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문제 정의
- 장기간 알코올을 섭취시켜 유도한 만성 알코올성 지방간 흰쥐 모델에서 유산균 발효 마늘추출물을 알코올과 함께 투여했을 때, 간 손상의 지표들인 alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase(ALP), γ-glutamyl phosphatase(γ-GT), total-bilirubin(TBIL), direct-bilirubin(DBIL) 등의 변화를 조사하였다. 동시에 간 조직 내 GSH와 GSSG의 함량 분석과 조직학적 관찰을 통하여 유산균 발효 마늘추출물의 알코올성 지방간에 대한 예방 및 개선 효능을 확인하고자 하였다.
- 본 연구는 Lactobacillus plantarum으로 발효시킨 유산균 발효 마늘추출물의 간 손상 보호 효과를 알코올성 지방간을 유발시킨 C57BL/6J 마우스를 사용하여 확인하고자 하였다. 유산균 발효 마늘추출물은 일반식이군에 비해 지방간 유도와 함께 증가한 간 무게를 용량 의존적으로 감소시켰다.
- 또한 CYP2E1 transfected HepG2 cell을 이용하여 유산균 발효 마늘추출물의 알코올성 세포독성에 대한 보호 효과를 확인하였다(8). 본 연구는 알코올성 지방간을 유발시킨 동물모델에서 유산균 발효 마늘추출물의 간 보호 효능을 평가하고자 하였다. 장기간 알코올을 섭취시켜 유도한 만성 알코올성 지방간 흰쥐 모델에서 유산균 발효 마늘추출물을 알코올과 함께 투여했을 때, 간 손상의 지표들인 alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase(ALP), γ-glutamyl phosphatase(γ-GT), total-bilirubin(TBIL), direct-bilirubin(DBIL) 등의 변화를 조사하였다.
- 유산균 발효 마늘추출물의 알코올성 지방간 개선 활성을 직접적으로 확인하고자 간 조직을 염색하였다. 그 결과 Fig.
- 유산균 발효 마늘추출물이 대표적 항산화물질인 GSH의 함량과 형태에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 대조식이 군에 비해 알코올식이군의 간 조직 내 total GSH 및 GSSG의 함량이 저하되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 유산균 발효 마늘추출물을 투여한 군에서 농도 의존적으로 GSH의 함량이 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(Table 4).
제안 방법
- 혼합액에 1 U/mL glutathione reductase를 첨가하고 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. GSSG 표준물질을 이용하여 작성한 검량곡선을 통해 조직의 GSSG 함량을 산출하였다.
- Glutathione 함량 측정은 Akerboom과 Sies(14)의 방법을 응용하여 측정하였다. GSH 함량은 간 조직 0.
- 간 조직 내 지방 축적 정도를 조직학적으로 분석하기 위해 실험종료 후 회수된 간 조직을 액체질소로 급속동결 시킨 후 동결절편기(Leica CM 1850, Heidelberg, Germany)를 이용하여 5 μm 두께로 절편한 다음 hematoxylin(Invitrogen Corp., Camarillo, UK), eosin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 염색을 실시하여 광학-형광현미경(Leica DM6000B)으로 관찰하였다.
- 저자들은 이전 연구에서 Lactobacillus plantarum과 Pediococcus pentosaceus 등의 유산균을 이용하여 발효 시 마늘의 주요 기능 성분인 SAC, SEC, SMC의 함량이 증가함을 확인하였고, 그에 따라 항산화력이 상승되었음을 보고하였다. 또한 CYP2E1 transfected HepG2 cell을 이용하여 유산균 발효 마늘추출물의 알코올성 세포독성에 대한 보호 효과를 확인하였다(8). 본 연구는 알코올성 지방간을 유발시킨 동물모델에서 유산균 발효 마늘추출물의 간 보호 효능을 평가하고자 하였다.
- 모든 동물에 대하여 1일 1회 증상을 관찰하고 체중은 동물용 체중계를 이용하여 매일 일정한 시간에 측정하였다. 시험이 종료된 후 시험동물은 ethyl ether(Junsei, Tokyo, Japan)로 마취하여 복부대동맥으로부터 채혈하였다.
