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문제 정의
- 다양한 질환의 원인인 산화적 스트레스 억제와 관련하여 약물의 우수한 항산화 효능은 신약개발에서 중요한 사항으로 고려되고 있다. 따라서 본 연구에서는 전탕팩의 보관 기간의 경과에 따른 항산화 효능을 측정하였다. ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성의 변화를 통해 항산화 효능을 비교한 결과, 제조 시점의 시료에 비해 보관 기간이 증가함에 따라 라디칼의 소거활성이 감소하여 3개월 시료의 경우 항산화 효능이 절반 이하로 감소하는 것으로 나타났다(Figs.
- 본 연구에서는 곽향정기산 전탕팩의 보관 및 유통기한 설정을 위한 과학적 근거를 제시하고자, 곽향정기산 전탕팩을 상온에서 0, 1, 2 및 3개월간 보관한 각각에 대한 약리 효능 변화를 측정하였다. 항염증 효능을 비교 평가한 결과, 상온에서 보관한 경우 2개월까지는 NO 생성 및 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-6 분비에 대한 항염증 효능에 유의적인 변화가 없었으나, 3개월 동안 보관한 경우 항염증 효능이 나타나지 않았다(Figs.
- 본 연구팀은 전탕팩 유통기간 설정을 위한 연구로서 평위산의 항염증 효능을 평가한 바 있다9). 실온에서 0, 6, 12개월 동안 보관한 평위산 전탕팩의 항염증 효능을 비교하였을 때, 6개월 보관 시료에서 이미 효능이 상실된 것을 확인하였다.
- 이에 본 연구에서는 곽향정기산 전탕팩의 보관기간 차이에 따른 약리 활성을 비교 평가함으로써 전탕팩 유통기한 설정을 위한 과학적 기초 자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- ABTS 라디칼 소거능은 Re의 방법을 변형하여 측정하였다18). ABTS(7 mM)와 potassium perulfate(2.
- 5105 cells/well씩 분주하여 18 시간 배양한 후 상온 보관 기간별 곽향정기산 전탕팩을 농도별로 처리하고 4시간 후 LPS(1 µg/mL)를 처리하여 20시간 동안 배양하였다. Griess reagent를 이용하여 제조사의 방법에 따라 배양 상등액 내에 존재하는 nitrite의 분비량을 측정하였으며, 양성 대조군으로 nitric oxide synthase(NOS) inhibitor인 l-NMMA(100 M)를 사용하였다. 상등액 내의 TNF-α 및 IL-6 분비량을 측정하기 위해 ELISA kit를 사용하여 각 제조사의 방법에 따라 측정하였다.
- 상온 보관기간별 곽향정기산 전탕팩과 희석한 ABTS+용액을 96 well plate에 가한 후 실온에서 30분 동안 반응시키고 microplate reader(Benchmark Plus, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 743 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 ABTS 라디칼의 소거 활성으로 나타내었으며 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다.
- Hercules, CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 DPPH 라디칼의 소거 활성으로 나타내었으며 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다.
- 곽향정기산 전탕팩 제조 시점의 동결건조 시료와 상온에서 1, 2, 3개월 동안 보관한 전탕팩의 동결건조 시료를 검체로 하여 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정함으로써 항산화 활성을 비교하였다. ABTS 라디칼의 소거 활성을 비교한 결과, 모든 검체에서 농도 의존적인 소거 활성이 나타났으나 0개월 시료에 비해 보관 기간이 증가함에 따라 소거 활성이 감소되었다.
- 곽향정기산 전탕팩에 대하여 3개월 동안 상온 보관 시 항염증 및 항산화 활성을 평가함으로써 유통기한을 예측하였다. 그 결과 곽향정기산 전탕팩을 상온에 보관한 경우 2개월 이내에 복용했을 때 약효의 손실이 없을 것으로 판단되었다.
- 곽향정기산 전탕팩의 상온 보관기간별 세포 독성을 알아보기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 3×103 cells/well씩 분주하여 18 시간 배양한 후, 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 곽향정기산 전탕팩의 상온 보관기간별 항염증 효능을 비교 평가하기 위하여 LPS로 자극시킨 RAW 264.7 세포에서 각 보관기간별 전탕팩 추출물의 NO, TNF-α 및 IL-6 생성 억제 효과를 검색하였다(Figs. 1-3).
- 곽향정기산의 구성약재는 광명당제약(Ulsan, Korea)을 통해 구입하여 각각 전문가 감별 후 사용하였으며(Table 1), 구성 약재의 표본(2013-KE32-1~13)은 한국한의학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다. 배합한 약재 무게(676 g)의 약 10배에 해당하는 전탕수(7 L)를 가한 뒤, 초고속 진공 저온 농축 추출기(Cosmos 660, Kyungseo machine, Korea)를 이용하여 100℃에서 가압하여 2시간 동안 전탕하였다. 전탕액은 3개의 lot로 나누어 전탕하였으며, 전탕액을 자유조절 롤 포장기(MH 205 Tower, Kyungseo machine, Incheon, Korea)를 통해 레트로트 파우치로 포장하였다.
