나노물질이 포함된 다양한 제품들이 증가하고 있으며, 나노물질의 수생태계 노출에 대해서는 불가피하다. 따라서 우리는 금나노입자를 이용하여 국내 다양한 습지 환경에 널리 서식하는 북방산개구리에 대한 독성평가(부화율, 바디컨디션, 행동학적민감도)를 해보았다. 행동학적 민감도는 포식자 회피반응 정도를 이용하여 Ethvision XT 9으로 측정하였다. 금나노입자에 대한 부화율과 STL의 독성은 나타나지 않았다. 하지만 금나노입자에 노출된 올챙이들은 외부자극에 대한 행동학적 민감도가 감소하였다. 이러한 결과는 실험대상 동물의 행동학적 특성을 이용한 새로운 독성평가 방식을 제시한다.
나노물질이 포함된 다양한 제품들이 증가하고 있으며, 나노물질의 수생태계 노출에 대해서는 불가피하다. 따라서 우리는 금나노입자를 이용하여 국내 다양한 습지 환경에 널리 서식하는 북방산개구리에 대한 독성평가(부화율, 바디컨디션, 행동학적민감도)를 해보았다. 행동학적 민감도는 포식자 회피반응 정도를 이용하여 Ethvision XT 9으로 측정하였다. 금나노입자에 대한 부화율과 STL의 독성은 나타나지 않았다. 하지만 금나노입자에 노출된 올챙이들은 외부자극에 대한 행동학적 민감도가 감소하였다. 이러한 결과는 실험대상 동물의 행동학적 특성을 이용한 새로운 독성평가 방식을 제시한다.
As the number of applications containing nanomaterials increase, aquatic ecosystem exposure to nanoparticles (NPs) is unavoidable. In this study, we carried out toxicity assessment to Au-nanoparticles(NPs) of Rana dybowskii eggs and tadpoles. Toxicity was recorded hatching rate, body condition(Snout...
As the number of applications containing nanomaterials increase, aquatic ecosystem exposure to nanoparticles (NPs) is unavoidable. In this study, we carried out toxicity assessment to Au-nanoparticles(NPs) of Rana dybowskii eggs and tadpoles. Toxicity was recorded hatching rate, body condition(Snout-tail length, STL), and behavioral sensitivity. Behavioral sensitivity was analyzed to anti-predator behavior using Ethovision XT 9. Au-NPs did not show any toxicity of hatching rate and STL. But, Tadpoles exposed to Au-NPs decrease behavioral sensitivity of stimuli. This study has value of environmental toxicity evaluation because these results show the new way of toxicity assessment.
As the number of applications containing nanomaterials increase, aquatic ecosystem exposure to nanoparticles (NPs) is unavoidable. In this study, we carried out toxicity assessment to Au-nanoparticles(NPs) of Rana dybowskii eggs and tadpoles. Toxicity was recorded hatching rate, body condition(Snout-tail length, STL), and behavioral sensitivity. Behavioral sensitivity was analyzed to anti-predator behavior using Ethovision XT 9. Au-NPs did not show any toxicity of hatching rate and STL. But, Tadpoles exposed to Au-NPs decrease behavioral sensitivity of stimuli. This study has value of environmental toxicity evaluation because these results show the new way of toxicity assessment.
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문제 정의
하지만 이러한 연구들은 모두 치사영향에 관한 연구들로 실제 수중생태계 생물들에게 적용하는 것은 무리가 있다. 우리는 금나노입자 노출에 따른 행동학적 근거를 토대로 국내에 광범위한 수중생태계에 서식하고 있는 북방산개구리 알의 부화율과 유생의 행동변화에 따른 생존가능성에 대해 알아보고자 한다.
제안 방법
알덩이에서 400개의 알을 무작위로 선택하여, 40개의 플라스틱 수조 (20cm×13cm×13cm)에 10개씩 나누어 사육하였다. 40개의 수조를 농도마다 10개씩 나누어 분류한 농도의 금나노입자 수용액을 500ml씩 넣어주었다. 각 플라스틱 수조간 수온 차이에 의한 배아의 발생과정 차이가 발생할 수 있기 때문에 실험에 사용된 모든 플라스틱 수조 간의 수온 차이를 최소화하기 위하여 물이 들어있는 큰 탱크(120cm× 45cm×60cm)에 넣어 물 위에 띄운 중탕방식을 이용하였다(Fig 3).