- 모든 동물에 대하여 1일 1회 증상을 관찰하고 체중은 동물용 체중계를 이용하여 매일 일정한 시간에 측정하였다. 시험이 종료된 후 시험동물은 ethyl ether(Junsei, Tokyo, Japan)로 마취하여 복부대동맥으로부터 채혈하였다. 혈액의 생화학적 분석은 Nyblom 등(12)과 Yang 등(13)의 방법을 응용하여 혈액은 3,000 rpm에서 15분 원심분리 한 후 혈청을 회수한 다음, 혈청자동분석기(Dri-chem 2000, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 ALT, AST, ALP, γGT, TBIL, DBIL 등을 정량하였다.
- 유산균 발효 마늘추출물은 50, 100, 200 mg/kg, 양성대조군인 silymarin은 200 mg/kg을 각각 매일 1회 경구 투여하였으며 일반식이 대조군과 에탄올식이 대조군은 증류수를 매일 1회 경구 투여하였다. 유도식이들은 매일 투여 직전에 제조하였고, 에탄올식이의 급여는 Rhodes 등(10)과 Yin과 Lee(11)의 방법을 응용하여 에탄올식이에 대한 거부감을 해소하기 위해 최초 0.5%부터 2일 단위로 0.5%씩 증량하여 최종적으로 5% 농도까지 상승시키는 적응기간을 두었다. 식이는 매일 잔량을 체크한 후 교체하였고, 총 8주 동안 사육하였다.
- 총 시험군은 Table 2와 같이 일반식이를 공급받는 일반식이군(normal diet, AIN-93G), 에탄올식이에 함유된 에탄올과 동일한 열량을 말토덱스트린으로 대체한 대조군(control diet), 총 열량의 36%를 에탄올로 대체한 에탄올식이 대조군(ethanol diet)으로 분류하였다. 유산균 발효 마늘추출물은 50, 100, 200 mg/kg, 양성대조군인 silymarin은 200 mg/kg을 각각 매일 1회 경구 투여하였으며 일반식이 대조군과 에탄올식이 대조군은 증류수를 매일 1회 경구 투여하였다. 유도식이들은 매일 투여 직전에 제조하였고, 에탄올식이의 급여는 Rhodes 등(10)과 Yin과 Lee(11)의 방법을 응용하여 에탄올식이에 대한 거부감을 해소하기 위해 최초 0.
- 배양 종료 후 95℃에서 열처리, 여과, 농축하여 유산균 발효 마늘추출물로 사용하였다. 유산균을 접종하지 않은 마늘추출물(Non-fermented garlic extract, NFGE)을 폴리페놀 화합물 함량 비교를 위한 대조군으로 사용하였다.
- 장기간 알코올을 섭취시켜 유도한 만성 알코올성 지방간 흰쥐 모델에서 유산균 발효 마늘추출물을 알코올과 함께 투여했을 때, 간 손상의 지표들인 alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase(ALP), γ-glutamyl phosphatase(γ-GT), total-bilirubin(TBIL), direct-bilirubin(DBIL) 등의 변화를 조사하였다.
- 실험동물은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조도 200~300 lux, 12시간 간격의 명암 주기 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 적응기간 동안 일반식이를 공급하였으며 식수로 멸균수를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 적응기간 후 난괴법에 의해 정상식이군 5마리, 나머지는 10마리씩 7군으로 분류하였다. 본 시험은 고려대학교 동물실험윤리규정을 준수하여 실시하였다.
- 조직 마쇄 상등액 대신 GSH 표준물질을 농도별로 측정하여 얻은 검량곡선을 이용하여 조직의 GSH 함량을 산출하였으며 간 조직 mg당 μg으로 표시하였다.
- 동물실험에 사용된 식이는 Table 1과 같은 조성으로 구성된 Liber-DeCarli 액체기본식이(Bethlehem, PA, USA)를 사용하였다. 총 시험군은 Table 2와 같이 일반식이를 공급받는 일반식이군(normal diet, AIN-93G), 에탄올식이에 함유된 에탄올과 동일한 열량을 말토덱스트린으로 대체한 대조군(control diet), 총 열량의 36%를 에탄올로 대체한 에탄올식이 대조군(ethanol diet)으로 분류하였다. 유산균 발효 마늘추출물은 50, 100, 200 mg/kg, 양성대조군인 silymarin은 200 mg/kg을 각각 매일 1회 경구 투여하였으며 일반식이 대조군과 에탄올식이 대조군은 증류수를 매일 1회 경구 투여하였다.
