An HPLC method for determination of naringin was developed to standardize it as a marker compound in Goheung yuzu extract as a functional health food. Optimum results were obtained by C-18 column chromatography using solvent mixtures (A: 0.5% acetic acid, B: acetonitrile) as the stationary phase and...
An HPLC method for determination of naringin was developed to standardize it as a marker compound in Goheung yuzu extract as a functional health food. Optimum results were obtained by C-18 column chromatography using solvent mixtures (A: 0.5% acetic acid, B: acetonitrile) as the stationary phase and mobile phase. The method was fully validated and sensitive with a limit of detection (LOD) of 0.0218 mg/L and limit of quantification (LOQ) of 0.0661 mg/L. The method showed high linearity (coefficient of correlation=0.9986) and high accuracy, as recovery rates of naringin at concentrations of 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg/mL were in the ranges of 95.74~98.25%, 97.67~101.01%, 97.33~104.64%, and 95.53~106.82%, respectively. Intra-day and inter-day variation, which are measures of method precision, were 1.39~1.95% and 0.17~1.49%, respectively. Therefore, the method could be used without modification for determination of naringin as a marker compound in Goheung yuzu extracts.
An HPLC method for determination of naringin was developed to standardize it as a marker compound in Goheung yuzu extract as a functional health food. Optimum results were obtained by C-18 column chromatography using solvent mixtures (A: 0.5% acetic acid, B: acetonitrile) as the stationary phase and mobile phase. The method was fully validated and sensitive with a limit of detection (LOD) of 0.0218 mg/L and limit of quantification (LOQ) of 0.0661 mg/L. The method showed high linearity (coefficient of correlation=0.9986) and high accuracy, as recovery rates of naringin at concentrations of 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg/mL were in the ranges of 95.74~98.25%, 97.67~101.01%, 97.33~104.64%, and 95.53~106.82%, respectively. Intra-day and inter-day variation, which are measures of method precision, were 1.39~1.95% and 0.17~1.49%, respectively. Therefore, the method could be used without modification for determination of naringin as a marker compound in Goheung yuzu extracts.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구에서는 개별 인정형 건강기능식품 기능성 원료로 개발할 목적으로 고흥 유자 추출물의 표준화를 위해 지표성분으로 naringin을 설정하였으며, HPLC를 이용하여 지표성분 naringin의 분석법을 확립하며 그에 따른 유효성 검증을 실시하였다.
특히 생활패턴의 서구화로 인한 성인병 발병률의 증가로 점차 기호식품에 대한 소비자의 인식이 바뀌기 시작함에 따라 성인병과 만성질환 예방을 위해 꾸준히 섭취할 수 있는 기능성 식품을 개발하고 확대하는 것 또한 중요하게 대두되고 있다(13). 이렇게 생리활성 성분이 다량 함유된 유자를 소재로 개별 인정형 건강기능식품 기능성 원료로 개발, 등록하기 위해 고흥 유자를 이용하여 유자 추출물을 제조하였다.
제안 방법
직선성, 정량한계 및 검출한계: 검체 중 분석대상물질의 농도에 비례하여 일정 범위 내에 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 의미하는 직선성을 검증하기 위해 여섯 개 농도의 검체를 2반복하여 분석하여 얻은 값의 peak 면적비와 농도비의 관계를 알 수 있는 회귀분석을 통하여 표준 검량선을 얻었다. 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02 mg/mL로 단계적으로 희석한 naringin 표준용액을 HPLC로 분석하여 peak 면적비에 대한 농도비의 관계를 표시하는 표준 검량선을 작성하였다. 또한 직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기와 표준편차를 통해 정량한계 및 검출한계를 구하였으며, 검출한계(LOD)는 시료에 포함되는 분석대상물의 검출이 가능한 최소량 또는 최저 농도, 정량한계(LOQ)는 검체 중에 포함되어 있는 분석대상물의 정량이 가능한 최소량 또는 최저 농도로 LOD와 LOQ는 ICH Q2B guideline의 계산식을 따랐으며 보통 signal-to-noise ratio에 의해 결정되며(LOD는 S/N이 3:1로, LOQ는 10:1), 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 산출하였다.
