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문제 정의
- 본 실험에서는 4주간 HFD를 쥐에게 섭취하게 하여 비만 상태를 유발시킨 후 곽향 추출물을 투여하여 항비만 효과를 확인하고자 하였다. 고지방식이를 섭취하여 비만이 유도된 HFD군의 경우 일반식이 섭취군에 비하여 체중이 유의하게 증가되었으며 고지방식이와 곽향 추출물을 함께 투여한 실험군에서는 HFD군에 비해 체중이 유의하게 감소되었다.
- 이에, 본 연구에서는 고지방식이로 비만이 유도된 쥐에서 곽향 추출물의 항비만 효과와 기전을 관찰하기 위하여 체중, 식이섭취량 및 식이효율 변화, 체지방의 변화, 지방 세포의 크기 변화, 간 조직의 지방 침착, 지방합성 인자 발현 및 혈중 leptin 농도를 평가하였다.
제안 방법
- 비만을 유도하기 위하여 4주 동안 정상대조군을 제외한 나머지 군은 60% 고지방식이(high fat diet, HFD)를 섭취하였다. 4주 뒤, 비만 유도 쥐들은 무작위로 군당 5마리씩 나누었다. 실험군의 설정은 일반식이를 섭취하면서 생리식염수를 경구투여 받는 정상대조군(normal fat diet, NFD군), 고지방식이를 섭취하면서 생리식염수를 경구투여 받는 비만대조군(HFD군), 고지방식이를 섭취하면서 곽향 추출물을 경구투여 받는 실험군(Agastache rugosa [AR]군), 총 3군으로 나누어 배정하였다.
- Rotary microtome으로 4 μm 간격으로 연속절편을 제작하여 탈파라핀한 후 H&E 염색을 실시하였다.
- 동물 희생 전 12시간 동안 절식시키고 물만 제공하였다. Zoletil로 마취한 후 안와채혈법을 통하여 혈액을 채취하였고, 즉시 부고환 지방 조직과 간 조직을 적출하였다. 적출한 부고환 지방 조직은 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다.
- 그 다음 anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 또는 anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology) 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켜서 enhanced chemiluminescence detection reagent (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 시각화하였다. 각 밴드의 밀도는 Image J program (NIH) 으로 측정하였다.
- Polyvinylidene fluoride membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 이동시키고, 1차 항체인 anti-\(\beta\)-actin, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)- gamma를 4oC에서 18시간 동안 반응시켰다. 그 다음 anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 또는 anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology) 2차 항체를 실온에서 2시간 반응시켜서 enhanced chemiluminescence detection reagent (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 시각화하였다. 각 밴드의 밀도는 Image J program (NIH) 으로 측정하였다.
- 물과 사료는 제약 없이 섭취하게 하였다. 비만을 유도하기 위하여 4주 동안 정상대조군을 제외한 나머지 군은 60% 고지방식이(high fat diet, HFD)를 섭취하였다. 4주 뒤, 비만 유도 쥐들은 무작위로 군당 5마리씩 나누었다.
- 실험동물은 생리식염수에 녹인 곽향 추출물 200 mg/kg을 200 μl씩 4주 동안 경구투여하였다. 사료섭취량과 체중은 일주일에 2회씩 일정시간에 측정하였으며, 식이효율은 체중 증가량을 섭취량으로 나눈 값으로 계산하였다.
- 사육실 온도는 20oC±2oC, 상대습도 50%±5%를 유지하였고, 조명은 12시간 간격으로 조절하였다.
- 4주 뒤, 비만 유도 쥐들은 무작위로 군당 5마리씩 나누었다. 실험군의 설정은 일반식이를 섭취하면서 생리식염수를 경구투여 받는 정상대조군(normal fat diet, NFD군), 고지방식이를 섭취하면서 생리식염수를 경구투여 받는 비만대조군(HFD군), 고지방식이를 섭취하면서 곽향 추출물을 경구투여 받는 실험군(Agastache rugosa [AR]군), 총 3군으로 나누어 배정하였다. 실험동물은 생리식염수에 녹인 곽향 추출물 200 mg/kg을 200 μl씩 4주 동안 경구투여하였다.
- 실험동물은 생리식염수에 녹인 곽향 추출물 200 mg/kg을 200 μl씩 4주 동안 경구투여하였다.
- Rotary microtome으로 4 μm 간격으로 연속절편을 제작하여 탈파라핀한 후 H&E 염색을 실시하였다. 염색된 절편은 광학현미경(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA)으로 관찰하였고, Image J program(NIH, Bethesda, MD, USA)으로 정량하였다.
