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문제 정의
- 그러나, jaceosidin이 제1형 당뇨시 혈당조절이나 그 기전에 미치는 영향에 대한 연구는 전무하므로, 본 연구에서는 jaceosidin 섭취가 당뇨 시 당 대사와 항산화능에 미치는 영향을 규명하고, 그 기전을 밝힘으로써 당뇨병 및 당뇨 합병증의 예방·치료에 효과적인 천연 식품 소재로서 jaceosidin의 기능성을 밝히고자 한다.
- 본 연구는 약쑥의 기능성 성분인 jaceosidin이 제 1형당뇨병에서 혈당과 체내 항산화 상태에 미치는 영향를 조사하고자 실시되었다. jaceosidin을 식이에 농도별(0.
가설 설정
- 1) Mean ± SEM Values not sharing the same letter were significantly different (p < 0.05).
제안 방법
- 표준용액 혹은 간 균질액에 1% 인산용액과 TBA용액을 혼합한 후 60분동안 끓였으며 n-butanol을 넣은 후 2000 rpm에서 15분 원심분리 하여 상층액을 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1,1,3,3,-tetraethoxypropane 농도에 따른 TBA값으로 표준곡선을 이용하여 각 시료의 지질 과산화물의 함량을 계산하였다.
- 여러 연구 결과에 의하면 항산화제를 섭취하거나 항산화효소의 발현을 증가시키게 되면 산화적 스트레스가 감소되어 췌장내 β세포의 사멸이 억제되거나, 간내 glucose transporter의 발현이 증가되어 혈당이 감소하고 산화적 스트레스를 저하시킨다고 보고되고 있다.31-33 따라서, jaceosidin에 의한 혈당 감소 효과가 산화적 스트레스를 억제함으로써 야기되는 것인지를 알아보기 위해 간 내 과산화지질의 농도와 항산화 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, 과산화지질의 농도에는 유의적인 차이가 없었으나, GSH-px의 활성이 D-Control에 비해 유의적으로 높아졌으며, catalase의 활성도 높아지는 경향을 보였다.
- p, 주사하여 당뇨를 유도하였다. 48시간 후 6시간 절식을 시킨 상태에서 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당을 측정 (Accu-CHEK, Roche, Germany)하였으며 혈당치가 200 mg/dl 이상인 실험동물을 3그룹 (당뇨 대조군 (D-Control), 0.005% jaceosidin 섭취군 (D-0.005%), 0.02% jaceosidin 섭취군 (D-0.02%))으로 나누어 각 그룹에 해당하는 실험 식이를 공급하였다. 체중과 식이 섭취량은 주 2회 측정하였으며, 실험기간동안의 총 체중 증가량을 동일 기간 동안의 총 식이섭취량으로 나누어 식이효율 (FER)을 계산하였다.
- formaldehyde standard와 시료에 assay buffer, methanol, hydrogen peroxide를 넣고 20분간 실온에서 방치 후 potassium hydroxide와 purpald를넣고 10분간 배양하고 potassium periodate를 넣어 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catalase 활성도 표준곡선을 이용하여 계산하였다. GSH-px는 10,000 × g에서 15분간 원심분리하여 얻어지는 간 균질액의 상층액을 assay buffer와 cosubstrate에 Cumene Hydroperoxide를 넣은 후 340nm에서 흡광도를 시간대 별로 찍어 각 시간에 따른 흡광도의 변화를 계산하여 GSH-px의 활성을 측정하였다.
- Catalase의 활성은 간 균질액을 10,000 × g에서 15분간 원심분리 한 뒤 얻어지는 상층액을 이용하여 실험하였다.
- GSH-px는 10,000 × g에서 15분간 원심분리 하여 얻어지는 간 균질액의 상층액을 assay buffer와 cosubstrate에 Cumene Hydroperoxide를 넣은 후 340nm에서 흡광도를 시간대 별로 찍어 각 시간에 따른 흡광도의 변화를 계산하여 GSH-px의 활성을 측정하였다.
- 간내 항산화 효소의 활성을 측정하기 위하여 간 조직을 균질화한후, superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (GSH-px) 활성을 kit (Cayman, CA, USA)을이용하여 측정하였다. SOD는 간균질액을 1.
