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문제 정의
- T-임파구는 관절염을 악화하므로 CH-Ex의 T-임파구 증식에 대해 조사하였다. 증식이 억제되면 이 또한 작용 기전으로 간주할 수 있기 때문이다.
- albicans로 기인하는 감염성 관절염에 대한 효과는 아직 보고된 적이 없다. 이에, 본 연구에서는 카모마일 꽃봉오리(Chamomillae Flos; Chamomile flowers)의 추출물의 항관절염 효과를 조사하였다. 본 연구에서 사용한 관절염 동물모델은 기연구결과의 발표를 통해서 검증된 것이다.
제안 방법
- 1 ml 광유(mineral oil) 와 동일부피의 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline solution; Sigma)에 용해한 C. albicans cell wall(CACW; 1 mg)을 혼합하여 sonicator로 유화시킨 후, syringe를 이용하여 50 µl/ mouse 용량으로 생쥐의 발바닥 피하에 주사하였다.
- 18,19,29) 생쥐에서 적출한 비장(spleen)에서 splenocyte를 분리 하여 RPMI 1640 배지에 넣고 35℃-CO2 배양기에서 24시간 배양한 후, 이 splenocyte(5×106 cells/well)에 concanavalin A(5µg/ml; Sigma)를 투여하고 다양한 농도(5~80 µM)의 CH-Ex를 첨가하였다.
- 18,19,29) 생쥐에서 적출한 비장(spleen)에서 splenocyte를 분리 하여 RPMI 1640 배지에 넣고 35℃-CO2 배양기에서 24시간 배양한 후, 이 splenocyte(5×106 cells/well)에 concanavalin A(5µg/ml; Sigma)를 투여하고 다양한 농도(5~80 µM)의 CH-Ex를 첨가하였다. 72시간 배양한 다음에 CCK-8(Cell Count Kit-8)을 투여하고 3시간 추가 배양 후 T-임파구의 증식 억제효과를 검색하였다.
- C. albians의 세포벽 분리는 본 연구실에서 개발한 방법을 사용하였다.26-28) 이 방법을 간략히 기술하면 다음과 같다.
- CH-Ex의 항관절염 작용기전을 조사하기 위해 LPS로 활성화된 macrophage에서 분비되는 NO(nitric oxide) 생성에 대한 억제효과를 측정하였다. 그 결과, CH-Ex로 처리한 macrophage에서의 NO 생성량은 LPS 만으로 처리한 macrophage와 비교해서 농도 의존적으로 감소되었다(Fig.
- 26-28) 이 방법을 간략히 기술하면 다음과 같다. GYEP(glucose-yeast extract peptone) 액체배지에 배양한 C. albicans 균을 수집하여 disodium EDTA와 trisodium EDTA으로 연속 처리하고, 2-mercaptoethanol로 처리한 후 상등액을 수집하여 투석막(membrane cut-off=12,000 Da)에 넣고 멸균된 탈 이온수를 투석액으로 하여 3일간 투석하였다. 투석이 완료된 후 투석막 내부물질을 동결 건조하여 분말화 하였다.
- 각 그룹은 생쥐 5마리씩으로 구성하였으며, 부종 억제정도는 [(대조군의 일정시간 후의 평균 부종율−약물투여군의 일정시간후의 평균 부종율)/대조군의 일정시간 후의 평균부종율]×100으로 계산하여 부종 억제율(%)로 환산하였다.
- 23-25) 그러므로 CD4+ T 임파구의 증식을 억제하는 인자는 관절염을 조절할 수 있을 것으로 간주된다. 끝으로, 본 연구에서 사용한 카모마일 추출물에 함유된 페놀성 성분의 종류들을 분석하여 항관절염 효과에 관련된 페놀성 화합물의 연관성을 아울러 평가하였다.
