선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 대표적인 식물성 단백질원인 대두단백질을 활용하여 아임계수 가수분해에서 중요한 인자인 단백질의 초기농도, 반응온도, 반응시간의 영향을 연구하여 대두단백질로부터 아미노산을 생산할 수 있는 조건을 최적화하고자 하였다.
- 최근 아임계수 가수분해는 전통적인 단백질 가수분해법의 대체방법으로서 관심을 받고 있으며, 고단백질 원으로부터 아미노산을 회수하는데 효과적인 공정이 될 수 있을 것으로 기대되고 있다. 본 연구에서는 대표적인 식물성 단백질원인 분리대두단백질을 선택하여 대두단백질의 아임계수 가수분해에서 가장 중요한 인자인 대두단백질의 초기농도, 반응온도, 반응시간의 영향을 연구하여 대두단백질로부터 아미노산을 생산할 수 있는 조건을 최적화하고자 하였다. 대두단백질 수열분해액의 실온에서 pH는 200℃에서 20분간 처리했을 때 pH는 7.
제안 방법
- 이와 같은 결과들은 온도가 높을수록 수율은 낮아지고 그 대신 처리시간은 현저히 짧아진다는 사실을 염두고 최적 조건을 설정하여야 한다는 것을 의미한다. 43% 이상의 아미노산 수율과 최대의 단백질 가수분해도를 얻을 수 있는 반응조건을 구하기 위해 최적화를 하였다. 그 결과 262.
- OPA 시약을 시험관에 3 mL 씩 분주하고 blank (증류수), standard (serine), sample (희석된 가수분해물)을 각각 400 µL씩 투입하여 5초간 교반한 후 정확히 2분간 반응시키고 340 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식과 같이 계산하였다(15).
- 분리대두단백질은 증류수에 고속 임펠러 균질기(HG-15A, Daihan Scientific, Wonju, Korea)를 사용하여 5-15% 농도로 분산시켰다. 단백질 현탁액 1 L를 반응기에 넣고 밀폐한 다음 배기밸브를 열어놓은 상태에서 가열하여 현탁액의 온도가 80℃에 도달했을 때 2 MPa의 질소가스를 약 1분간 퍼지한 다음 모든 밸브를 닫고 설정온도로 가열하였다. 이때 반응기 내부 압력은 설정 온도에서 물의 포화증기압보다 약간 높은 압력을 유지하였고, 15-20분 이내에 설정온도(230-270℃)에 도달하게 가열하였다.
- 대두단백질 가수분해 장치에서 채취한 가수분해물을 ice bath에서 실온으로 냉각한 후 분광광도계(Genesys 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China)로 600 nm에서 흡광도를 측정한 후 탁도(turbidity)의 지표로 나타내었으며, 가수분해물을 4℃에서 12시간 정치한 후 단백질의 현탁 상태를 관찰하였다.
- 대두단백질의 초기농도가 수열분해에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 반응온도는 250℃, 반응시간 20분으로 고정한 조건에서 ISP 농도를 5-15% 범위에서 변화시키면서 아임계수 처리에 의한가수분해도(DH)와 아미노산수율(YAA)을 살펴보았다. Fig.
- 장치는 Reaction Engineering사 (Anyang, Korea)에 의뢰하여 자체 제작하였으며 고압반응기는 스테인레스강으로 제작하였고 용량은 2L이다. 반응기의 외벽에 가열망태를 설치하여 전기적으로 가열하였으며, 내부에는 코일형 냉각기와 U자형 교반기를 설치하였다.
- 분리대두단백질의 아임계수에 의한 수열 가수분해는 회분식 아임계수 장치를 이용하였다(Fig. 1). 장치는 Reaction Engineering사 (Anyang, Korea)에 의뢰하여 자체 제작하였으며 고압반응기는 스테인레스강으로 제작하였고 용량은 2L이다.
