배초향 추출물 및 분획별 생리활성 물질의 분포양상을 검정하기 위해 파이토케미컬 검색을 한 결과, 플라보노이드확인시험에서 헥세인을 제외한 에틸아세테이트 및 부탄올 분획에서 양성반응을 확인하였다. 배초향 추출물의 극성에 따른 분획-헥세인, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획의 산화방지 정도를 평가한 결과, 폴리페놀 함량, DPPH 라디칼 소거 및 환원력 실험에서 에틸아세테이트 분획이 다량의 폴리페놀을 함유하며 강력한 라디칼 소거 및 환원능력을 나타냈다. 또한 배초향 에틸아세테이트 분획의 항염 활성을 평가한 결과, 지방질다당류로 활성화된 BV-2 microglia에서 발생하는 과량의 산화질소(II) 생성을 억제하였을 뿐 아니라, 산화질소(II) 생성 효소인 iNOS 및 염증성 사이토카인 IL-6의 발현을 억제함을 확인하였다. 강력한 산화방지 및 항염증 활성을 나타내는 배초향 에틸아세테이트 분획내의 활성물질을 확인하고자 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 배초향의 산화방지 물질로 잘 알려져 있는 로스마린산이 배초향 에틸아세테이트 분획에 함유되어 있음을 확인하였다.
배초향 추출물 및 분획별 생리활성 물질의 분포양상을 검정하기 위해 파이토케미컬 검색을 한 결과, 플라보노이드 확인시험에서 헥세인을 제외한 에틸아세테이트 및 부탄올 분획에서 양성반응을 확인하였다. 배초향 추출물의 극성에 따른 분획-헥세인, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획의 산화방지 정도를 평가한 결과, 폴리페놀 함량, DPPH 라디칼 소거 및 환원력 실험에서 에틸아세테이트 분획이 다량의 폴리페놀을 함유하며 강력한 라디칼 소거 및 환원능력을 나타냈다. 또한 배초향 에틸아세테이트 분획의 항염 활성을 평가한 결과, 지방질다당류로 활성화된 BV-2 microglia에서 발생하는 과량의 산화질소(II) 생성을 억제하였을 뿐 아니라, 산화질소(II) 생성 효소인 iNOS 및 염증성 사이토카인 IL-6의 발현을 억제함을 확인하였다. 강력한 산화방지 및 항염증 활성을 나타내는 배초향 에틸아세테이트 분획내의 활성물질을 확인하고자 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 배초향의 산화방지 물질로 잘 알려져 있는 로스마린산이 배초향 에틸아세테이트 분획에 함유되어 있음을 확인하였다.
To evaluate the antioxidant activity of hexane, ethyl acetate, and butanol fractions obtained from Agastache rugosa extract, we measured the total polyphenol levels, DPPH radical scavenging activity, and reducing power. The ethyl acetate fraction of A. rugosa (AREA) displayed high phenolic levels, p...
To evaluate the antioxidant activity of hexane, ethyl acetate, and butanol fractions obtained from Agastache rugosa extract, we measured the total polyphenol levels, DPPH radical scavenging activity, and reducing power. The ethyl acetate fraction of A. rugosa (AREA) displayed high phenolic levels, potent DPPH radical scavenging effect, and powerful reducing power. In addition, we examined the ability of AREA to inhibit nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated BV-2 microglia. AREA suppressed NO production and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and downregulated interleukin-6 (IL-6) mRNA level in LPS-stimulated BV-2 microglia. Furthermore, we detected rosmarinic acid in AREA by HPLC, which suggested that rosmarinic acid could be one of the bioactive materials responsible for the antioxidant and anti-inflammatory activities of AREA. These results suggested that AREA may be a good source of functional foods with antioxidant and anti-inflammatory activities.
To evaluate the antioxidant activity of hexane, ethyl acetate, and butanol fractions obtained from Agastache rugosa extract, we measured the total polyphenol levels, DPPH radical scavenging activity, and reducing power. The ethyl acetate fraction of A. rugosa (AREA) displayed high phenolic levels, potent DPPH radical scavenging effect, and powerful reducing power. In addition, we examined the ability of AREA to inhibit nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated BV-2 microglia. AREA suppressed NO production and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and downregulated interleukin-6 (IL-6) mRNA level in LPS-stimulated BV-2 microglia. Furthermore, we detected rosmarinic acid in AREA by HPLC, which suggested that rosmarinic acid could be one of the bioactive materials responsible for the antioxidant and anti-inflammatory activities of AREA. These results suggested that AREA may be a good source of functional foods with antioxidant and anti-inflammatory activities.