각 플라스틱 수조간 수온 차이에 의한 배아의 발생과정 차이가 발생할 수 있기 때문에 실험에 사용된 모든 플라스틱 수조 간의 수온 차이를 최소화하기 위하여 물이 들어있는 큰 탱크(120cm× 45cm×60cm)에 넣어 물 위에 띄운 중탕방식을 이용하였다(Fig 3).
금나노입자에 노출된 그룹과 금나노입자에 노출되지 않은 그룹의 올챙이들 중 그룹 마다 무작위로 50마리를 선택하여 개체마다 300ml염소를 제거한 상수도 500ml가 들어있는 플라스틱 컵(10cm(직경)×15cm)으로 옮겨45분간 안정을 취하게 하였다.
포식자 큐 주입을 기준으로 주입 전 4분(포식자 위협이 없는 안정적인 상태)과 주입 후 4분(포식자 위협에 따른 회피반응 상태)동안의 행동을 녹화하였으며, 포식자 큐가 주입되는 30초 동안은 포식자 인식기간으로 설정하여 기록하지 않았다. 또한 행동실험이 끝난 모든 개체들의 STL은 디지털 버니어캘리퍼스를 사용하여 측정하였다.
발생이 시작되지 않은 알덩이들을 구별하여 채집하였으며, 채집된 알덩이들은 각 알덩이 별로 분리하여 3L의 염소가 제거된 플라스틱수조(60cm×25cm×25cm)에서 관리하였다.
이는 행동분석 시 일반 염소가 제거된 상수도에서 이루어질 때 발생할 수 있는 유생들의 쇼크를 방지하기 위함이다. 부화 5일 후, 선행연구에서 사용된 프로토콜을 적용하여 유생들을 관찰하였다 (Chivers and Mirza 2001; Ferrari et al., 2007b, c; Mathis et al., 2008, Ferrari et al., 2008b). 금나노입자에 노출된 그룹과 금나노입자에 노출되지 않은 그룹의 올챙이들 중 그룹 마다 무작위로 50마리를 선택하여 개체마다 300ml염소를 제거한 상수도 500ml가 들어있는 플라스틱 컵(10cm(직경)×15cm)으로 옮겨45분간 안정을 취하게 하였다.
부화에 성공하였지만 외부자극에 대한 반응이 현저히 떨어지거나 정상적인 유영이 불가능하여 먹이활동을 할 수 없는 개체는 부화에 성공하지 못한 것으로 간주하여 기록하지 않았다. 부화율은 전체 알 수와 부화에 성공한 알 수의 비율로 계산하였다.
실험에 사용된 유생들 중 금나노입자에 노출되지 않았던 유생들과 금나노입자에 노출된 경험이 있는 유생들 중 각각 50마리씩 무작위로 선택하여 플라스틱수조 (30cm×20cm×25cm, 2.5L)에서 120시간 동안 사육하였다.
자연상태에서의 알 상태와 최대한 유사하게 하기 위해 알을 싸고 있는 우무질은 제거하지 않고 그대로 실험하였다. 알 상태에서의 독성평가를 위해 알의 부화율과 부화 후 24시간 후의 유생의 snout-tail length(STL)를 디지털 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo CD-20CPS)로 측정하였으며, STL은 유생의 코가 위치한 곳부터 항문이 위치한 곳까지의 거리를 의미한다(Fig4). 부화에 성공한 개체는 부화 후 12시간 후의 정상적인 움직임이 가능한 개체만을 기록하였다.
알덩이에서 400개의 알을 무작위로 선택하여, 40개의 플라스틱 수조 (20cm×13cm×13cm)에 10개씩 나누어 사육하였다.
5L)에서 120시간 동안 사육하였다. 처음 24시간 동안은 금나노입자에 노출되지 않은 유생은 금나노입자가 들어있지 않은 상수도에 두었고, 금나노입자에 노출된 경험이 있는 유생들은 금나노입자 100㎍/mL농도에 두었다. 그 후 96시간은 두 그룹 모두 금나노입자가 들어있지 않은 일반 상수도에서 사육하였다.