- Zoletil로 마취한 후 안와채혈법을 통하여 혈액을 채취하였고, 즉시 부고환 지방 조직과 간 조직을 적출하였다. 적출한 부고환 지방 조직은 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다. 채취된 혈액은 4,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
- 채취된 혈액은 4,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 내 leptin 농도를 kit 시약으로 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 곽향(Agastache rugose Kuntze)은 배초향의 지상부를 정도물산(Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 30 g의 곽향을 900 ml의 증류수와 함께 24시간 동안 실온에서 추출하고 여과하여 회전식 감압농축기를 사용하여 감압 농축하였다.
- 실험동물은 5주령의 수컷 C57BL/6 mice (20∼22 g)를 라온바이오(Yongin, Korea)에서 구입하여 1주일간 일반식이로 적응시켰다.
데이터처리
- 실험결과는 평균 및 표준편차로 나타내었고, GraphPad PRISM 5 program ver 2.00 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA (analysis of variance)로 분석한 후 Dunnett’s multiple comparisons test로 유의성 검증을 하였다.
이론/모형
- Bradford method를 이용하여 정량한 단백질은 20 μg씩 SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의해 분리시켰다.
성능/효과
- AR군(32.4±1.4 g)은 HFD군과 비교했을 때, 11.7% 체중이 통계적으로 유의하게 감소하였다.
- 2 g의 체중 증가량을 나타내어 NFD군과 유사하였다. HFD군은 NFD군에 비하여 식이섭취량이 21% 유의적으로 감소하였다. AR군은 고지방식이를 섭취함으로써 감소한 식이섭취량을 24.
- 고지방식이로 비만이 유도된 HFD군(36.7±0.5 g)은 NFD군(28.1±3.0 g)에 비해 체중이 유의하게 높아진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 본 실험에서는 4주간 HFD를 쥐에게 섭취하게 하여 비만 상태를 유발시킨 후 곽향 추출물을 투여하여 항비만 효과를 확인하고자 하였다. 고지방식이를 섭취하여 비만이 유도된 HFD군의 경우 일반식이 섭취군에 비하여 체중이 유의하게 증가되었으며 고지방식이와 곽향 추출물을 함께 투여한 실험군에서는 HFD군에 비해 체중이 유의하게 감소되었다. 뿐만 아니라 HFD군에 비해 식이섭취량이 유의하게 감소되어 식이효율은 AR군에서 유의성 있게 감소되었다.
- 4). 곽향 추출물을 투여한 AR 군에서는 HFD군에 비하여 지방 변성이 거의 나타나지 않아 간 조직내 지방의 침착이 적게 일어난 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 PPAR-gamma의 발현 량을 감소시키는 것은 지방 세포의 합성을 억제하기 때문에 비만 치료에 도움이 될 수 있다. 곽향 추출물을 투여한 쥐의 지방 조직에서의 PPAR-gamma의 발현은 고지방식이 섭취군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 따라서 곽향 추출물은 지방합성을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다.
- 그로 인하여 체중 증가량을 식이섭취량으로 나눈 값인 식이효율은 NFD군에서 0.75±0.05, HFD군에서는 3.00±0.17을 나타내어 유의적으로 증가하였다.
- 곽향 추출물을 투여한 쥐의 지방 조직에서의 PPAR-gamma의 발현은 고지방식이 섭취군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 따라서 곽향 추출물은 지방합성을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다.
- 비만은 지방간의 주된 원인으로 지방간이 생길 경우 피로감, 전신 권태감과 우측 상복부 통증을 유발할 수 있으며 지방간염과 간경변까지 유발될 수 있다19-21). 본 실험에서는 고지방식이로 비만이 유도된 군에서는 간 조직의 간 세포 핵 주변에서 지방 침착으로 지방변성이 나타난 것을 확인할 수 있었다. 그러나 곽향 추출물을 투여한 AR군에서는 간 조직 내 지방 공포가 줄어들어 정상적으로 회복된 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 비만한 쥐에게 주사하면 식이섭취량이 줄어들고 대사량이 증가하고 체중이 감량되는 것이 보고되었다25). 본 실험에서는 고지방식이로 비만이 유도된 쥐에 곽향 추출물을 투여하여 체중 감소 및 지방세포의 감소를 관찰할 수 있었다. 이전 보고에 따르면 체지방의 감소에 따라 leptin 분비량도 감소되는 것이 일반적이나 곽향 추출물 투여군에서는 leptin 분비량이 고지방식이군과 유사하게 유지되었다.
