penh값은 Pause-PIF/PEF와 같으며, 여기서 Pause=(Te-TR)/Tr로서 PIF는 peak inspiratory flow, PEF는 peak expiratory flow, Te는 expiratory time, Tr은 relaxation time으로 Biosystem XA software(Buxco Research System, Wilmington, USA)를 이용하여 분석하였다. 6주간 2.
- 천식생쥐에서 분리한 혈청에서 각 사이토카인량을 측정하기 위해 OVA-IgE (Shibayagi, japan), Histamine, enzyme-linked immuno-sorbent assay (Biosource, USA)으로 생산량을 측정하였다. 각 항체를 coating 완충용액에 희석하여 microwell에 coating한 후 4℃에서 overnight하였다.
- 천식의 진단으로 Methacholine(MCH)을 이용한 기관지 유발 검사를 하여 MCH 농도를 점차 증가시키면서 기도 저항성 측정을 통해 기관지 과민성 정도를 확인하였다. [Fig.
- 폐를 떼어내어 즉시 10% formaldehyde 용액에 고정한 후 세절하여 흐르는 물에 8 시간 수세한 다음, epoxy 에 포매하고, 이것을 microtome으로 절편을 만들어 표준 방법에 의하여 Hematoxylin & Eosin과 collagen deposition염색인 Masson-Trichrome 염색을 수행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 기기는 Clean bench, Autoclave, W ater bath, Vorter mixer(vison scientific,co.,Korea),Micro -pipet(Gilson,co.,France),spectrophotometer(Shim-azue, co.,Japan), homogenizer (OMNI.co., USA)등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시약 중 diethyl pyrocarbonate(DEPC), 2,7-dichlorodihydrofluorescin diacettate(DCFH-DA), RPMI-1640, isopropanol, 적혈구용혈액(RBC lysis solution),dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), formaldehyde, lamide, magnesium, chloride (MgCl2)는 Sigma 사 (USA) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)는 Hyclone 사(Logan, USA) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 오일은 lemon(Citrus Medica Limonum: concentration 100%)을 사용하였다. 실험에 쓰는 오일은 Premavera의 essential oil을 구입한 후 정선하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 오일은 lemon(Citrus Medica Limonum: concentration 100%)을 사용하였다. 실험에 쓰는 오일은 Premavera의 essential oil을 구입한 후 정선하여 사용하였다. 양성대조군으로는 항염증제인 Rolipram을 사용하였다.
- 암컷 8 주령의 SPF(specific pathogen-free) BALB/c 생쥐 (18 ∼ 20 g)는 오리엔트바이오(Korea)사에서 공급 받아 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 1-2 시간 (light-dark cycle)의 환경에서 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- USA)를 이용하여 3주간 3회 100ml씩 30분간 흡입박스 (아크릴제작, 30cm x 45cm)에 분무하였다. 양성 대조군으로는 Rolipram을 3mg/kg으로 매일 I.P 하였다.
- 실험에 쓰는 오일은 Premavera의 essential oil을 구입한 후 정선하여 사용하였다. 양성대조군으로는 항염증제인 Rolipram을 사용하였다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 Mean±Standard Error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- 실험 종료 후 생쥐는 10% Chloral Hydrate (Fluka, USA)을 복강 내에 투여한 후 혈액을 심장 채혈법으로 포집하고, 원심분리 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 얻었으며, -70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. 혈액성분과 효소들의 활성도 측정은 바이오톡스텍 (주) (Republic of Korea)에 의뢰하였다.
성능/효과
- 1. CML이 기도 과민성에 미치는 효과에서 대조군에 비하여 유의성 있는 감소효과를 나타냈다.
- 2. CML이 혈액학적 변화에 미치는 효과에서 백혈구의 수치는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소했다.
- 3. CML이 혈액내 세포분화비율에 미치는 영향에서 호산구의 빈도는 대조군에 비하여 유의성있게 감소했다.
- 4. CML이 혈액 내 세포분화비율에 미치는 영향에서 호염기구의 빈도는 대조군에 비하여 유의성있게 감소했다.
- 5. CML의 혈청 내 사이토카인의 변화에서 히스타민은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소했다.
- 6. CML의 혈청 내 사이토카인의 변화에서 Anti-OVA IgE는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소했다.
- 7. 폐 조직의 변화를 H&E/M&T 염색으로 조직을 확인한 결과, 폐포의 손상도와 염증세포의 감소를 확인했다.
- 8. 점액을 분비시키는 배상세포를 PAS로 염색하여 조직을 관찰한 결과 유의성 있는 감소를 보였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 알레르기성 염증으로 유발된 기관지 과민성이 대조군에 비해 CML 흡입군에서 효과적으로 억제되었고 혈액학적 검사 결과와 혈청 내 히스타민과 IgE 생성량에서 또한 유의한 수준의 감소가 있었다.
- 그 결과 H&E 염색에서 정상군은, 조직세포의 규칙적인 배열로 기관지 및 폐포의 내강이 잘 보이고 대조군에서는 기관지 주변 염증세포의 침윤과 세기관지와, 폐포의 이상 형태 및 협착이 관찰되었다.
- 그 결과 [Fig. 4]에서 볼 수 있는 바와 같이 대조군은 7.72±1.52, 실험군인 OVA-CML은 4.08 ± 0.14로 대조군에 비하여 실험군인 OVA-CML군에서 호산구가 유의성 있게 감소했음을 보였다(p<0.05).
- 본 연구에서 CML을 흡입시킨 BALB/C Mice를 배상 세포 과 형성 여부를 알아보기 위해 폐조직을 PAS(Pe-ri odic acid-Schiff) 염색한 결과 정상군에 비해서 대조군은 174.5 ± 2.5, CML군은 156.7 ± 2.3로 OVA-CT군에서 배상세포가 과 형성 되었고 OVA-CML군에서 배상세포가 감소되었다(p<0.01).