또한 포식자 큐주입에 대한 유생의 영향을 최소화하기 위하여 포식자 큐는 주사기를 이용하여 플라스틱 컵 벽면을 따라 천천히 주입해 주었다. 포식자 큐 주입을 기준으로 주입 전 4분(포식자 위협이 없는 안정적인 상태)과 주입 후 4분(포식자 위협에 따른 회피반응 상태)동안의 행동을 녹화하였으며, 포식자 큐가 주입되는 30초 동안은 포식자 인식기간으로 설정하여 기록하지 않았다. 또한 행동실험이 끝난 모든 개체들의 STL은 디지털 버니어캘리퍼스를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
본 실험은 한국의 다양한 환경에서 흔하게 서식하는 양서류 종 중 하나인 북방산개구리Rana Dybowskii를 대상종으로 하였다(Yang et al., 2001). 실험에 사용된 모든 알은 2015년 3월 초에 서울특별시 노원구 불암산의 웅덩이와 서울특별시 종로구 인왕산의 계곡에서 채집하였다(Fig 1).
, 2001). 실험에 사용된 모든 알은 2015년 3월 초에 서울특별시 노원구 불암산의 웅덩이와 서울특별시 종로구 인왕산의 계곡에서 채집하였다(Fig 1).
안정기간이 끝나고 4분 후에 포식자 큐 5ml를 주입하였다. 포식자 큐는 올챙이 알을 채집했던 웅덩이에서 채집한 왕잠자리수채를 사용하였다. 왕잠자리 수채는 일반적으로 양서류 유생의 포식자로 잘 알려져 있다(Kim et al,, 2011) 실험에 사용한 왕잠자리수채는 5일 이상 북방산개구리 유생을 먹이로 포식한 개체이다.
데이터처리
우리는 노출된 농도에 따른 배아의 부화율, 부화 직 후유생들의 STL을 비교하기 위해 일원배치분산분석과 LSD 사후검증을 이용하였다. 금나노입자에 노출된 유생들과 그렇지 않은 유생들간의 부화 5일 째 STL을 비교하기 위하여 독립 t-test를 사용하였다 올챙이들의 포식자 큐 노출 전후의이동거리 비교는 대응 표본 t-test를 사용하였고, 금나노입자에 노출되지 않은 유생들의 포식자 큐 노출 전후의 이동거리차이와 금나노입자에 노출된 경험이 있는 유생들의 포식자 큐 노출 전후의 이동거리 차이 간의 비교는 독립 t-test를 사용하였다. 모든 통계적 분석은 SPSS Ver.
우리는 노출된 농도에 따른 배아의 부화율, 부화 직 후유생들의 STL을 비교하기 위해 일원배치분산분석과 LSD 사후검증을 이용하였다. 금나노입자에 노출된 유생들과 그렇지 않은 유생들간의 부화 5일 째 STL을 비교하기 위하여 독립 t-test를 사용하였다 올챙이들의 포식자 큐 노출 전후의이동거리 비교는 대응 표본 t-test를 사용하였고, 금나노입자에 노출되지 않은 유생들의 포식자 큐 노출 전후의 이동거리차이와 금나노입자에 노출된 경험이 있는 유생들의 포식자 큐 노출 전후의 이동거리 차이 간의 비교는 독립 t-test를 사용하였다.
이론/모형
A)을 사용하여 분석하였다. 포식자 큐 노출 전과 노출된 후의 이동거리측정은 Exthovision XT 9(Noldus Information Technology, Netherlands)을 사용하였다(Fig 5).
성능/효과
금나노입자에 노출되지 않은 0㎍과 비교하여 1, 50, 100 (㎍/mL)농도의 금나노입자에 노출된 북방산 개구리 알들은 50㎍그룹에서 85%로 상대적으로 높은 부화율을 보였지만 유의성이 나타나지는 않았다(1㎍: p=0.87, 50㎍: p=0.74, 100㎍: p=0.62, Fig6). 부화 직후 유생의 STL은 0㎍에서 8.
2346mm으로 나타났다. 농도가 높을수록 유생의 STL이 작아지는 경향이 있었지만, 통계적 유의성은 없었다(1㎍: p=0.83, 50㎍: p=0.73, 100㎍: p=0.12, Fig7). 부화 후 5일된 금나노입자에 노출된 유생들의 STL(15.
본 연구결과에 의하면 금나노입자에 노출되기 전의 활동량에서 금나노이온에 노출된 그룹과 그렇지 않은 그룹 간의 유의한 차이가 나타나지 않았다. 하지만 금나노입자에 노출되지 않은 그룹의 유생들과 노출된 유생의 그룹 간에는 포식자 큐에 대한 활동량 감소에 유의한 차이가 나타났다.