- 실험식이를 공급한 후 1주일 간격으로 꼬리정맥으로부터 채혈하여 공복혈당을 측정하여 혈당 변화를 측정하였다. 경구 당부하검사는 실험사육 7주경에 6시간을 절식시킨 다음 공복혈당을 측정하였으며, 이후 glucose (2 mg/Kg body weight)를 경구 투여하고 15, 30, 60, 120분 후에 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당을 측정하였다.
- 02%)로 혼합시켜 준비하였으며, 실험 동물은 C57BL/6J 5주령 수컷 마우스를 사용하여 정상군(Normal)과 당뇨군으로 나눈 뒤 당뇨군의 마우스는 5일간 streptozotocin (55 mg/kg bw)을 복강으로 주사하여 당뇨를 유발하였다. 당뇨군은 당뇨대조군(D-Control), jaceosidin 0.005% 섭취군 (D-0.005%), jaceosidin 0.02% 섭취군(D-0.02%)으로 나누어 사육하였다. 8주간의 식이 섭취 결과, 당뇨군의 체중이 Normal과 비교하여유의적으로 감소되었고, 식이효율은 유의적으로 낮아졌으며, jaceosidin의 섭취는 당뇨로 인한 체중 및 식이효율 저하에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 실험 식 이는 AIN-93 purified rodent diet base를 기초로 하였으며, jaceosidin은 각각 0.005%, 0.02%를 첨가하여 pellet 형태로제조 ((주)유니페이스, Seoul, Korea)한후 4°C에서 냉장 보관하였다.
- 실험식이를 공급한 후 1주일 간격으로 꼬리정맥으로부터 채혈하여 공복혈당을 측정하여 혈당 변화를 측정하였다. 경구 당부하검사는 실험사육 7주경에 6시간을 절식시킨 다음 공복혈당을 측정하였으며, 이후 glucose (2 mg/Kg body weight)를 경구 투여하고 15, 30, 60, 120분 후에 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당을 측정하였다.
- 인슐린 내성 검사는 실험 사육 8주 경에 6시간 절식시켜 공복 혈당을 측정한 뒤 insulin (0.75 U/kg body weight)을 i.p. 주사하여 15, 30, 60, 120분 후에 혈당의 변화를 측정하였다.
- 제1형 당뇨병에서 jaceosidin의 섭취가 공복혈당, 내당능 및 인슐린 내성에 미치는 영향을 알아보기 위해 공복 혈당과 당부하 검사, 인슐린 내성을 측정하였다 (Fig. 1). 공복혈당의 경우 당뇨군의 혈당이 Normal군에 비해 유의적으로 높았으며, jaceosidin을섭취시킨 군이 D-Control에 비해 감소하는 경향을 보였다.
- 02%))으로 나누어 각 그룹에 해당하는 실험 식이를 공급하였다. 체중과 식이 섭취량은 주 2회 측정하였으며, 실험기간동안의 총 체중 증가량을 동일 기간 동안의 총 식이섭취량으로 나누어 식이효율 (FER)을 계산하였다.
- 500 × g에서 5분간 원심분리 한 뒤 상층액을 radical detector에 넣은 후 zanthine oxide를 넣어 440~460 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액의 흡광도로 표준곡선을 그린 뒤 각 시료의 SOD 활성을 계산하였다. Catalase의 활성은 간 균질액을 10,000 × g에서 15분간 원심분리 한 뒤 얻어지는 상층액을 이용하여 실험하였다.
- 희생하기 전 12시간 공복시킨 실험동물을 에테르로 마취한 후 헤파린을 첨가한 주사기를 이용하여 심장에서 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 원심분리 (1,000 rpm, 20 min)하여 혈장을 분리하고, 분석전까지 -80℃에 냉동 보관하였다.
대상 데이터
- 본 연구는 약쑥의 기능성 성분인 jaceosidin이 제 1형당뇨병에서 혈당과 체내 항산화 상태에 미치는 영향를 조사하고자 실시되었다. jaceosidin을 식이에 농도별(0.005%, 0.02%)로 혼합시켜 준비하였으며, 실험 동물은 C57BL/6J 5주령 수컷 마우스를 사용하여 정상군(Normal)과 당뇨군으로 나눈 뒤 당뇨군의 마우스는 5일간 streptozotocin (55 mg/kg bw)을 복강으로 주사하여 당뇨를 유발하였다. 당뇨군은 당뇨대조군(D-Control), jaceosidin 0.