- 상등액 내의 TNF-α 및 IL-6 분비량을 측정하기 위해 ELISA kit를 사용하여 각 제조사의 방법에 따라 측정하였다.
- 배합한 약재 무게(676 g)의 약 10배에 해당하는 전탕수(7 L)를 가한 뒤, 초고속 진공 저온 농축 추출기(Cosmos 660, Kyungseo machine, Korea)를 이용하여 100℃에서 가압하여 2시간 동안 전탕하였다. 전탕액은 3개의 lot로 나누어 전탕하였으며, 전탕액을 자유조절 롤 포장기(MH 205 Tower, Kyungseo machine, Incheon, Korea)를 통해 레트로트 파우치로 포장하였다. 파우치는 8~11월에 실내(온도 25℃, 습도 40~60%)에서 보관하면서 0, 1, 2 및 3개월차에 개봉하여, 감압 건조하여 분말화하였다.
- 이후 CCK-8 용액을 10 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양하고 microplate reader(Benchmark Plus, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 대조군과 비교하여 상대적인 세포생존율(% of control)을 계산하였으며, 이후의 실험은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 진행하였다.
- 전탕액은 3개의 lot로 나누어 전탕하였으며, 전탕액을 자유조절 롤 포장기(MH 205 Tower, Kyungseo machine, Incheon, Korea)를 통해 레트로트 파우치로 포장하였다. 파우치는 8~11월에 실내(온도 25℃, 습도 40~60%)에서 보관하면서 0, 1, 2 및 3개월차에 개봉하여, 감압 건조하여 분말화하였다. 최종 수득율은 20 ± 3%로 나타났으며, 효능 분석에는 감압건조된 검체분말 100 mg을 PBS 1 mL에 용해시킨 뒤 0.
대상 데이터
- Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 Dojindo(Kumamoto, Japan) 제품, Griess reagent는 Promega Corporation (Madison, WI, USA) 제품, TNF-α 및 interleukin(IL)-6 ELISA kit은 Invitrogen Co.(Camarillo, CA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
- Mouse macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 분양 받아 사용하였으며, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 penicillin(100 U/mL)과 streptomycin(100 µg/mL)을 첨가하여 37C 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 곽향정기산의 구성약재는 광명당제약(Ulsan, Korea)을 통해 구입하여 각각 전문가 감별 후 사용하였으며(Table 1), 구성 약재의 표본(2013-KE32-1~13)은 한국한의학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다. 배합한 약재 무게(676 g)의 약 10배에 해당하는 전탕수(7 L)를 가한 뒤, 초고속 진공 저온 농축 추출기(Cosmos 660, Kyungseo machine, Korea)를 이용하여 100℃에서 가압하여 2시간 동안 전탕하였다.
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계학적 유의성은 ANOVA 검정을 적용하였으며, Dunnet's multiple comparison test를 이용하여 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 곽향정기산 전탕팩 제조 시점의 동결건조 시료와 상온에서 1, 2, 3개월 동안 보관한 전탕팩의 동결건조 시료를 검체로 하여 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정함으로써 항산화 활성을 비교하였다. ABTS 라디칼의 소거 활성을 비교한 결과, 모든 검체에서 농도 의존적인 소거 활성이 나타났으나 0개월 시료에 비해 보관 기간이 증가함에 따라 소거 활성이 감소되었다. 대조군의 흡광도를 1/2로 환원시키는 데 필요한 시료의 농도인 RC50 값은 각각 보관 0개월; 66.
- 따라서 본 연구에서는 전탕팩의 보관 기간의 경과에 따른 항산화 효능을 측정하였다. ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성의 변화를 통해 항산화 효능을 비교한 결과, 제조 시점의 시료에 비해 보관 기간이 증가함에 따라 라디칼의 소거활성이 감소하여 3개월 시료의 경우 항산화 효능이 절반 이하로 감소하는 것으로 나타났다(Figs. 4-5). 이러한 결과는 항염증 효능 연구 결과와 함께, 상온에서 2개월 동안은 전탕팩이 안정하게 유지되지만, 상온에서의 보관 기간이 3개월 이상 경과하면 약효의 손실이 생길 수 있음을 의미한다.
- TNF-α 및 IL-6 생성 또한 LPS 처리에 의해 유의적으로 증가하였으며(p<0.01), 곽향정기산 전탕팩을 상온에 보관한 경우 2개월까지 62.5 µg/mL 이상의 농도에서 TNF-α 및 IL-6 생성을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다.