- 20,23) 그러므로 CH-Ex가 염증 부위에 유입된 macrophage 에서 NO 생성의 억제 효과가 있다는 것은 매우 중요한 작용 기전으로 간주된다. 두 번째 작용 기전 검색으로, CH-Ex 추출물은 T-임파구의 증식을 억제함을 규명하였다. 이는 관절염유발에 관여하는 CD4+T 임파구 제거를 위해 단항체요법(anti-CD4 Tlymphocyte monoclonal antibody)이 관절염 치료제로 작용하는 것과 일맥상통하다고 사료된다.
- 본 연구실의 기 실험에 고안한 방법17-19)을 사용하여 CH-Ex 의 NO 생성 억제여부를 검색하였다. 즉, RPMI 1640 배지(Sigma)에 배양한 RAW264.
- 본 연구실의 기 연구에서 정립된 관절염 동물모델17-19)을 사용하여 카모마일 추출물(CH-Ex)의 항관절염 효과를 검색하였다. 실험방법을 간략히 기술하면 다음과 같다.
- albicans 기인성 관절염 동물모델17-19)을 사용하여 그 효능을 조사하였다. 아울러 항염증 작용기전도 검색하였다. 작용기전 검색을 위해서 NO(nitric oxide) 생성억제 효과와 CD4+T 임파구 증식억제 여부를 조사하였다.
- 양성대조군 생쥐에는 Indomethacin(60 µg/mouse)을 투여하였다.
- 이 효과 측정을 위해 기 실험에서 고안한 방법을 사용하였다.18,19,29) 생쥐에서 적출한 비장(spleen)에서 splenocyte를 분리 하여 RPMI 1640 배지에 넣고 35℃-CO2 배양기에서 24시간 배양한 후, 이 splenocyte(5×106 cells/well)에 concanavalin A(5µg/ml; Sigma)를 투여하고 다양한 농도(5~80 µM)의 CH-Ex를 첨가하였다.
- albicans cell wall(CACW; 1 mg)을 혼합하여 sonicator로 유화시킨 후, syringe를 이용하여 50 µl/ mouse 용량으로 생쥐의 발바닥 피하에 주사하였다. 이틀 후 족부종이 발생한 생쥐에 CH-Ex를 1회 1 mg/mouse 농도로, 3일에 한번씩 3회(Day 3, 6, 9) 복강 내 투여하였다. 양성대조군 생쥐에는 Indomethacin(60 µg/mouse)을 투여하였다.
- 아울러 항염증 작용기전도 검색하였다. 작용기전 검색을 위해서 NO(nitric oxide) 생성억제 효과와 CD4+T 임파구 증식억제 여부를 조사하였다. 이 연구 주제의 선택 이유는 다음과 같다.
- 양성대조군 생쥐에는 Indomethacin(60 µg/mouse)을 투여하였다. 족부종의 생성 정도는 지정한 날짜에 dial calipers(Mitatoyo Co., IL, USA)를 사용하여 측정하였다. 각 그룹은 생쥐 5마리씩으로 구성하였으며, 부종 억제정도는 [(대조군의 일정시간 후의 평균 부종율−약물투여군의 일정시간후의 평균 부종율)/대조군의 일정시간 후의 평균부종율]×100으로 계산하여 부종 억제율(%)로 환산하였다.
- 을 사용하여 CH-Ex 의 NO 생성 억제여부를 검색하였다. 즉, RPMI 1640 배지(Sigma)에 배양한 RAW264.7 monocyte/macrophage cell line을 LPS로 처리한 후, 다양한 농도의 CH-Ex로 처리하고 Griess 시약을 사용하여 NO 생성억제 유무를 조사하였다. 대조군으로 LPS(Lipopolysaccharide; Sigma)만으로 처리한 RAW264.
- albicans 균을 수집하여 disodium EDTA와 trisodium EDTA으로 연속 처리하고, 2-mercaptoethanol로 처리한 후 상등액을 수집하여 투석막(membrane cut-off=12,000 Da)에 넣고 멸균된 탈 이온수를 투석액으로 하여 3일간 투석하였다. 투석이 완료된 후 투석막 내부물질을 동결 건조하여 분말화 하였다. 추출한 세포벽은 desiccator안에 저장·보관하였다.