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문제 정의
강력한 산화방지 활성을 나타내는 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)에 대해 세포에서 발생하는 라디칼 생성에는 어떤 영향을 미치는 지 알아보기로 하였다. 지방질다당류(LPS)로 처리한 BV-2 microglia에서 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)의 산화질소(II) 생성 정도를 평가한 결과, 지방질다당류 단독처리군에 비해 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)은 농도 의존적으로 산화질소(II) 생성 억제활성을 나타내었다(Fig.
또한 폴리페놀 함량 측정법은 다양한 페놀성 물질들이 전자를 제공함으로써 기질을 환원시키는 산화방지 능력을 기반으로 하는 것으로 폴리페놀 함량이 높다는 것은 산화 방지 능력이 강하다는 것을 의미한다(27,28). 따라서 배초향 추출물 및 각 분획에 함유된 총 폴리페놀의 함량을 측정함으로써 산화방지 활성이 강한 분획을 찾고자 하였다(Table 2). 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)에서 갈산으로 환산한 폴리페놀 함량이 186 mg/g인 반면, 헥세인(ARH) 및 뷰탄올(ARBu) 분획은 각각 31 mg/g 및 73 mg/g으로 확인되어 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)이 강한 산화방지 활성을 가지는 것으로 추정하였다.
Microglia는 뇌에 존재하는 큰 포식세포로서 일차면역체계를 담당하고 있지만(17), 다양한 면역자극에 의해 활성화되면 기능적 특성이 변화하여 산화질소(II) (nitric oxide, NO)와 같은 활성질소종, 활성산소종 및 염증성 사이토카인 등을 분비할 뿐 아니라, 만성염증상태와 같은 지속적인 면역 자극상태에서는 뉴런의 손상을 유도하는 것으로 알려져 있다(18,19). 따라서 본 연구에서는 배초향의 극성에 따른 분획별 산화방지 활성을 평가하고, 그 중 강력한 산화방지 효과를 나타내는 분획에 대해 지방질다당류(lipopolysaccharide, LPS)로 유도된 BV-2 microglia에서의 산화질소(II) 및 염증인자 생성에 대한 영향을 평가하여 배초향의 산화방지 및 항염증 기능성 식품소재를 위한 기초자료로 제공하고자 한다.
플라보노이드(35), 리그난(36), 터펜(37) 및 알칼로이드(38) 등을 포함한 천연물 유래 항염증 분획 및 화합물들의 대부분은 iNOS 발현을 저해하여 과도한 산화질소(II) 생성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 연구에서는 지방질 다당류로 활성화된 BV-2 microglia에서 산화질소(II) 생성억제효과를 나타낸 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)에 대해 산화질소(II) 생성효소인 iNOS의 발현에 미치는 영향을 평가하고자 iNOS 단백질 및 mRNA level을 측정하였다. Fig.
1B에서 나타난 것처럼 배초향 에틸아세테이트 분획 (AREA) 처리군의 경우, 지방질다당류 단독처리군에 비해 농도의존적으로 iNOS 단백질 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있으며, β-actin 의 단백질 수준은 변화 없음을 확인하였다. 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)이 iNOS 단백질 발현에 대해 억제활성을 나타내었기에, 단백질 생성 전단계인 mRNA 단계에 대해서도 영향을 미치는 지를 확인 하고자 하였다. 지방질다당류 단독처리군에 비해 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA) 25 μg/mL에서 현저히 감소된 iNOS mRNA level을 확인하였으나, β-actin mRNA level의 변화는 나타나지 않았다(Fig.
제안 방법
12시간 배양 후, 배양액을 제거하고 PBS로 세척 후 신속히 TRIzol® (Life Technologies, Frederick, MD, USA)을 가하여 세포를 lysis 시킨 뒤, 제품설명서에 따라 RNA를 분리하였다.
BV-2 microglia (5×105 cells/60 mm dish)를 (−)LPS, (+)LPS, 시료 처리군으로 나누어 처리하였다.