정밀성: 시험샘플을 전처리법에 따라 처리된 시험용액을 inter-day와 intra-day로 나누어 정밀성 실험을 실시하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 6일간 진행하였고 intraday는 1일 3구간 6시간마다(9:00 AM, 3:00 PM, 9:00 PM) 진행하였으며 각 3회씩 반복하여 HPLC로 분석하였다. 얻어진 면적은 검량선에 의해 정량한 농도별 검출 농도의 표준편차를 검출 농도로 나눈 비의 백분율로 계산하였다.
개별 인정형 건강기능식품 기능성 원료로 개발한 고흥 유자 추출물의 표준화를 위해 지표성분으로 naringin을 설정하였으며, HPLC를 이용하여 지표성분 naringin의 분석법을 확립하고 그에 따른 유효성분 검정을 실시하고자 하였다. 유효성 검정 결과, 본 시험법에서 표준용액의 retention time과 고흥 유자 추출물의 retention time이 일치하는 것을 확인할 수 있었으며 동일한 spectrum을 나타내어 특이성을 확인하였다.
개별 인정형 건강기능식품 기능성 원료로 등록하기 위해 지표성분 분석법의 벨리데이션에 대한 가이드라인을 근거로 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 검출한계(limit of detection) 및 정량한계(limit of quantitation)로 시험법의 유효성 검증을 실시하였다.
02 mg/mL로 단계적으로 희석한 naringin 표준용액을 HPLC로 분석하여 peak 면적비에 대한 농도비의 관계를 표시하는 표준 검량선을 작성하였다. 또한 직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기와 표준편차를 통해 정량한계 및 검출한계를 구하였으며, 검출한계(LOD)는 시료에 포함되는 분석대상물의 검출이 가능한 최소량 또는 최저 농도, 정량한계(LOQ)는 검체 중에 포함되어 있는 분석대상물의 정량이 가능한 최소량 또는 최저 농도로 LOD와 LOQ는 ICH Q2B guideline의 계산식을 따랐으며 보통 signal-to-noise ratio에 의해 결정되며(LOD는 S/N이 3:1로, LOQ는 10:1), 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 산출하였다. 검출한계 식은 LOD=3.
유자 추출물의 naringin 분석은 Yu 등(14)의 분석법을 변형하여 분석법에 이용하였으며 Agilent 1100 series system(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 binary pump(DE43618438, Agilent Technologies)와 UV detector(DAD: G1315B, Agilent Technologies)로 분석하였다. 분석조건은 Table 1과 같으며 분석용 칼럼은 Mightysil RP-18 GP 250-4.
표준품 naringin(95%, Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland)을 1 mg/mL의 농도가 되도록 메탄올로 제조한 것을 표준원액으로 하였다. 이를 메탄올을 이용하여 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02 mg/mL로 단계적으로 희석한 표준용액을 이용하여 표준 검량선으로부터 naringin 함량을 구하였다.
정밀성: 시험샘플을 전처리법에 따라 처리된 시험용액을 inter-day와 intra-day로 나누어 정밀성 실험을 실시하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 6일간 진행하였고 intraday는 1일 3구간 6시간마다(9:00 AM, 3:00 PM, 9:00 PM) 진행하였으며 각 3회씩 반복하여 HPLC로 분석하였다.
특이성: 특이성은 공존이 예측되는 불순물, 분해물, 배합성분들이 서로 영향을 받지 않고 특이적으로 측정할 수 있는 능력을 의미하며, 시료에서 분석대상물질을 선택적으로 측정할 수 있는 정도를 나타내는 특이성의 검증을 위하여 표준용액과 전처리 방법으로 처리한 유자 추출물을 HPLC로 분석한 뒤 크로마토그램을 비교하여 naringin peak가 분리되는지를 확인하였고 peak 간 간섭 정도를 측정하였으며, diode array detector(DAD) system을 이용하여 동일한 spectrum을 확인하였다.