- 곽향정기산 전탕팩에 대하여 3개월 동안 상온 보관 시 항염증 및 항산화 활성을 평가함으로써 유통기한을 예측하였다. 그 결과 곽향정기산 전탕팩을 상온에 보관한 경우 2개월 이내에 복용했을 때 약효의 손실이 없을 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 곽향정기산 전탕팩의 유통기한 설정을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 대조군과 비교하여 LPS 처리군은 NO 생성이 유의적으로 증가한 반면(p<0.01), 양성 대조군으로 사용한 l-NMMA 처리군은 LPS에 의한 NO 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다(p<0.01).
- 대조군의 흡광도를 1/2로 환원시키는 데 필요한 시료의 농도인 RC50 값은 각각 보관 0개월; 66.96, 1개월; 99.65, 2개월; 95.90, 3개월; 143.58 µg/mL로, 3개월 시료의 ABTS 라디칼 소거 활성이 제조 시점에 비해 2배 이상 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 보관기간에 따라 0, 1, 2개월 곽향정기산의 DPPH 라디칼에 대한 RC50 값은 각각 145.85, 268.55, 302.46 µg/mL로 측정되었으며, 3개월 보관시료의 경우 실험 최고 농도인 400 µg/mL에서 40.33%의 라디칼 소거 활성을 나타내었다(Fig. 5).
- . 실온에서 0, 6, 12개월 동안 보관한 평위산 전탕팩의 항염증 효능을 비교하였을 때, 6개월 보관 시료에서 이미 효능이 상실된 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과에 근거하여 본 연구에서는 시료를 보다 단기간으로 보관하여 실험하였으며, 그 결과 2개월과 3개월 동안 보관한 전탕팩의 항염증 효능 차이를 확인할 수 있었다.
- 실온에서 0, 6, 12개월 동안 보관한 평위산 전탕팩의 항염증 효능을 비교하였을 때, 6개월 보관 시료에서 이미 효능이 상실된 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과에 근거하여 본 연구에서는 시료를 보다 단기간으로 보관하여 실험하였으며, 그 결과 2개월과 3개월 동안 보관한 전탕팩의 항염증 효능 차이를 확인할 수 있었다. 또한 이전의 연구는 동물 모델을 사용함으로써 in vitro 실험에서 제한된 요소를 보완하였다는 장점이 있지만, 평가 항목이 한 가지였던 단점이 있다.
- 항염증 효능을 비교 평가한 결과, 상온에서 보관한 경우 2개월까지는 NO 생성 및 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-6 분비에 대한 항염증 효능에 유의적인 변화가 없었으나, 3개월 동안 보관한 경우 항염증 효능이 나타나지 않았다(Figs. 1-3).
후속연구
- 본 연구를 비롯한 이전 연구에서 제시하는 보관 기간에 대한 자료는 한약 처방의 종류 및 연구 방법에 따라 상이함을 알 수 있다. 따라서 보다 정확한 유통기한 설정을 위해서는 좀 더 다양한 종류의 한약 처방에 대한 연구 및 평가 방법의 확립이 필요할 것이다. 또한 보관 방법의 경우의 수를 다양화하여 효능의 변화를 관찰하고, 나아가 이에 따른 주요 성분의 변화 및 한의서에 근거한 한약 처방의 약리학적 효능 비교 연구가 병행되어야 할 것이다.
- 따라서 보다 정확한 유통기한 설정을 위해서는 좀 더 다양한 종류의 한약 처방에 대한 연구 및 평가 방법의 확립이 필요할 것이다. 또한 보관 방법의 경우의 수를 다양화하여 효능의 변화를 관찰하고, 나아가 이에 따른 주요 성분의 변화 및 한의서에 근거한 한약 처방의 약리학적 효능 비교 연구가 병행되어야 할 것이다.
- 그 결과 곽향정기산 전탕팩을 상온에 보관한 경우 2개월 이내에 복용했을 때 약효의 손실이 없을 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 곽향정기산 전탕팩의 유통기한 설정을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 이전의 연구는 동물 모델을 사용함으로써 in vitro 실험에서 제한된 요소를 보완하였다는 장점이 있지만, 평가 항목이 한 가지였던 단점이 있다. 이를 보완하기 위하여 본 연구에서는 항염증 효능 평가 항목으로 세 가지의 염증 관련 인자들을 확인하여 결과의 신뢰도를 높이고자 하였으며, 이 결과를 토대로 향후 동물 모델을 이용한 검증이 필요할 것으로 사료된다. 길 등의 연구에서는 연교 패독산 전탕팩의 항염 및 항균 활성 평가를 통하여, 냉장에서의 보관 기간을 9일로 설정하였다10).
- 길 등의 연구에서는 연교 패독산 전탕팩의 항염 및 항균 활성 평가를 통하여, 냉장에서의 보관 기간을 9일로 설정하였다10). 이와 같은 결과는 향후 한약 전탕팩 보관 기간의 연구 시, 상온에서의 보관뿐만 아니라 냉장 또는 냉동 보관 등에 대한 부분이 추가 되어야 할 것이며, 처방의 종류에 따라 평가 기간도 개별적으로 설정되어야 할 것임을 제시한다.
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