대상 데이터
- 10 gram의 카모마일 꽃봉오리(Chamomillae Flos, Chamomile flowers)를 100% 증류수(100 ml)에 시킨 후 열수 추출방법을 통해서 60분씩 3회 추출 후 건조한 다음에 본 실험에 사용하였다. 본 추출물에 함유한 페놀성 성분의 종류를 확인하기 위해 HPLC 방법으로 분석하였다.
- 6~7주령의 BALB/c 암컷생쥐(Charles River Lab, NY, USA)를 사용하였고 멸균된 사료(Central Lab, Animal Inc. Seoul, Korea) 및 물을 제공하였으며, 실험동물이 이를 자유롭게 먹도록 하였다. 이들 생쥐는 동물실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- Thickness of the edema was measured by a dial gauger in arbitrary unit (AU). Each group contained five mice. Bar indicates SE.
- 7 monocyte/macrophage cell line을 LPS로 처리한 후, 다양한 농도의 CH-Ex로 처리하고 Griess 시약을 사용하여 NO 생성억제 유무를 조사하였다. 대조군으로 LPS(Lipopolysaccharide; Sigma)만으로 처리한 RAW264.7 macrophage를 사용하였다.
- Seoul, Korea) 및 물을 제공하였으며, 실험동물이 이를 자유롭게 먹도록 하였다. 이들 생쥐는 동물실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물관리는 동덕여자대학교 동물관리규정과 동물사용윤리위원회 승인[IRB: 동덕동물201403-02]에 따라 동물을 관리 및 사용하였다.
- 7) 그러므로 부작용이 적고 효과가 높은 새로운 항 관절염 약물의 발견이 필요하다. 이런 관점에서 본 연구실에서는 문헌조사와 기초 탐색연구를 통해서 German chamomile(Matricaria chamomilla, a family of Compositae)을 선정하였다.
- 분석결과는 각 표준품을 상기 동일한 방법으로 용출한 결과(retention time)과 비교하여 동정하였다. 적용한 표준품으로는 chlorogenic acid, ferulic acid, luteolin-5-O-glucoside, rutin, hyperoside, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, apigenin를 사용하였다.
데이터처리
- 각 군간의 유의성 검증은 Student's t-test를 사용하였고 P<0.05 일 때에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 8 ml/min으로 조절하여 용출액을 파장(340 nm)하에서 측정하였다. 분석결과는 각 표준품을 상기 동일한 방법으로 용출한 결과(retention time)과 비교하여 동정하였다. 적용한 표준품으로는 chlorogenic acid, ferulic acid, luteolin-5-O-glucoside, rutin, hyperoside, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, apigenin를 사용하였다.
- 실험결과는 평균±표준오차(Mean±S.E.)로 계산하였다.
이론/모형
- CH-Ex에 함유된 성분을 HPLC 방법으로 분석하였다. 시료 주입 후 생성된 피크는 80분 이내에 모두 유출되었다.
- 10 gram의 카모마일 꽃봉오리(Chamomillae Flos, Chamomile flowers)를 100% 증류수(100 ml)에 시킨 후 열수 추출방법을 통해서 60분씩 3회 추출 후 건조한 다음에 본 실험에 사용하였다. 본 추출물에 함유한 페놀성 성분의 종류를 확인하기 위해 HPLC 방법으로 분석하였다. 사용된 HPLC에서 이동상은 0.
- 이에, 카모마일 추출물의 항관절염 효과를 규명하기 위해 본 연구실에서 고안한 C. albicans 기인성 관절염 동물모델17-19)을 사용하여 그 효능을 조사하였다. 아울러 항염증 작용기전도 검색하였다.
성능/효과
- albicans 기인성 관절염은 최근에 증가하는 추세이다.2,3) 세균성 관절염 치료에는 항생제와 항류마티스 약물(예: DMARDs, Disease-Modifying AntiRheumatic Drugs)을 병용하며, 진균성 관절염은 Azole 계열 약물과 amphotericin B와 같은 polyene 계열의 항진균제를 단독 또는 병용한다.4) DMARDs는 항관절염 효과가 낮고 신독성과 간 독성의 부작용이 있으며 장기복용 시 약물에 대한 내성증가 및 기회감염의 증가 때문에 사용에 제한이 있다.