회수율: 이미 알고 있는 표준용액을 검체에 넣은 후 분석에 의해 회수되는 회수율을 측정한 것으로 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg의 naringin 표준폼을 메탄올 1 mL에 각각 녹인 것과 시험샘플 0.05 g을 메탄올 1 mL에 녹인 것 그리고 시험샘플 0.05 g을 각각 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg/mL의 표준용액에 녹인것을 사용하여 회수율 실험을 실시하였다. 각 시험은 3회 10반복으로 진행되었으며 HPLC로 분석하여 얻어진 면적을 표준품, 시험샘플, 시험샘플과 표준품의 면적과 서로 비교하여 평균과 상대표준편차(relative standard deviation)를 이용하여 회수율을 구하였다.
회수율은 유자 추출물 0.05 g을 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg/mL 의 농도의 naringin 표준품 용액 1 mL에 각각 녹여 전처리법에 의해 처리한 뒤 HPLC로 분석하여 검출되는 농도를 측정하여 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg/mL의 단계적으로 4가지 농도로 희석한 naringin 표준품을 HPLC로 분석하여 검출되는 농도를 측정하여 빼주었으며, 유자 추출물 0.05 g을 3회 10반복으로 1 mL 메탄올에 녹여 앞에 전처리법에 의해 처리한 뒤 HPLC로 분석하여 검출되는 농도를 측정하여 나눈 값으로 회수율을 얻었다. Table 2에 나타난 바와 같이 naringin의 회수율은 1 mg/mL에서는 95.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 유자 추출물은 전남 고흥 유자를 세척 및 조분쇄 한 다음 70% ethanol을 이용하여 33∼38℃에서 7시간 동안 순환 추출 후 여과 및 농축하여 고형분 대비 60%의 덱스트린을 첨가하여 분말로 제조한 것을 시료로 사용하였다.
표준품 naringin(95%, Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland)을 1 mg/mL의 농도가 되도록 메탄올로 제조한 것을 표준원액으로 하였다. 이를 메탄올을 이용하여 1, 0.
데이터처리
05 mg/mL의 표준용액에 녹인것을 사용하여 회수율 실험을 실시하였다. 각 시험은 3회 10반복으로 진행되었으며 HPLC로 분석하여 얻어진 면적을 표준품, 시험샘플, 시험샘플과 표준품의 면적과 서로 비교하여 평균과 상대표준편차(relative standard deviation)를 이용하여 회수율을 구하였다.
Inter-day는 1일 1구간으로 6일간 진행하였고 intraday는 1일 3구간 6시간마다(9:00 AM, 3:00 PM, 9:00 PM) 진행하였으며 각 3회씩 반복하여 HPLC로 분석하였다. 얻어진 면적은 검량선에 의해 정량한 농도별 검출 농도의 표준편차를 검출 농도로 나눈 비의 백분율로 계산하였다.
직선성, 정량한계 및 검출한계: 검체 중 분석대상물질의 농도에 비례하여 일정 범위 내에 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 의미하는 직선성을 검증하기 위해 여섯 개 농도의 검체를 2반복하여 분석하여 얻은 값의 peak 면적비와 농도비의 관계를 알 수 있는 회귀분석을 통하여 표준 검량선을 얻었다. 1, 0.
성능/효과
1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05 0.02 mg/mL로 단계적으로 희석한 naringin 표준용액을 HPLC로 분석하여 검량선을 작성하였으며, 검량선의 상관계수(R2)는 0.9986으로 높은 직선성을 보였으며(Fig. 4) 직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기와 표준편차를 통해 검출한계를 구한 결과, 검출한계는 0.0218 mg/L, 정량한계는 0.0661 mg/L 수준으로 나타났다. 이는 시료에 적용할 경우 검출한계는 0.
특이성은 불순물 등과 혼합된 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로 다른 물질의 간섭 없이 성분이 분리되는 것에 의해 확인하게 된다. HPLC 를 통해 표준용액과 시료 전처리 방법으로 처리한 유자 추출물의 크로마토그램을 비교하여 naringin peak가 분리되는 지를 확인한 결과 다른 물질의 간섭 없이 성분이 분리되었으며 표준용액의 retention time이 동일하고 spectrum 또한 일치하는 것으로 본 시험법의 특이성을 확인하였다(Fig. 2, 3).