HPLC 분석을 위해 컬럼은 Zorbax-SB C18(5 μm, 4.6×250 mm, Agilent)를 이용하였고, 이동상은 0.1% 아세트산을 함유한 물과 0.1% 아세트산을 함유한 아세토니트릴을 기울기 용리법(80:20→20:80, 0.7 mL/min)으로 분리하였고, 280 nm에서 검출하였다.
로스마린산(rosmarinic acid)은 배초향을 포함하여 들깨(Perilla frutescens), 로즈메리(Rosmarinus officinalis) 및 세이지(Salvia officinalis) 같은 꿀풀과(Labiatae) 식물에 다량 함유된 것으로 알려져있는 페놀성 물질로, 산화방지 효과뿐 아니라(39) 항염증(40), 뇌세포보호(41), 간손상 억제(42), 항알러지(43), 암전이 억제효과(44)가 보고된 바 있다. 강력한 산화방지 및 항염증 활성을 나타내는 주요활성성분을 확인하기 위해 HPLC를 이용하여 에틸아세테이트 분획(AREA)과 로스마린산의 관계를 확인하였다. 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA) 크로마토그램에서 19.
2 mM DPPH 라디칼 용액 100 μL을 가하여 상온에서 30분 반응시킨 후 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 희석 시 사용한 용매를 시료와 같은 방법으로 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 아래의 식에 대입하여 산출하였다.
배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)에서 갈산으로 환산한 폴리페놀 함량이 186 mg/g인 반면, 헥세인(ARH) 및 뷰탄올(ARBu) 분획은 각각 31 mg/g 및 73 mg/g으로 확인되어 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)이 강한 산화방지 활성을 가지는 것으로 추정하였다. 또한 라디칼 소거 및 환원력 시험을 통해 배초향의 추출물 및 각분획의 산화방지 효과를 확인하기로 하였다.
또한, 50% DPPH 라디칼 소거활성 정도를 나타내는 시료의 농도(SC50)를 구하여 시료의 라디칼 소거활성 정도를 평가하였다.
2% naphtylethylenediamine) 100 μL를 혼합하여 10분 동안 반응시키고 발색정도를 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 검량선 작성을 위해 NaNO2를 표준품으로 사용하였다. 또한, 각 well의 배양액을 제거 후, MTT (methylthiazolydiphenyltetrazolium bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA)용액을 2시간 처리하여 생성된 MTT formazan을 DMSO 용액에 용해시키고 540nm에서 흡광도를 측정하여 시료의 세포에 대한 독성 정도를 평가하였다.
또한, 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)이 염증상태에서 iNOS 발현 억제활성을 나타냈기에, 다른 염증 매개인자들의 발현에도 영향을 미치는지 확인하고자 TNF-α 및 IL-6의 mRNA level을 평가하였다.
강력한 산화방지 및 항염증 활성을 나타내는 주요활성성분을 확인하기 위해 HPLC를 이용하여 에틸아세테이트 분획(AREA)과 로스마린산의 관계를 확인하였다. 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA) 크로마토그램에서 19.1분에 표준품 로스마린산의 머무름 시간과 동일한 피크를 확인하였고(Fig. 2A), 명확한 규명을 위해 표준품 로스마린산과 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)의 동시주입을 실시하여 19분에 확인되는 피크의 높이가 상승된 반면, 에틸아세테이트 분획(AREA)의 40-60분대에 확인된 피크의 높이는 변화가 없음을 관찰하였다(Fig. 2B). 이는 동시주입법에 의해 로스마린산에 해당하는 피크를 증가시킴으로써 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)에 로스마린산이 함유되어 있음을 보여주는 결과이다.
배초향 추출물 및 각 분획별 파이토케미컬 조성과 분포를 알아보기 위해 환원당(reducing sugars)확인을 위한 펠링 시험, 사포닌 확인을 위한 포스 시험, 트라이터펜 정성시험인 살코브스키시험, 플라보노이드 확인시험인 마그네슘-염산 반응 및 알칼로이드 확인시험인 드라겐도프 반응을 실시하였다. 추출물(ARE) 및 헥세인(ARH), 에틸아세테이트(AREA), 뷰탄올(ARBu) 분획에서 환원당의 존재는 모두 양성으로 나타난 반면, 알칼로이드는 모두 음성으로 확인되었다.