- 혈액의 생화학적 분석은 Nyblom 등(12)과 Yang 등(13)의 방법을 응용하여 혈액은 3,000 rpm에서 15분 원심분리 한 후 혈청을 회수한 다음, 혈청자동분석기(Dri-chem 2000, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 ALT, AST, ALP, γGT, TBIL, DBIL 등을 정량하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 유산균 발효 마늘추출물(LIVERTECTTM)은 경남 가월영농조합에서 생산한 창녕산 마늘을 구입하여 다음과 같이 조제하였다. 마늘 5 kg과 증류수 10 kg을 발효조(MJS U3, Marubishi, Tokyo, Japan)에서 혼합, 교반하면서 121℃에서 1시간 동안 멸균하였다.
- 실험동물은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조도 200~300 lux, 12시간 간격의 명암 주기 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 동물은 7주령(20~22 g) 수컷 C57BL/6J 마우스를 (주)대한바이오링크(Eumsung, Korea)에서 구입하였다. 실험동물은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조도 200~300 lux, 12시간 간격의 명암 주기 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리는 Statistical Analysis System(SAS) program(release 8.2, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 one way analysis of variance(ANOVA) test와 Duncan's multiple range test를 실시하여 P<0.05에서 통계학적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 동물실험에 사용된 식이는 Table 1과 같은 조성으로 구성된 Liber-DeCarli 액체기본식이(Bethlehem, PA, USA)를 사용하였다. 총 시험군은 Table 2와 같이 일반식이를 공급받는 일반식이군(normal diet, AIN-93G), 에탄올식이에 함유된 에탄올과 동일한 열량을 말토덱스트린으로 대체한 대조군(control diet), 총 열량의 36%를 에탄올로 대체한 에탄올식이 대조군(ethanol diet)으로 분류하였다.
- 총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin-Denis법(9)에 따라 측정하였다. 마늘추출물과 유산균 발효 마늘추출물 0.
성능/효과
- 2)Vitamin mix (g/kg mix): thiamin HCl, 0.6; riboflavin, 0.6; pyridoxine HCl, 0.7; niacin, 3.0; calcium pantothenate, 1.6; folic acid, 0.2; biotin, 0.02; vitamin B12 (0.1%), 10; vitamin A acetate (500,000 IU/g), 4.8; vitamin D3 (400,000 IU/g), 24; menadione sodium bisulfite, 0.08; p-aminobenzoin acid, 5; inositol, 10; dextrose, 939.
- Fig. 2는 만성 알코올성 지방간 동물모델에서 유산균 발효 마늘추출물의 간 기능 개선 효과를 확인하기 위해 혈청내 간 손상 지표들을 측정한 결과로, AST, ALP, TBIL, DBIL 등은 유산균 발효 마늘추출물 50, 100, 200 mg/kg 투여군에서 농도 의존적으로 간 손상을 개선하는 경향을 보였다. 반면 γ-GT와 ALT는 농도 의존적 효과를 나타내지는 않았지만 유산균 발효 마늘추출물 200 mg/kg 투여군에서 γ-GT는 에탄올식이군보다 17.
- 전 시험기간 동안 전체 그룹들의 체중증가율은 유사하였고, 대조식이군과 에탄올식이군 간 체중증가율의 유의차는 나타나지 않았다. 간 무게를 측정한 결과, 에탄올식이군의 간 무게는 대조식이군에 비해 유의적으로 증가되었으며 유산균 발효 마늘추출물 식이군의 경우 용량 의존적으로 간 무게가 감소되는 것을 확인하였다. 이 현상은 에탄올식이에 의해 지방간이 유도되면서 간 무게가 증가되었으나, 유산균 발효 마늘추출물 투여에 의해 알코올에 의한 지방간 유도가 완화된 것으로 해석되었다(Fig.