Intra-day, inter-day의 정밀도(RSD)를 측정한 결과는 Table 3과 같으며, 하루에 일정시간(6시간)을 두고 반복하여 분석한 intra-day에서의 정밀도는 1.39∼1.95%를 나타내었고, 하루(24시간) 간격을 두고 6일 동안 분석한 inter-day에서는 0.17∼1.49%의 정밀도를 나타내어 표준편차 2% 이내를 만족하였다.
Table 2에 나타난 바와 같이 naringin의 회수율은 1 mg/mL에서는 95.75∼98.25%, 0.5 mg/mL에서는 97.67∼101.01%, 0.1 mg/mL에서는 97.33∼104.64%, 0.05 mg/mL에서는 95.53∼106.82%의 범위의 회수율을 얻었으며 분석오차 10% 이내를 만족하였다.
개별 인정형 건강기능식품 기능성 원료로 개발한 고흥 유자 추출물의 표준화를 위해 지표성분으로 naringin을 설정하였으며, HPLC를 이용하여 지표성분 naringin의 분석법을 확립하고 그에 따른 유효성분 검정을 실시하고자 하였다. 유효성 검정 결과, 본 시험법에서 표준용액의 retention time과 고흥 유자 추출물의 retention time이 일치하는 것을 확인할 수 있었으며 동일한 spectrum을 나타내어 특이성을 확인하였다. 검량선의 상관계수(R2)는 0.
이상의 분석 결과, 본 연구의 기기분석법과 유효성 검증을 통해 건강기능식품 기능성 원료로서의 유자 추출물의 표준화를 위해 지표성분인 naringin의 분석이 가능함을 확인 하였다.
후속연구
Musmade 등(15)은 naringin 분석법에서 검출한계에 대해서는 17 ng/mL로 유사한 수준을 보였으며, 정량한계에 대해서는 50 ng/mL로 다소 높은 수준을 보였다. 유자 추출물의 표준화를 위해 설정된 지표성분의 분석을 위한 검출한계와 정량 한계를 검증한 것으로 활용이 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유자의 국내 재배지는?
감귤류의 일종인 유자(Citrus junos SIEB ex TANAKA)는 운향과 감귤속, 후생감귤아속에 속한 상록관목의 열매로 장귤과 밀감류와의 자연교잡종 과목이며 국내에서는 전라 남도 고흥, 완도, 진도, 장흥과 경상남도 거제, 통영, 남해 그리고 제주도 등지에서 재배되고 있다. 유자는 감귤, 오렌지, 자몽 등이 과육을 위주로 이용하는 것과는 달리 과육과 과피를 모두 이용할 수 있으며(1), 향기가 좋고 신맛이 강하며 유기산과 비타민 A와 C가 풍부하고 항산화능, 항암효과, 항균작용이 있다고 알려져 있다(2,3).
감귤류의 일종인 유자는 어떤 형태로 가공되는가?
1). 반면 유자는 수확기가 11월에서 12월로 한정 되어 있고, 저장성이 좋지 않아 대부분이 수확 즉시 당 절임 형태인 유자차, 유자청의 원료로 사용되거나 음료로 많이 이용되어 왔으며 시럽, 소스 등으로 가공되어 이용하고 있다(2). 최근 유자의 기능성이 밝혀지면서 소비를 활성화하기 위한 기술 및 상품이 개발되고 있다.
naringin의 생리활성 기능은?
최근 연구 결과에 따르면 항산화 역할을 하는 비타민 C와 E 그리고 과일에 많이 들어 있는 polyphenol과 flavonoids 물질이 질병을 억제하는 데 효과가 있다고 밝혀졌다(4,5). 특히 유자를 포함하는 감귤류의 과피에 많이 함유되어 있는 flavonoid류의 하나인 naringin은 인체에 독성이 없고 콜레스테롤 억제효과와 백혈병 세포를 정상세포로 변화시키는 작용, 유방암 세포증식 저해작용, 항산화 효과, 항염증, 천연 항균제 등 다양한 생리활성을 가지고 있다고 보고되었다(1,6,7). 최근 건강기능 증진효과가 알려지면서 다양한 생리활성 성분으로 각광받고 있는 naringin은 자연에서 유리상태(aglycone)로 존재하거나 rhamnose, rutinose, glucose 등의 다양한 당과 결합하여 배당체의 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다(8).