- 아임계처리에 의한 분리대두단백질 가수분해물의 수용성 단백질 함량을 측정하기 위하여 분광광도계(Genensys 10S UV-Vis, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 200-440 nm 범위의 흡광도에서 스펙트럼을 측정하였다.
- 아임계수 처리에 있어서 가장 중요한 영향 인자는 기질의 초기 농도, 처리온도 및 처리시간이다. 앞선 실험에서 아미노산 수율이 가장 높았던 분리대두단백 농도 10%에서 아임계수의 온도범위 230-270℃, 처리시간 10-50분의 범위로 실험조건을 달리하여 실시한 후 표면반응 분석법에 의해 최적 조건을 구하였다. 각 실험조건에 가분분해도와 아미노산 수율을 Table 1에 나타내었다.
- 중심합성계획법에서는 독립변수로 온도(230-270℃, X1), 반응시간(10-50분, X2)을 5개의 수준으로 부호화하여 13개의 실험을 설계하였다(Table 1). 또한 대두분리 단백질 가수분해의 특성에 관련된 종속변수(Y)는 가수분해해도(DH, Y1), 유리 아미노산 수율 (AA Yield, Y2)으로 하였으며, 모든 실험은 3회 반복 측정하여 평균값을 회귀분석에 사용하였다.
- 현탁액의 온도가 설정온도에 도달한 시점을 반응시간 시작점으로 하여 온도를 ±1℃ 범위 내에서 일정하게 유지하면서 일정시간(10-30분) 가열하였다.
대상 데이터
- 27%이었다. 모든 분석용 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Merck (Darmstadt, Germany) 등으로부터 구입하였다.
- 본실험에 사용한 분리대두단백질(Suihua Jinlong Vegetable Oil Co. Ltd., Heilongjiang, China)의 조성은 단백질 82.7%, 조회분 5.19%, 조지방 2.27%이었다. 모든 분석용 시약은 Sigma-Aldrich (St.
- 1). 장치는 Reaction Engineering사 (Anyang, Korea)에 의뢰하여 자체 제작하였으며 고압반응기는 스테인레스강으로 제작하였고 용량은 2L이다. 반응기의 외벽에 가열망태를 설치하여 전기적으로 가열하였으며, 내부에는 코일형 냉각기와 U자형 교반기를 설치하였다.
데이터처리
- 는 교호 작용 계수(interaction coefficient)이다. 2차회귀모형의 적합도의 질(quality of fit)은 상관관계 계수(correlation coefficient, R2)로 표현하였고, 각 인자들의 종속변수에 대한 유의성은 p-value로 판단하였다.
- )을 5개의 수준으로 부호화하여 13개의 실험을 설계하였다(Table 1). 또한 대두분리 단백질 가수분해의 특성에 관련된 종속변수(Y)는 가수분해해도(DH, Y1), 유리 아미노산 수율 (AA Yield, Y2)으로 하였으며, 모든 실험은 3회 반복 측정하여 평균값을 회귀분석에 사용하였다. 회귀분석에 의한 최적조건의 예측은 SAS software system (Ver.
이론/모형
-
단백질의 가수분해도
가수분해도(degree of hydrolysis, DH)는 Nielsen 등의 방법(14)에 따라 ortho-phthalaldehyde (OPA) 용액으로 가수분해액을 유도체화하여 340 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. OPA 시약을 시험관에 3 mL 씩 분주하고 blank (증류수), standard (serine), sample (희석된 가수분해물)을 각각 400 µL씩 투입하여 5초간 교반한 후 정확히 2분간 반응시키고 340 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식과 같이 계산하였다(15).
- 대두분리 단백질 가수분해조건에 대하여 중심합성계획법(central composite design)을 사용하여 실험설계 하였으며, 가수분해조건을 최적화하기 위해서 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 사용하였다.