배초향 추출물 및 각 분획에 대하여 환원당, 알칼로이드, 사포닌, 트라이터페노이드(triterpenoid), 타닌류, 플라보노이드와 같은 파이토케미컬에 대한 정성반응을 실시하였다. 환원당 존재유무를 확인하기 위해 펠링 용액을 가하여 적색침전의 발생여부를 확인하는 펠링 시험(Fehling’s test), 알칼로이드 확인을 위해 드라겐도프 시약을 가하여 침전물의 발생여부를 확인하는 드라겐도프 반응, 시료액의 지속성 거품을 관찰하는 사포닌 정성시험인 포스시험(forth test), 트라이터페노이드 확인을 위해 클로로폼추출액에 진한 황산을 가한 후 경계면의 정색반응을 확인하는 살코브스키시험(salkowski’s test), 마그네슘 가루와 염산용액을 가한 후의 정색반응을 관찰하는 플라보노이드 확인시험을 통해 추출물 및 각 분획에 존재하는 파이토케미컬을 확인하였다(20,21).
배초향 추출물 및 각 분획의 총 폴리페놀성 화합물의 함량은 포스포몰리브드(phosphomolybdic acid)와 반응하여 청색으로 발색 되는 원리를 이용한 폴린-데니스(Folin-Denis)법을 변형하여 측정하였다(22). 100 μL의 추출물 및 각 분획을 50 μL의 폴린-시오칼토의 페놀시약과 혼합하고 25℃에서 5분간 방치한 후, 300 μL의 20% 탄산소듐 용액을 가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
실험재료인 배초향의 잎과 줄기를 2014년 7월 충북 제천의 제천한방약초몰에서 구입하였고, 산지는 경북 영주산으로 확인하였다. 배초향의 잎과 줄기 900 g을 8L의 70% 에탄올로 3시간 동안 환류 추출, 여과한 후 감압농축 및 냉동건조를 통해 배초향 에탄올 추출물(ARE, 117 g)을 얻었다. 이후 에탄올 추출물 50 g에 500 mL 증류수를 가한 후, 동량의 헥세인(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 그리고 뷰탄올(n-butanol) 순으로 극성에 따른 용매분획을 실시하여 헥세인 분획(ARH, 4.
산화방지 활성을 검정하는 또 다른 방법으로, 금속이온을 환원시키는 효과가 강할수록 녹색에 가깝게 발색되어 높은 흡광도를 나타내는 방법을 실시하였다. 환원력에 의한 산화방지 활성을 흡광도 0.
incubator)에서 배양하였다. 시료는 DMSO에 용해시켜 보관하고, 세포에 시료를 가할 때 DMSO의 농도가 0.1% 이하가 되도록 처리하였다.
얻어진 cDNA의 일정량과 primer (iNOS; sense 5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3', antisense 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTGG-3', IL-6; sense 5'-GTCCTTCCTACCCCAATTTCCA-3', antisense 5'-TCCAAGAAACCATCTGGCTAGG-3', TNF-α; sense 5'-ACAGAAAGCATGATCCGGA-3', antisense 5'-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3', β-actin; sense 5'-ACTATTGGCAACGAGCGGTT-3', antisense 5'-GGGTGTAAAACGCAGCTCAGTA-3'), polymerase (Promega, Madision, WI, USA)를 가하여 mRNA 발현정도를 관찰하였다.
상온에서 1시간 동안 bl℃king buffer (5% skim milk in TBST)에서 membrane을 처리한 후, iNOS 항체(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 24시간 동안 4℃에서 처리하였다. 이후 15분 간격으로 TBST로 4회 세척하고 horseradish peroxidase linked type의 2차 항체를 결합시킨 후, ECL 검출시약(detection reagents) (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden)를 이용한 형광 항체법으로 iNOS 단백질의 발현 정도를 관찰하였다.
배초향의 잎과 줄기 900 g을 8L의 70% 에탄올로 3시간 동안 환류 추출, 여과한 후 감압농축 및 냉동건조를 통해 배초향 에탄올 추출물(ARE, 117 g)을 얻었다. 이후 에탄올 추출물 50 g에 500 mL 증류수를 가한 후, 동량의 헥세인(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 그리고 뷰탄올(n-butanol) 순으로 극성에 따른 용매분획을 실시하여 헥세인 분획(ARH, 4.6 g), 에틸아세테이트 분획(AREA, 5.5 g) 및 뷰탄올 분획(ARBu, 2.9 g)을 얻어 이후 실험에 사용하였다.