부화 직후 유생의 STL은 0㎍에서 8.6710±0.3387mm였으며 100㎍ 그룹에서 8.5770±0.2346mm으로 나타났다.
부화 후 5일된 금나노입자에 노출된 유생들의 STL(15.8510±2.1662mm)은 금나노입자에 노출되지 않은 유생들의 STL (14.7860± 2.1057mm) 과 비교하여 유의하게 작은 것으로 나타났다(Fig 8).
우리는 금나노입자의 생물영향평가를 위해 농도별 금나노입자에 노출된 북방산 개구리 배아의 부화율과 부화 12시간 후 STL평균을 비교, 분석한 결과 통계적 유의성을 발견하지 못했다. 즉, 실험에서 사용된 농도의 금나노입자는 북방산개구리 배아의 부화율과 부화 12시간 후 유생의 STL에 영향을 주지 않는다고 할 수 있다. Asharani et al.
포식자 큐에 대한 움직인 거리의 차이는 금나노입자에 노출된 그룹(28.6540±14.1731cm)이 금나노입자에 노출되지 않은 그룹(73.9191±17.6473cm)과 비교하여 유의하게 작은 것으로 나타났다(t=2.0, p<0.04, Fig 9).
본 연구결과에 의하면 금나노입자에 노출되기 전의 활동량에서 금나노이온에 노출된 그룹과 그렇지 않은 그룹 간의 유의한 차이가 나타나지 않았다. 하지만 금나노입자에 노출되지 않은 그룹의 유생들과 노출된 유생의 그룹 간에는 포식자 큐에 대한 활동량 감소에 유의한 차이가 나타났다. 즉, 금나노입자는 북방산개구리 유생의 외부자극이 없을 때 일반적인 상황에서 활동량에는 영향을 주지 않지만, 포식자 (외부자극)에 대한 회피반응 정도에 부정적 영향을 미치는 것으로 보인다.
후속연구
하지만 우리가 새롭게 제시한 유생의 생존가능성을 예측평가 해볼 수 있는 외부자극에 대한 행동학적 반응평가에서는 독성이 거의 없다는 기존의 연구 결과들과는 다른 결과를 보여주었다. 따라서 우리가 제시한 새로운 평가방법이 기존의 평가방법들과 함께 적절하게 이루어진다면 앞으로의 생물독성평가 신뢰도를 더욱 높일 수 있을 것이라고 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
금나노입자가 배아에 대한 독성이 거의 없다는 것을 알 수 있는 연구결과는 어떤 것들이 있는가?
우리는 금나노입자의 생물영향평가를 위해 농도별 금나노입자에 노출된 북방산 개구리 배아의 부화율과 부화 12시간 후 STL평균을 비교, 분석한 결과 통계적 유의성을 발견하지 못했다. 즉, 실험에서 사용된 농도의 금나노입자는 북방산개구리 배아의 부화율과 부화 12시간 후 유생의 STL에 영향을 주지 않는다고 할 수 있다. Asharani et al., (2011)은 금나노 입자의 크기에 따른 독성 차이를 알아보기 위하여 0, 10, 25, 50, 75, 100㎍/mL 농도의 금나노입자에 D. rerio 수정란을 부화시킨 결과 금나노 농도 증가에 따른 유의한 부화율과 유생의 치사율의 변화를 발견하지 못했다. 또한 토끼를 이용한 in vitro 실험에서도 별다른 독성이 나타나지 않았다(BaKri et al., 2008).
나노물질이 포함된 소비제품들은 몇 개나 되는가?
, 2012a). 실제로 우리 주변에 나노물질이 포함된 소비제품들은 1,000여개 이상으로 알려져 있다. 이러한 나노제품들이 증가함에 따라 불가피하게 제조, 사용, 및 처리하는 과정 중에 환경으로 유출될 가능성이 부각되고 있다(Lee and An, 2010; Scholars et al.
나노제품들이 증가하면서 생긴 문제는 무엇인가?
실제로 우리 주변에 나노물질이 포함된 소비제품들은 1,000여개 이상으로 알려져 있다. 이러한 나노제품들이 증가함에 따라 불가피하게 제조, 사용, 및 처리하는 과정 중에 환경으로 유출될 가능성이 부각되고 있다(Lee and An, 2010; Scholars et al., 2011; Zhu et al.
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