- 45 µm PTFE 막여과기(Sartourius, Gottingen, Germany)로 여과하여 냉동보관 하면서 분석용 수용액 시료로 사용하였다. 수용액 시료 중의 고형분 함량은 105℃ 건조법(11), 총수용성 단백질 함량은 bovine serum albumin (BSA)를 표준물질로 하여 Lowry법(12), 유리아미노산 함량은 닌히드린 반응에 의하여 글루탐산을 표준물질로 하여 분광분석법으로 측정하였다(13). 아미노산 수율은 다음 식에 의해 계산하였다.
성능/효과
- 각 실험조건에 가분분해도와 아미노산 수율을 Table 1에 나타내었다. 250℃에서 10분 처리했을 때 가수분해도와 아미노산 수율이 가장 낮았으며, 각각 13.3% 및 31.6%를 나타내었다. 처리온도가 상승하고 처리시간이 길수록 가수분해도와 아미노산 수율은 증가하였으며, 가수분해도는 온도 264.
- 단백질에 포함되어 있는 방향족 아미노산인 페닐알라닌(Phe), 타이로신(Tyr), 트립토판(Trp)은 280 nm부근에서 자외선을 흡수하므로 동일한 아미노산 분포를 가진 단백질 용액의 280 nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례한다. Fig. 4에 나타낸 바와 같이 대두단백의 아임계수 처리한 열수분해액의 UV 흡수펙트라를 측정한 결과 최대 흡광도는 285 nm에서 나타났으며, 온도가 증가함에 따라 흡수강도는 증가하였다. 즉, 200℃ 아임계수로 20분간 처리한 수열분해액의 최대 흡수강도는 0.
- )을 살펴보았다. Fig. 5에 나타낸 것과 같이 초기농도 10% (w/v)일 때 가수분해도 및 아미노산 수율이 각각 16.2% 및 22.3%로 가장 우수하였으며, 특히 초기농도 15% (w/v)일 때 가수분해도는 10.1%로 현저히 감소하여 가수분해도는 초기 단백질 농도에 크게 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다. Pinkowska와 Oliveros(10)는 ISP 농도 5-15%의 현탁액을 반응온도 140-300℃ 범위의 아임계수로 가수분해 했을 때, 10% 농도에서 260℃의 온도로 14분간 처리하였을 때 가장 높은 수율을 나타내었고 10% 이상의 농도에서는 아미노산 생산이 저해되어 본 연구와 유사한 결과를 보였다.
- 43% 이상의 아미노산 수율과 최대의 단백질 가수분해도를 얻을 수 있는 반응조건을 구하기 위해 최적화를 하였다. 그 결과 262.59℃의 온도, 37.65분의 처리시간에서 단백질 가수분해도와 아미노산 수율은 각각 24.06%, 43.49%로 계산되었다.
- 독립변수는 온도와 시간 모두 가수분해도와 아미노산 수율에 유의한 영향(p<0.01)을 미치는 것으로 나타났다.
- 또한 모델 단백질로서 BSA로 부터 아미노산 생성반응을 연구하였을 때 아미노산의 수율은 반응 온도와 처리시간에 따라 강하게 영향을 받았으며 고온에서는 처리시간이 짧은 조건일 때 최대수율을 얻었다.
- 3%로 가장 우수하였다. 또한 반응온도 200-220℃ 범위에서는 가수분해도와 아미노산 수율은 서서히 증가하였으나 230-250℃ 영역에서는 급격히 증가하였으며 250℃ 이상에서는 다시 완만히 증가하는 경향을 보여 250℃ 이상에서 아미노산 분해속도는 단백질 분해속도를 초과하였다. 표면반응분석법으로 예측한 결과 268℃, 처리시간 35분에서 최적 아미노산 수율 43.