- 부고환 지방 조직을 조직학적으로 분석하여 지방 세포의 크기 변화를 확인했을 때, NFD군에 비하여 HFD군에서 지방 세포의 크기가 월등하게 커진 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3A). AR군은 고지방식이 섭취로 인하여 증가된 지방 세포의 크기를 감소시켜서 정상수준으로 회복시켰다.
- 부고환 지방 조직의 무게는 식이효율이 더 높았던 HFD군에서 1.72±0.19g을 나타내어 일반식이를 섭취했던 NFD군(0.34±0.05g)에 비하여 약 5배 정도 증가하였다 (Fig. 2).
- 고지방식이를 섭취하여 비만이 유도된 HFD군의 경우 일반식이 섭취군에 비하여 체중이 유의하게 증가되었으며 고지방식이와 곽향 추출물을 함께 투여한 실험군에서는 HFD군에 비해 체중이 유의하게 감소되었다. 뿐만 아니라 HFD군에 비해 식이섭취량이 유의하게 감소되어 식이효율은 AR군에서 유의성 있게 감소되었다. 따라서 곽향은 식이섭취량을 감소시킴으로써 체중을 감소시키는 것을 확인하였다.
- 이상의 결과를 통해 곽향은 비만 쥐의 체중과 체지방량을 감소시키고, 지방세포의 비대 및 간 조직 내 지방 침착을 정상적으로 회복시키며, 지방합성 인자인 PPAR-gamma를 감소시켰다. 뿐만 아니라, leptin의 혈중 농도를 유지시켜 식이섭취량을 감소시키는 것을 확인하였다. 결론적으로 곽향은 지방합성 인자 조절 및 식이 섭취량을 감소시키는 효능을 가지고 있으므로, 비만증을 개선하고 예방하는 한약재로 응용할 가치가 있다고 생각된다.
- 뿐만 아니라 HFD군에서 증가된 지방세포의 크기는 곽향추출물을 투여한 군에서 정상수준으로 회복되었다. 이를 통해 체지방량이 곽향 추출물 투여를 통해 유의성 있게 감소하였고 조직학적으로도 이를 확인할 수 있었다. 이는 곽향이 비만의 기준이 되는 체지방량을 감소시키는 효능이 있음을 알 수 있다.
- 이상의 결과를 통해 곽향은 비만 쥐의 체중과 체지방량을 감소시키고, 지방세포의 비대 및 간 조직 내 지방 침착을 정상적으로 회복시키며, 지방합성 인자인 PPAR-gamma를 감소시켰다. 뿐만 아니라, leptin의 혈중 농도를 유지시켜 식이섭취량을 감소시키는 것을 확인하였다.
- 게다가 고지방 상태는 비만의 주요한 위험 요소인 심혈관계 질환 및 당뇨병, 만성염증상태를 유발하는 주요한 원인이 된다고 보고되어 있기 때문에 체지방을 줄이는 것은 비만을 억제하는 데 중요한 역할을 할 수 있다17). 체지방량 증가는 곽향 추출물 투여 후 확연하게 억제됨을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 HFD군에서 증가된 지방세포의 크기는 곽향추출물을 투여한 군에서 정상수준으로 회복되었다.
- 혈중 leptin 농도는 NFD군에서 1.86±0.2 ng/ml를 나타낸 반면, HFD군에서는 2.98±0.16 ng/ml로 측정되어 유의성 있게 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
후속연구
- 뿐만 아니라, leptin의 혈중 농도를 유지시켜 식이섭취량을 감소시키는 것을 확인하였다. 결론적으로 곽향은 지방합성 인자 조절 및 식이 섭취량을 감소시키는 효능을 가지고 있으므로, 비만증을 개선하고 예방하는 한약재로 응용할 가치가 있다고 생각된다.
- 이는 또한 곽향 추출물이 식이섭취량을 감소시킨 것과도 일관된 결과라고 볼 수 있으며, 체중감소, 지방세포 감소, 식이섭취량 및 leptin 분비량 등의 결과를 연관지어 곽향이 leptin의 분비량을 촉진 또는 유지하여 식이섭취량을 감소시켰다고 유추해볼 수 있다. 향후 곽향 추출물에 의한 leptin 유지 기전에 대한 심도 있는 연구가 필요할 것이다.
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