- T-임파구 증식을 촉진하는 concanavalin A(Con A)로 처리한 T-임파구에 CH-Ex를 첨가하여 증식억제 여부를 조사한 결과, 20 µg/ml와 40 µg/ml의 농도에서는 각각 56%와 78% 이상의 증식이 억제되었다(P<0.05)(Fig. 3).
- 이와 관련하여, 나머지 성분들의 본 감염성 관절염에 대한 효과 검색이 고려된다. 결론적으로, 본 연구를 통해서 카모마일 추출물이 Candida 감염성 관절염에 효능이 있고, 이 결과를 통해서 부작용이 심한 기존의 관절염 치료제를 대신할 수 있는 대체의약품의 가능성을 제시하였다.
- CH-Ex의 항관절염 작용기전을 조사하기 위해 LPS로 활성화된 macrophage에서 분비되는 NO(nitric oxide) 생성에 대한 억제효과를 측정하였다. 그 결과, CH-Ex로 처리한 macrophage에서의 NO 생성량은 LPS 만으로 처리한 macrophage와 비교해서 농도 의존적으로 감소되었다(Fig. 2). 일예로, 40 µg/ml 농도의 CH-Ex에서 대조군에 비해서 약 70%의 NO 생성이 억제되었다(P<0.
- 족부종 억제효과는 총 관찰기간 종료 때까지 지속적으로 유지되 었다. 그러나 CH-Ex의 억제효과는 indomethacin을 투여 받은 양성대조군에 비해서 효능이 떨어지는 것으로 관측되었다(Fig. 1). 반복 실험에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
- 시료 주입 후 생성된 피크는 80분 이내에 모두 유출되었다. 본 추출물에 함유된 페놀성 성분은 column으로부터 유출되는 순서에 따라 chlorogenic acid, ferulic acid, luteolin-5-O-glucoside, rutin, hyperoside, apigenin-7-O-glucosidse, luteolin, apigenin 등 모두 여덟 종류가 검출되었다(Fig. 4). 이 검색 결과는 타 연구자의 결과9,14-16)와 거의 유사하고, mAU value를 비교해 볼 때 그 value가 가장 큰 성분은 luteolin, apigenin과 이들 성분의 배당체였다(Fig.
- 생쥐 발바닥에 C. albicans 세포벽(CACW) 주사로 족부종이 생긴 다음에 CH-Ex를 투여 받은 생쥐위 경우는 CH-Ex 대신에 DPBS 완충용액을 투여 받은 음성대조군에 비해서 15일 간의 관측기간 전반적으로 족부종이 감소되었다(Fig. 1). 일예로, 족부종이 가장 피크에 도달한 관측 9일째 실험군과 음성대조군을 상호 비교하면 약 60% 정도의 족부종이 억제되었다(P<0.
- 본 연구에서 사용한 관절염 동물모델은 기연구결과의 발표를 통해서 검증된 것이다. 연구결과를 보면, CHEx는 감염성 관절염에 대해 치료 효과가 있으며, 이 치료 효과의 작용 기전은 활성화 된 macrophage에서 분비되는 NO(nitric oxide) 생성의 억제가 관여하는 것으로 평가되었다. 일반적으로 관절염이 유발되면 macrophage가 그 관절염 발생 부위로 유입 되어 부종이 형성되고,21,30,31) 자극된 macrophage에서 NO가 분비되어 주변의 세포와 조직을 파괴하기 때문에 통증이 야기되는 것이다.
- 2). 이 결과로 CH-Ex는 항염 효과가 있음이 확인되었다.
- 일예로, 40 µg/ml 농도의 CH-Ex에서 대조군에 비해서 약 70%의 NO 생성이 억제되었다(P<0.05)(Fig. 2).
- 일예로, 족부종이 가장 피크에 도달한 관측 9일째 실험군과 음성대조군을 상호 비교하면 약 60% 정도의 족부종이 억제되었다(P<0.05)(Fig. 1).
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