- 반응온도 220℃까지는 수열분해액은 분산상태를 이루었으나 230℃ 이상에서는 분산상태가 파괴되고 단백질이 분리되어 하부에 침강층을 이루었으며 240℃ 이상에서는 이 단백질 층이 현저히 감소하였다. 반응온도는 250℃, 반응시간 20분으로 고정한 조건에서 대두현탁액의 초기농도가 수열분해에 미치는 영향을 살펴본 결과 초기농도 10% (w/v)일 때 가수분해도 및 아미노산 수율이 각각 16.2% 및 22.3%로 가장 우수하였다. 또한 반응온도 200-220℃ 범위에서는 가수분해도와 아미노산 수율은 서서히 증가하였으나 230-250℃ 영역에서는 급격히 증가하였으며 250℃ 이상에서는 다시 완만히 증가하는 경향을 보여 250℃ 이상에서 아미노산 분해속도는 단백질 분해속도를 초과하였다.
- 7에 나타내었다. 온도 200-220℃ 범위에서는 가수분해도가 서서히 증가하다가 230-250℃ 영역에서는 급격히 증가하였으며 250℃ 이상에서는 완만히 증가하는 경향을 보였다. 반응온도가 증가함에 따라 가수분해도와 아미노산 수율이 증가하는 것은 대두단백질의 용해도와 물의 이온 적이 증가하여 H+ 와 OH− 이온의 농도가 매우 높아지면서 산 또는 알카리 촉매 반응이 촉진되어 펩티드 결합이 파괴되기 때문이다.
- 그림에서 대두 단백농도를 10%로 고정한 후, 반응온도와 처리 시간이 가수분해도에 대한 영향을 나타내었다. 이 때, 반응 온도가 증가할수록 그리고 처리시간이 증가할수록 가수분해도는 증가하는 경향을 나타내었다. 정준분석(canonical analysis)에 의해 예측된 정상값은 최대값을 보이고 있으며 이 때 반응온도 264.
- 9%의 최대값을 얻을 수 있었다. 이론적으로 최대로 얻을 수 있는 분리대두단백질의 가수분해도를 결정하기 위하여 Fountoulaki와 Lahm의 방법(27)으로 산분해 했을 때 가수분해도는 99%로 분리대두단백질이 거의 완전히 분해된다는 것을 알 수 있었다.
- 4에 나타낸 바와 같이 대두단백의 아임계수 처리한 열수분해액의 UV 흡수펙트라를 측정한 결과 최대 흡광도는 285 nm에서 나타났으며, 온도가 증가함에 따라 흡수강도는 증가하였다. 즉, 200℃ 아임계수로 20분간 처리한 수열분해액의 최대 흡수강도는 0.43, 210℃인 경우 0.49이였으나 230℃인 경우에는 0.65로 크게 증가하였으며, 250℃인 경우 최대 흡수강도 0.74를 나타내었다. 한편 270℃인 경우에는 오히려 감소하여 230℃ 경우와 거의 같은 최대흡광도를 나타내었다.
- 6%를 나타내었다. 처리온도가 상승하고 처리시간이 길수록 가수분해도와 아미노산 수율은 증가하였으며, 가수분해도는 온도 264.1℃, 처리시간 44.1분에서 24.9%의 최대값을 얻을 수 있었다. 이론적으로 최대로 얻을 수 있는 분리대두단백질의 가수분해도를 결정하기 위하여 Fountoulaki와 Lahm의 방법(27)으로 산분해 했을 때 가수분해도는 99%로 분리대두단백질이 거의 완전히 분해된다는 것을 알 수 있었다.
- 또한 반응온도 200-220℃ 범위에서는 가수분해도와 아미노산 수율은 서서히 증가하였으나 230-250℃ 영역에서는 급격히 증가하였으며 250℃ 이상에서는 다시 완만히 증가하는 경향을 보여 250℃ 이상에서 아미노산 분해속도는 단백질 분해속도를 초과하였다. 표면반응분석법으로 예측한 결과 268℃, 처리시간 35분에서 최적 아미노산 수율 43.5%를 얻을 수 있었다.
- 가수분해도는 반응시간 20분까지는 완만히 증가하였으나 그 이후는 거의 일정 하였다. 한편 아미노산 수율은 반응시간 30분까지 증가하였으나 그 이상의 반응시간에서는 생성된 아미노산이 분해되어 수율이 감소하는 경향을 나타내었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.