환원당 존재유무를 확인하기 위해 펠링 용액을 가하여 적색침전의 발생여부를 확인하는 펠링 시험(Fehling’s test), 알칼로이드 확인을 위해 드라겐도프 시약을 가하여 침전물의 발생여부를 확인하는 드라겐도프 반응, 시료액의 지속성 거품을 관찰하는 사포닌 정성시험인 포스시험(forth test), 트라이터페노이드 확인을 위해 클로로폼추출액에 진한 황산을 가한 후 경계면의 정색반응을 확인하는 살코브스키시험(salkowski’s test), 마그네슘 가루와 염산용액을 가한 후의 정색반응을 관찰하는 플라보노이드 확인시험을 통해 추출물 및 각 분획에 존재하는 파이토케미컬을 확인하였다(20,21).
대상 데이터
고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)는 Agilent 사(Santa Clara, CA, USA)의 infinity 1220 with UV detector를 사용하였다. HPLC 분석에 사용된 용매인 메탄올(methanol), 물(water), 아세토나이트릴(acetonitrile), 아세트산(acetic acid) (HPLC grade)은 TEDIA high purity solvents(Farifield, OH, USA)의 것을 사용하였다.
배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA) 및 로스마린산을 HPLC grade의 메탄올에 녹인 후, 모세관거르개(syringe filter, Milipore, 0.45 μm)를 이용하여 여과하고, 이 여액을 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다.
세포배양 상층액 100 μL와 Griess 시약(10% H3PO4, 2% sulfanilamide, 0.2% naphtylethylenediamine) 100 μL를 혼합하여 10분 동안 반응시키고 발색정도를 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 검량선 작성을 위해 NaNO2를 표준품으로 사용하였다.
실험재료인 배초향의 잎과 줄기를 2014년 7월 충북 제천의 제천한방약초몰에서 구입하였고, 산지는 경북 영주산으로 확인하였다. 배초향의 잎과 줄기 900 g을 8L의 70% 에탄올로 3시간 동안 환류 추출, 여과한 후 감압농축 및 냉동건조를 통해 배초향 에탄올 추출물(ARE, 117 g)을 얻었다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 추출용 에탄올(ethanol, reagent grade) 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate, reagent grade), 펠링 용액(Fehling solution), 마그네슘(Mg) 가루, 황산 및 염산 용액은 Duksan Pure Chemicals Co., Ltd. (Ansan, Korea) 에서 구입하였다.
각 평균치에 대한 검증은 SPSS 19(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였으며, Student’s t-test 또는 일원배치분산분석(One-way ANOVA)와 던컨의 다중검정(Duncan’s multiple range test)를 이용하여 p<0.05인 값에 대해 유의적인 것으로 처리하였다.
24시간 배양 후, 배양액을 제거하고 PBS로 세척 후 세포용해완충용액(cell lysis buffer) (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA, USA)를 가하여 세포를 lysis 시킨 뒤, ice에서 20분 동안 정치시켰다. 처리된 세포 용해물을 4℃에서 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 획득한 상층액에 대해서는 Bradford 법으로 단백질 농도를 측정하였다. 각 30μg 단백질량에 해당하는 시료를 10% SDS-PAGE 에서 전기영동 시킨 후, 플루오르화폴리바이닐리덴(polyvinylidene fluoride, PVDF) membrane에 옮겼다.
성능/효과
Fig. 1B에서 나타난 것처럼 배초향 에틸아세테이트 분획 (AREA) 처리군의 경우, 지방질다당류 단독처리군에 비해 농도의존적으로 iNOS 단백질 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있으며, β-actin 의 단백질 수준은 변화 없음을 확인하였다.
그 결과, 라디칼 소거활성과 유사하게 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA, RC0.5: 40.9 μg/mL)이 가장 강력한 환원력을 나타냄을 확인하였다(Table 3).