- 동물은 중앙대학교 내 청정동물연구센터에서 사육되었으며, 동물실험실은 온도 22±1°C, 습도 50 ± 1%를 유지하였고 12시간 간격으로 점등과 소등을 반복하였다.
- 중앙실험동물에서 5주령 된 수컷 C57BL/J mice를 구입하여 일주일간 안정화 시킨 후, 정상군 (Normal)을 제외한 mice에 5일간 streptozotocin (55 mg/kg body weight)을 i.p, 주사하여 당뇨를 유도하였다. 48시간 후 6시간 절식을 시킨 상태에서 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당을 측정 (Accu-CHEK, Roche, Germany)하였으며 혈당치가 200 mg/dl 이상인 실험동물을 3그룹 (당뇨 대조군 (D-Control), 0.
데이터처리
- 각 실험군에 대한 유의차 검정은 SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 일원분산분석(ANOVA)을 실시한 후, p<0.05 수준에서 Tukey’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다.
- 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었다.
이론/모형
- 간 기능 지표인 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)와 glutamic pyruvic transaminase (GPT)의 활성은 kit (Asan Chemical, Seoul, Korea)을 이용하여 제시된 실험방법에 따라 측정하였다.
성능/효과
- 10-12 과도한 산화적 스트레스는 알도스환원효소와 hexosamine 경로의 활성을 증가시키고, 포도당 자기 산화 반응을 유발하여 최종당화산물 (advanced glycation endproducts; AGEs)의 형성을증가시킬뿐아니라5-8 세포내의 지질과산화물의 생성을 증가시켜 당뇨병 증상을 악화시키고 여러 합병증을 유발하는 것으로 알려졌다.
- 당뇨군에서는 Jaceosidin의 섭취 유무에 따라 체중의 차이가 없는 것으로 나타났으나, jaceosidin을 섭취한 군의 체중이 D-Control보다 다소 높은 경향을 보였다. 8주간 체중 증가량을 측정한 결과 Normal은 2.2 g의 체중이 증가하였으나, 당뇨군의 경우 체중이 감소하는 것으로 나타났으며, D-0.02%의 경우 Normal군보다 체중이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 식이 섭취량의 경우, Normal의 섭취량이 당뇨군에 비해 유의적으로 적은 것으로 나타났으며, 당뇨군 중에서는 D-Control의 섭취량이 D-0.
- 02%)으로 나누어 사육하였다. 8주간의 식이 섭취 결과, 당뇨군의 체중이 Normal과 비교하여유의적으로 감소되었고, 식이효율은 유의적으로 낮아졌으며, jaceosidin의 섭취는 당뇨로 인한 체중 및 식이효율 저하에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 제1형당뇨시 jaceosidin의 섭취가 장기 무게와 간기능에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으나, 공복 혈당은 D0.
- Jaceosidin 의 섭취 여부에 따른 내당능을 측정한 결과 유의적인 차이를 보이지 않았으나 인슐린에 대한 민감성을 측정하는 ITT 실험 결과에서는 0.02% Jaceosidin을 섭취한 군의 AUC (곡면하면적)가 감소하는 것으로 나타나 인슐린 민감도가 당뇨 대조군에 비해 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 쑥 추출물의 섭취가 인슐린 저항성을 낮춰 당뇨증상을 완화시켰다는 연구결과38와 유사한 경향을 보였다.
- Jaceosidin의 섭취가 간 기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈장 GOT, GPT 활성을측정한 결과 (Table 4), GOT와 GPT의 활성은 그룹 간에 유의한 차이가 없었으나 Normal 군이 활성이 당뇨군에 비해 낮게 나타났으며, jaceosidin 섭취는 간 기능에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
- 02%가 당뇨 대조군보다 AUC값이 감소하는 경향을 보였다. Jaceosidin의 섭취가 당뇨병로 인한 산화적 스트레스에 미치는 영향을 측정한 결과, jaceosidin의 섭취가 과산화지질 생성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으나, 항산화 효소인 GSH-px의 활성은 D-Control과 비교하여 유의적으로 증가시켰다. 이상의 결과로 미루어 볼 때, jaceosidin 은 제1형 당뇨병 시간의 항산화 효소계를 활성화 시킴으로써 공복혈당을 낮추고, 인슐린민감성을 증가시키는 것으로 생각되는 바 당뇨병이나 당뇨로 인한 합병증 예방 및 치료에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- Jaceosidin 섭취가 당뇨병으로 인해 야기되는 산화적 스트레스와 항산화 체계에 미치는 영향을 측정한 결과는 Table 5와 같다. Jaceosidin의 섭취가 당뇨병으로 인한 산화적 스트레스에 미치는 영향을 간내 과산화 지질 함량으로 측정한 결과 모든 군에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 항산화 효소 활성의 경우, Normal군의 활성이 DControl보다 높게 나타났다.