- 또한 유산균 발효 마늘추출물은 간의 조직학적 관찰에서도 알코올로 유도된 간 지방의 축적을 농도 의존적으로 개선하였다. 간 조직 내 GSH 함량을 측정한 결과, 알코올에 의해 감소된 GSH가 유산균 발효 마늘추출물 투여에 의해 점차 일반식이군 수준으로 회복됨을 알 수 있었다. 이상의 연구 결과는 유산균 발효에 의해 마늘의 냄새와 맛을 개선시킨 유산균 발효 마늘추출물이 알코올성 지방간의 예방 및 개선을 위한 기능성식품용 상업적 소재로서 높은 실용화 가능성을 시사한다.
- 그 결과 대조식이 군에 비해 알코올식이군의 간 조직 내 total GSH 및 GSSG의 함량이 저하되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 유산균 발효 마늘추출물을 투여한 군에서 농도 의존적으로 GSH의 함량이 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(Table 4). 간 조직 세포 내 redox status를 나타내는 지표(16)인 GSSG/total GSH ratio은 양성대조군인 실리마린과 알코올식이군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 유산균 발효 마늘추출물 투여군은 농도 의존적으로 감소하였다. 이로부터 유산균 발효 마늘추출물은 GSSG의 생성을 줄이고, 간세포 내에서 독성물질 또는 활성산소 등의 무독화 반응에 사용되는 GSH의 양을 증가시키는 비교적 강한 항산화능을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 유산균 발효 마늘추출물의 알코올성 지방간 개선 활성을 직접적으로 확인하고자 간 조직을 염색하였다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 대조식이군에 비해 알코올식이군의 간 조직 내에 더 많은 양의 lipid droplet이 축적되어 있는 현상과 지방성 염증의 한 증상으로 보이는 neutorophil이 peripheral 영역에서 관찰되었고, 유산균 발효 마늘추출물을 투여한 군에서 농도 의존적으로 지방 축적이 개선되는 것을 관찰할 수 있었다. 혈중 bilirubin 수치 개선 효과로 미루어 볼 때 cholestasis 등 담관계 질환에도 효능이 있을 것으로 예상되었으나, 조직염색 결과 담관내피 조직의 증식이나 담관 폐쇄 등은 확인할 수 없었다.
- 유산균 발효 마늘추출물이 대표적 항산화물질인 GSH의 함량과 형태에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 대조식이 군에 비해 알코올식이군의 간 조직 내 total GSH 및 GSSG의 함량이 저하되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 유산균 발효 마늘추출물을 투여한 군에서 농도 의존적으로 GSH의 함량이 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(Table 4). 간 조직 세포 내 redox status를 나타내는 지표(16)인 GSSG/total GSH ratio은 양성대조군인 실리마린과 알코올식이군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 유산균 발효 마늘추출물 투여군은 농도 의존적으로 감소하였다.
- Hsu 등(15)은 acetoaminophen으로 독성을 유발시킨 마우스에서 SAC와 S-propyl cysteine(SPC) 투여에 의해 혈중 ALT와 AST 값이 대조군에 비해 약 50% 이상 감소됨을 보고하였고, 저자들은 이전 연구에서 유산균 발효 마늘추출물의 SAC 함량이 발효 전에 비해 약 4배 증가되는 것을 확인하였다(8). 따라서 유산균 발효 마늘추출물의 알코올성 지방간에 의한 간 손상 개선 효과는 SAC 함량의 증가와 직접적인 관련이 있을 것으로 추측되었다.
- 6%가 각각 개선됨으로써 유산균 발효 마늘추출물이 장기 알코올 섭취로 인한 간 손상의 예방 및 개선에 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 간세포 손상 시 혈중에 증가하는 적혈구 유래 혈색소들인 TBIL과 DBIL 값도 유산균 발효 마늘추출물 투여에 의해 농도 의존적으로 감소하였을 뿐만 아니라 200 mg/kg 투여군에서 개선 활성이 각각 40.5%와 60.0%로 매우 높은 효과를 보이고 있음을 확인하였다.