자유라디칼은 환경오염, 음주, 흡연, 화학약품 등에 의해 생성되며, 생체 내의 자유라디칼 반응에 의해 생성되는 활성산소종 및 산화질소(II)는 단백질의 불활성화, 조직의 손상 및 유전자 변이 등 인체 내에서 산화적 스트레스를 유발하여 노화, 퇴행성 신경질환, 대사증후군과 같은 질환의 주요 원인으로 보고되고 있다(29-31). 따라서 DPPH 라디칼 소거법을 이용하여 배초향 추출물 및 각 분획의 산화방지 활성을 평가하고, 활성 정도를 50% 라디칼 소거활성을 나타내는 농도(SC50)로 나타내었다(Table 3). 에틸아세테이트 분획(AREA, SC50: 77.
배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA) 25 μg/mL에서 TNF-α 발현에 대한 저해활성은 뚜렷하게 보이지 않았으나, IL-6 mRNA level은 지방질다당류 단독 처리군에 비해 감소됨을 확인하였다. 따라서, 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)이 iNOS 발현을 억제하여 산화질소(II) 생성을 억제하고, IL-6와 같은 염증매개인 자의 발현을 억제함으로써 염증반응에 대한 억제활성을 나타내어 항염증 기능성 소재로서의 가능성을 보여준다고 할 수 있다.
9 μg/mL)이 가장 강력한 환원력을 나타냄을 확인하였다(Table 3). 따라서, 페놀성분이 다량 분포하는 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)이 탁월한 라디칼 소거 및 환원력을 나타냄으로써 산화방지 효과가 가장 높은 것을 알 수 있다. Jhee과 Yang(32)은 방아의 ether 추출물 중 페놀성 분획이 DPPH 수소공여능, 리놀레산(linoleic acid)의 과산화물 생성억제활성이 강력하다고 보고하였으며, 이를 통해 폴리페놀 함량과 산화방지 활성 사이의 상관관계가 있음을 추측할 수 있다.
배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA) 25 μg/mL에서 TNF-α 발현에 대한 저해활성은 뚜렷하게 보이지 않았으나, IL-6 mRNA level은 지방질다당류 단독 처리군에 비해 감소됨을 확인하였다.
따라서 배초향 추출물 및 각 분획에 함유된 총 폴리페놀의 함량을 측정함으로써 산화방지 활성이 강한 분획을 찾고자 하였다(Table 2). 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)에서 갈산으로 환산한 폴리페놀 함량이 186 mg/g인 반면, 헥세인(ARH) 및 뷰탄올(ARBu) 분획은 각각 31 mg/g 및 73 mg/g으로 확인되어 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)이 강한 산화방지 활성을 가지는 것으로 추정하였다. 또한 라디칼 소거 및 환원력 시험을 통해 배초향의 추출물 및 각분획의 산화방지 효과를 확인하기로 하였다.
에틸아세테이트 분획(AREA, SC50: 77.4 μg/mL)의 경우, 헥세인 분획(ARH, SC50: >500 μg/mL) 혹은 뷰탄올 분획(ARBu, SC50: 409.9μg/mL)보다 저농도에서 DPPH 라디칼 소거활성이 나타남을 확인하였고, 헥세인 분획(ARH)의 라디칼 소거활성은 시료처리 최고농도인 500 μg/mL을 처리하였을 때에도 50% 소거 활성이 나타나지 않았다.
1C). 이러한 결과로부터, 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)은 iNOS의 발현을 억제하여 염증조건에서의 과도한 산화질소(II) 생성을 저해한다는 것을 추정할 수 있다. 또한, 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)이 염증상태에서 iNOS 발현 억제활성을 나타냈기에, 다른 염증 매개인자들의 발현에도 영향을 미치는지 확인하고자 TNF-α 및 IL-6의 mRNA level을 평가하였다.
강력한 산화방지 활성을 나타내는 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)에 대해 세포에서 발생하는 라디칼 생성에는 어떤 영향을 미치는 지 알아보기로 하였다. 지방질다당류(LPS)로 처리한 BV-2 microglia에서 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)의 산화질소(II) 생성 정도를 평가한 결과, 지방질다당류 단독처리군에 비해 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)은 농도 의존적으로 산화질소(II) 생성 억제활성을 나타내었다(Fig. 1A). 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA) 10 및 25 μg/mL에서 각각 14% 및 85%의 산화질소(II) 생성억제활성을 나타내었고, 이때 BV-2 microglia에 대한 세포독성은 나타나지 않았다.