참고문헌 (17)
Yang HS, Eun JB. 2011. Fermentation and sensory characteristics of Korean traditional fermented liquor (Makgeolli) added with citron (Citrus junos SIEB ex TANAKA) juice. Korean J Food Sci Technol 43: 438-445.
Kim HY, Kim E, Kim DH, Oh MJ, Shin TS. 2009. The nutritional components of olive flounder (Paralichthys olivaceus) fed diets with yuza (Citrus junos Sieb ex Tanaka). J Fish Aquat Sci 42: 215-223.
Lee YJ, Kim SI, Han YS. 2008. Antioxidant activity and quality characteristics of yogurt added yuza (Citrus junos Sieb ex Tanaka) extract. Korean J Food & Nutr 21: 135-142.
Vinson JA, Su X, Zubik L, Bose P. 2001. Phenol antioxidant quantity and quality in food: fruits. J Agric Food Chem 49: 5315-5321.
Lee SL, Seo CS, Kim JH, Shin HK. 2011. Contents of poncirin and naringin in fruit of Poncirus trifoliata according to different harvesting times and locations for two years. Kor J Pharmacogn 42: 138-143.
Chae SC, Kyo EG, Choi SH, Ryu GC. 2008. Protective effect naringin on carbon tetrachloride induced hepatic injury in mice. J Environ Toxicol 23: 325-335.
Singleton VL. 1981. Naturally occurring food toxicants: phenolic substances of plant origin common in foods. Adv Fd Res 27: 149-242.
Cvetnic Z, Vladimir-Knezevic S. 2004. Antimicrobial activity of grapefruit seed and pulp ethanolic extract. Acta Pharm 54: 243-250.
Kim HJ, Oh GT, Park YB, Lee MK, Seo HJ, Choi MS. 2004. Naringin alters the cholesterol biosynthesis and antioxidant enzyme activities in LDL receptor-knockout mice under cholesterol fed condition. Life Sci 74: 1621-1634.
Jung UJ, Lee MK, Park YB, Kang MA, Choi MS. 2006. Effect of citrus flavonoids on lipid metabolism and glucose-regulating enzyme mRNA levels in type-2 diabetic mice. Int J Biochem Cell Biol 38: 1134-1145.
Balestrieri ML, Castaldo D, Balestrieri C, Quagliuolo L, Giovane A, Servillo L. 2003. Modulation by flavonoids of PAF and related phospholipids in endothelial cells during oxidative stress. J Lipid Res 44: 380-387.
Yoo KM, Lee CH, Hwang IK. 2008. Preparation of chocolate added with yuza (Citrus junos Sieb ex Tanaka) and its antioxidant characteristics. Korean J Food Cookery Sci 24: 222-227.
Yu HY, Park SW, Chung IM, Jung YS. 2011. Anti-platelet effects of yuzu extract and its component. Food Chem Toxicol 49: 3018-3024.
Musmade KP, Trilok M, Dengale SJ, Bhat K, Reddy MS, Musmade PB, Udupa N. 2014. Development and validation of liquid chromatographic method for estimation of naringin in nanoformulation. J Pharm doi: 10.1155/2014/864901.
Ribeiro IA, Ribeiro MHL. 2008. Naringin and naringenin determination and control in grapefruit juice by a validated HPLC method. Food Control 19: 432-438.
Calabro ML, Galtieri V, Cutroneo P, Tommasini S, Ficarra P, Ficarra R. 2004. Study of the extraction procedure by experimental design and validation of a LC method for determination of flavonoids in Citrus bergamia juice. J Pharm Biomed Anal 35: 349-363.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.