- 반면 γ-GT와 ALT는 농도 의존적 효과를 나타내지는 않았지만 유산균 발효 마늘추출물 200 mg/kg 투여군에서 γ-GT는 에탄올식이군보다 17.6%, ALT는 10.6% 각각 개선되는 효과를 나타내었다.
- 발효 여부에 따른 총 폴리페놀 화합물의 함량을 측정한 결과, 마늘 추출물은 건조중량 1 mg당 26.66±2.43 μg GAE, 유산균 발효 마늘추출물은 건조중량 1 mg당 55.54±1.12 μg GAE로 발효 후 총 폴리페놀 화합물 함량이 약 2배 이상 증가하였다(Table 3).
- 모든 시험군에서 사망 개체수가 발생하지 않았으며 설사 또는 항문 주변부 오염 등 기타 이상 증상은 관찰되지 않았다. 부검 결과 간 조직 이외의 다른 조직에서의 부작용 또한 관찰되지 않음으로써 경구 투여에 의한 유산균 발효 마늘추출물의 섭취에 따른 장기조직의 변화, 손상 등의 부작용은 유발되지 않음을 알 수 있었다.
- 유산균 발효 마늘추출물은 일반식이군에 비해 지방간 유도와 함께 증가한 간 무게를 용량 의존적으로 감소시켰다. 유산균 발효 마늘추출물 200 mg/kg 투여군에서 대표적 간 손상 관련 혈청효소인 ALT, AST 및 ALP의 활성이 낮았으며, 간 손상의 다른 중요한 지표들인 TBIL, DBIL 값도 현저히 낮았다. 또한 유산균 발효 마늘추출물은 간의 조직학적 관찰에서도 알코올로 유도된 간 지방의 축적을 농도 의존적으로 개선하였다.
- 간 조직 세포 내 redox status를 나타내는 지표(16)인 GSSG/total GSH ratio은 양성대조군인 실리마린과 알코올식이군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 유산균 발효 마늘추출물 투여군은 농도 의존적으로 감소하였다. 이로부터 유산균 발효 마늘추출물은 GSSG의 생성을 줄이고, 간세포 내에서 독성물질 또는 활성산소 등의 무독화 반응에 사용되는 GSH의 양을 증가시키는 비교적 강한 항산화능을 갖고 있음을 알 수 있었다. 이 결과는 Abdel-Wahhab 등(17)이 숙성마늘을 100 mg/kg, 200 mg/kg의 농도로 투여한 후 CCl4로 간 독성을 유발시킨 흰쥐에서 GSH의 양이 증가하고 GSSG의 양이 감소함을 보고한 결과와 유사하였다.
- 전 시험기간 동안 전체 그룹들의 체중증가율은 유사하였고, 대조식이군과 에탄올식이군 간 체중증가율의 유의차는 나타나지 않았다. 간 무게를 측정한 결과, 에탄올식이군의 간 무게는 대조식이군에 비해 유의적으로 증가되었으며 유산균 발효 마늘추출물 식이군의 경우 용량 의존적으로 간 무게가 감소되는 것을 확인하였다.
- 6% 각각 개선되는 효과를 나타내었다. 한편 AST는 에탄올식이군에 비해 200 mg/kg 투여군에서 23.2%, ALP는 34.6%가 각각 개선됨으로써 유산균 발효 마늘추출물이 장기 알코올 섭취로 인한 간 손상의 예방 및 개선에 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 간세포 손상 시 혈중에 증가하는 적혈구 유래 혈색소들인 TBIL과 DBIL 값도 유산균 발효 마늘추출물 투여에 의해 농도 의존적으로 감소하였을 뿐만 아니라 200 mg/kg 투여군에서 개선 활성이 각각 40.
후속연구
- 간 조직 내 GSH 함량을 측정한 결과, 알코올에 의해 감소된 GSH가 유산균 발효 마늘추출물 투여에 의해 점차 일반식이군 수준으로 회복됨을 알 수 있었다. 이상의 연구 결과는 유산균 발효에 의해 마늘의 냄새와 맛을 개선시킨 유산균 발효 마늘추출물이 알코올성 지방간의 예방 및 개선을 위한 기능성식품용 상업적 소재로서 높은 실용화 가능성을 시사한다.
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