배초향 추출물 및 각 분획별 파이토케미컬 조성과 분포를 알아보기 위해 환원당(reducing sugars)확인을 위한 펠링 시험, 사포닌 확인을 위한 포스 시험, 트라이터펜 정성시험인 살코브스키시험, 플라보노이드 확인시험인 마그네슘-염산 반응 및 알칼로이드 확인시험인 드라겐도프 반응을 실시하였다. 추출물(ARE) 및 헥세인(ARH), 에틸아세테이트(AREA), 뷰탄올(ARBu) 분획에서 환원당의 존재는 모두 양성으로 나타난 반면, 알칼로이드는 모두 음성으로 확인되었다. 뷰탄올 분획(ARBu)에서 사포닌에 대한 가장 강한 양성 반응성을 보였으나, 트라이터펜 확인시험에서는 헥세인 분획(ARH)이 강한 양성을 나타내었다.
특히, 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA) 25 μg/mL에서 DPPH 라디칼 소거활성 및 환원력 정도가 모두 50% 미만이었으나, 산화질소(II) 생성에 대해서는 85%로 강력한 억제활성을 나타냈다.
뷰탄올 분획(ARBu)에서 사포닌에 대한 가장 강한 양성 반응성을 보였으나, 트라이터펜 확인시험에서는 헥세인 분획(ARH)이 강한 양성을 나타내었다. 플라보노이드 확인시험에서는 헥세인(ARH) 을 제외한 에틸아세테이트(AREA) 및 뷰탄올(ARBu) 분획에서 양성반응을 확인하였고(Table 1), 이러한 결과는 배초향으로부터 보고된 성분들의 조성과도 일치하는 것으로 보여진다(2).
후속연구
따라서, 배초향 에틸아세테이트 분획(AREA)의 강력한 산화방지 및 항염증 효과를 나타내는 주요 활성성분 중의 하나로 로스마린산을 제시할 수 있으며, 이는 배초향의 에틸아세테이트 분획(AREA)의 산화방지 및 항염증 효능을 기반으로 하는 기능성 식품으로 개발하고자 할 때 표준화 자료로 응용될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
배초향의 정유성분의 종류는?
한방에서는 지상부를 ‘곽향’이라는 명칭으로 건위, 구풍, 소화, 두통, 구토 및 설사에 사용하고 위장병 치료에 중요한 약재로 사용해 왔다(1). 배초향의 정유성분으로 에스트라골(estragole), 아네톨(trans-anethole), 메틸 유게놀(methyl eugenol), 리모넨(limonene), 피넨(β-pinene) 및 티몰(thymol) 등이 보고되었으며(2,3), 이들 정유성분이 살선충작용(4) 및 항균작용(5-7)을 나타낸다고 알려져 있다. 또한 배초향의 강력한 항산화 성분으로 로스마린산(rosmarinic acid)이 보고되었으며(8), 플로보노이드(flavonoid) 화합물인 아카세틴(acacetin)은 항치매(9) 및 간세포보호 효과가(10) 있는 것으로 보고되었다.
배초향이란?
배초향(Agastache rugosa O. Kuntze)은 꿀풀과(Labiate)에 속하는 다년생 초본으로, 방아 혹은 한국민트 (Korean mint)라고도 불리며 생선찌개 및 추어탕 등 각종 음식의 향료로서 오래 전부터 사용하여 왔다. 한방에서는 지상부를 ‘곽향’이라는 명칭으로 건위, 구풍, 소화, 두통, 구토 및 설사에 사용하고 위장병 치료에 중요한 약재로 사용해 왔다(1).
한방에서 사용된 배초향 지상부의 명칭과 용도는?
Kuntze)은 꿀풀과(Labiate)에 속하는 다년생 초본으로, 방아 혹은 한국민트 (Korean mint)라고도 불리며 생선찌개 및 추어탕 등 각종 음식의 향료로서 오래 전부터 사용하여 왔다. 한방에서는 지상부를 ‘곽향’이라는 명칭으로 건위, 구풍, 소화, 두통, 구토 및 설사에 사용하고 위장병 치료에 중요한 약재로 사용해 왔다(1). 배초향의 정유성분으로 에스트라골(estragole), 아네톨(trans-anethole), 메틸 유게놀(methyl eugenol), 리모넨(limonene), 피넨(β-pinene) 및 티몰(thymol) 등이 보고되었으며(2,3), 이들 정유성분이 살선충작용(4) 및 항균작용(5-7)을 나타낸다고 알려져 있다.
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