- 본 연구에서 CML을 흡입시킨 BALB/C Mice의 anti-OVA IgE의 변화를 살펴본 결과 [Fig. 7]에서 볼 수 있는 바와 같이 혈청 내 Anti-OVA IgE는 대조군은 161.0 ± 6.2%, 실험군인 OVA-CML은 133.8 ± 8.4%로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(p<0.05).
- 본 연구에서 CML을 흡입시킨 BALB/C Mice의 백혈구의 수치를 알아본 결과 [Fig. 3]에서 볼 수 있는 바와 같이 실험군인 OVA-CML은 5.2 ± 0.4, 대조군은 6.93 ±0.6으로 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 나타났다(p<0.05).
- 본 연구에서 CML을 흡입시킨 BALB/C Mice의 호염기구 빈도를 알아본 결과 [Fig. 5]에서 볼 수 있는 바와 같이 대조군은 3.8 ± 0.5, 실험군인 OVA-CML은 1.48 ±0.45로 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소함을 보여주었는데(p<0.01) 이 결과를 천식의 악화가 순환계 내의 호염기구, 호산구의 수적 증가와 연관이 있고 호염기구의 수적 증가가 알레르기 천식개체의 혈액 내에서 확인된 바 있음을 보고한 김현희(2002)의 연구보고[12]와 관련지어 볼 때 CML을 흡입한 실험군에서 호염기구와 호산구의 빈도 감소는 천식의 알레르기 반응을 억제하는 결과로 천식의 호전에 도움이 될 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 CML을 흡입시킨 BALB/C Mice의 히스타민 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 [Fig. 6]에서 볼 수 있는 바와 같이 대조군은 188.8 ± 19.8에 비하여 실험군인 OVA-CML은 140.4 ± 12.8로 대조군에 비하여 유의성 있게 생성량이 감소하였음을 보여주었다(p<0.05).
- M&T염색에서는 대조군에 비하여 양성대조군과 실험군에서 조직손상의 감소가 확인되었다. 양성대조군의 기도저항 수치는 대조군에 비하여 현저하게 억제되었으며, 대조군에 비하여 실험군에서 기도저항 수치의 감소가 확인되었다 [Fig 8].
- 위의 결과는 OVA-CML이 백혈구 수치 감소에 효과가 있음을 나타낸 것으로 추정되며 백혈구의 감소는 항염증 작용에 효과가 있을 것으로 사료된다[Fig. 3].
- 05). 이 결과는 CML이 알레르기 반응에 주된 인자로 알려진 히스타민의 활성화 억제에 유의한 작용이 있음을 보여주는 것이다.
- 7]에서 볼 수 있는 바와 같이 항 Ige 항체를 처치한 천식 군에서 기관지 폐포 세척액내 총 염증 세포수중 특히 호산구 수가 감소하였고 항 IgE항체가 바만세포 활성화 억제와 호산구성 기관지 염증반응을 억제하여 항염증효과 및 기도과민반응성 호전효과가 있음을 제시한 홍태용(2009)의 연구결과와 부합된다. 이 결과로 볼 때 천식의 증상 완화는 IgE 수치 감소와 관련이 있고 CML이 천식 증상의 완화에 유의한 효과가 있음이 추정된다.
- 이 결과에서 항원 유발 후 염증반응에 의한 기도저항이 억제됨은 CML이 기도 평활근 증식을 억제하여 기도의 두께를 감소했을 가능성이 있고, 호산구나 비만세포와 같은 염증세포가 기관지로 유입되거나 침윤되는 작용을 억제했을 것으로 사료되므로 CML이 천식의 특징적 양상인 기도과민성 발생을 억제하였음을 알 수 있다. 특히 천식 환자에서의 기도과민성은 호산구성 기도염증과 밀접한 관계가 있다는 보고[2]가 본 연구의 [Fig.
- 이는 CML의 흡입이 각 염증 세포의 활성화를 저하시켰음을 보여주는 결과이며 이를 근거로 CML은 기관지 천식에 유의한 효과가 있을 것으로 판단된다. 본 연구자의 연구를 바탕으로 부작용이 적은 천연식물 오일의 약리학적 효능과 연구, 그리고 CML의 기관지 천식 억제 효과에 대한 보다 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 점액을 분비시키는 배상세포를 PAS로 염색하여 조직을 관찰한 결과 유의성 있는 감소를 보였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 알레르기성 염증으로 유발된 기관지 과민성이 대조군에 비해 CML 흡입군에서 효과적으로 억제되었고 혈액학적 검사 결과와 혈청 내 히스타민과 IgE 생성량에서 또한 유의한 수준의 감소가 있었다. 조직검사 결과 염증세포의 심한 침윤과 점액분비과다가 감소하였고 조직 손상 또한 감소됨을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 알레르기성 염증으로 유발된 기관지 과민성이 대조군에 비해 CML 흡입군에서 효과적으로 억제되었고 혈액학적 검사 결과와 혈청 내 히스타민과 IgE 생성량에서 또한 유의한 수준의 감소가 있었다. 조직검사 결과 염증세포의 심한 침윤과 점액분비과다가 감소하였고 조직 손상 또한 감소됨을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이는 CML의 흡입이 각 염증 세포의 활성화를 저하시켰음을 보여주는 결과이며 이를 근거로 CML은 기관지 천식에 유의한 효과가 있을 것으로 판단된다. 본 연구자의 연구를 바탕으로 부작용이 적은 천연식물 오일의 약리학적 효능과 연구, 그리고 CML의 기관지 천식 억제 효과에 대한 보다 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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