- Jaceosidin의 섭취에 따른 인슐린 저항성을 측정한 결과 (Fig. 1D, 1E), Normal군의 경우 혈당이 서서히 감소하여 60분에 가장 최저치를 보였고, 그 이후 서서히 증가되었다. 당뇨군의 경우 인슐린 처치 15분 이후부터 혈당이 감소하기 시작하였으며, 120분까지 공복혈당보다 낮은 수준으로 혈당이 유지되었다.
- Jaceosidin의 항당뇨 효능을 제1형 당뇨 모델을 이용하여 측정한 결과, D-0.005%군의 공복 혈당이 D-Control에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며, D-0.02%군은 유의적인차이는 없었으나 D-Control에 비해 감소하는 경향을 보였다. 여러 연구 결과에 의하면 항산화제를 섭취하거나 항산화효소의 발현을 증가시키게 되면 산화적 스트레스가 감소되어 췌장내 β세포의 사멸이 억제되거나, 간내 glucose transporter의 발현이 증가되어 혈당이 감소하고 산화적 스트레스를 저하시킨다고 보고되고 있다.
- 1B와 1C에 제시되었다. Normal군의 공복혈당이 당뇨군보다 유의적으로 낮았으며, 당뇨군 간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한, 정상군의 경우 포도당을 경구 투여한 이후 15분경에 최대 혈당 수치를 보였으며, 이후 감소하여 120분 이후에는 공복혈당과 비슷한 수치가 되었다.
- STZ에 의해 유도된 당뇨군은 정상군과 비교하여 체중 및식이 효율이 낮았다. 이는 당뇨병으로 인해 체내 에너지 대사에 불균형이 초래됨으로써 발생한 것으로, 다량의 항산화성분을 섭취하게 되면 체중감소가 완화되고, 식이효율이 높아진다고 보고되고 있다.
- 1). 공복혈당의 경우 당뇨군의 혈당이 Normal군에 비해 유의적으로 높았으며, jaceosidin을섭취시킨 군이 D-Control에 비해 감소하는 경향을 보였다. 특히 D-0.
- 31-33 따라서, jaceosidin에 의한 혈당 감소 효과가 산화적 스트레스를 억제함으로써 야기되는 것인지를 알아보기 위해 간 내 과산화지질의 농도와 항산화 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, 과산화지질의 농도에는 유의적인 차이가 없었으나, GSH-px의 활성이 D-Control에 비해 유의적으로 높아졌으며, catalase의 활성도 높아지는 경향을 보였다. 따라서, jaceosidin의 섭취가 과산화지질의 생성을 억제하지는 못하였으나, jaceosidin 자체의 항산화력과 체내 항산화효소인 GSH-px의 활성을 증가시켜 산화적 스트레스를 억제함으로써 공복 혈당을 감소시킨 것으로 사료된다.
- 005%가 D-Control과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며, 농도의존적은 경향은 보이지 않았다. 당부하 검사에서는 당뇨군이 normal에 비해 혈당과 AUC 값이 유의적으로 높게 나타났으나, jaceosidin 섭취에 의한 차이는 없는 것으로 나타났으며, 인슐린 내성검사 결과에서는 D-0.02%가 당뇨 대조군보다 AUC값이 감소하는 경향을 보였다. Jaceosidin의 섭취가 당뇨병로 인한 산화적 스트레스에 미치는 영향을 측정한 결과, jaceosidin의 섭취가 과산화지질 생성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으나, 항산화 효소인 GSH-px의 활성은 D-Control과 비교하여 유의적으로 증가시켰다.
- 02%군의 활성이 D-Control과 비교하여 유의적으로 높게 나타났으며, Normal 군과는 차이를 보이지 않았다. 또한, catalase의 경우 jaceosidin을 섭취한 군의 활성이 DControl보다 높은 경향을 보였으나, 유의적인 차이는 없는 것으로나타났다.
- 항산화 효소 활성의 경우, Normal군의 활성이 DControl보다 높게 나타났다. 또한, 당뇨병으로 인해 낮아진 항산화 효소의 활성은 jaceosidin의 섭취에 의해 높아지는 경향을 보였다. GSH-px의 경우, D-0.
- 당뇨군의 경우 인슐린 처치 15분 이후부터 혈당이 감소하기 시작하였으며, 120분까지 공복혈당보다 낮은 수준으로 혈당이 유지되었다. 또한, 인슐린 저항성의 경우 jaceosidin 섭취군과 D-Control간에 유의적인 차이는 없었으나, D0.002%군의 인슐린 내성이 낮은 경향을 나타내었다.
- Jaceosidin의 섭취가 체중 및 식이효율에 영향을 미치는지 본 알아본 결과는 Table 2와 같다. 섭취 전 체중은 모든군에서 유의한 차이가 없었으나 실험 후 STZ로 당뇨병을 유도한 군의 체중이 Normal과 비교하여 유의하게 감소하였다. 당뇨군에서는 Jaceosidin의 섭취 유무에 따라 체중의 차이가 없는 것으로 나타났으나, jaceosidin을 섭취한 군의 체중이 D-Control보다 다소 높은 경향을 보였다.
- 02%의 경우 Normal군보다 체중이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 식이 섭취량의 경우, Normal의 섭취량이 당뇨군에 비해 유의적으로 적은 것으로 나타났으며, 당뇨군 중에서는 D-Control의 섭취량이 D-0.005%에 비해 유의적으로 많은 것으로 나타났다. 식이효율은 정상군이 당뇨군에 비해 유의적으로 높게 나타났으며, 당뇨군간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 005%에 비해 유의적으로 많은 것으로 나타났다. 식이효율은 정상군이 당뇨군에 비해 유의적으로 높게 나타났으며, 당뇨군간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 8주간의 식이 섭취 결과, 당뇨군의 체중이 Normal과 비교하여유의적으로 감소되었고, 식이효율은 유의적으로 낮아졌으며, jaceosidin의 섭취는 당뇨로 인한 체중 및 식이효율 저하에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 제1형당뇨시 jaceosidin의 섭취가 장기 무게와 간기능에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으나, 공복 혈당은 D0.005%가 D-Control과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며, 농도의존적은 경향은 보이지 않았다. 당부하 검사에서는 당뇨군이 normal에 비해 혈당과 AUC 값이 유의적으로 높게 나타났으나, jaceosidin 섭취에 의한 차이는 없는 것으로 나타났으며, 인슐린 내성검사 결과에서는 D-0.
후속연구
- 결론적으로 jaceosidin 섭취는 STZ로 유도한 당뇨병 모델의 공복혈당을 감소시키고, 체내 항산화 효소인 GSHpx의 활성을 높여주며, 인슐린 민감성을 증가시키는 효과가 있어 제1형 당뇨병을 억제하거나 당뇨병으로 인한 합병증을 예방할 수 있을 것으로 생각되며, 항당뇨 기전이나 당뇨 합병증에 대한 연구 및 임상 연구 등의 후속연구가 이루어진다면 항당뇨 기능성 성분으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 02%보다 다량의 성분을 섭취시켰다. 따라서, 소량의 섭취만으로 공복 혈당을 감소시킬 뿐 아니라 항산화 효소의 활성을 증가시키는 jaceosidin이 당뇨병을 예방하고 억제하는데 더욱 효과적으로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 jaceosidin의 섭취가 인슐린 결핍으로 인해 발생하는 제1형 당뇨병에 미치는 영향을 연구함에 있어 인슐린의 민감도를 측정하였을 뿐 혈중 인슐린 농도나 분비능을 측정하지 못한 한계점이 있으므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- Jaceosidin의 섭취가 당뇨병로 인한 산화적 스트레스에 미치는 영향을 측정한 결과, jaceosidin의 섭취가 과산화지질 생성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으나, 항산화 효소인 GSH-px의 활성은 D-Control과 비교하여 유의적으로 증가시켰다. 이상의 결과로 미루어 볼 때, jaceosidin 은 제1형 당뇨병 시간의 항산화 효소계를 활성화 시킴으로써 공복혈당을 낮추고, 인슐린민감성을 증가시키는 것으로 생각되는 바 당뇨병이나 당뇨로 인한 합병증 예방 및 치료에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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