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문제 정의
- 따라서 본 연구는 전통적인 방식으로 삼정환을 제조하여 발효 동안의 미생물학적 변화를 모니터링하여 발효 특성에 대해 분석 및 항산화 활성이 미치는 영향을 조사하였고 더나아가 삼정환 발효에 관여하는 유산균을 분리함으로써 표준화된 발효한약 개발에 기여하고자 하였다.
제안 방법
- 2% Na2CO3 1 ml에 시료 50μl, 50% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) 50 μl를 혼합한 후 실온에서 10분간 반응시키고 720 nm에서 UV ELISA microplate reader를 이용해 흡광도를 측정하였다.
- 2차 PCR은 GC clamp가 부착된 GC338F (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)와 518R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)을 사용하여 수행하였다.
- 발효된 삼정환의 유산균은 MRS와 LBS agar 배지를 사용하여 무작위로 크기와 모양이 다른 콜로니를 선발하였다. 40개의 콜로니를 선발하였고, RAPD-PCR를 통해 그 밴드의 패턴이 다른 콜로니를 얻었으며 총 13개의 유산균을 동정하였고 그 결과는 Table 2와 같다. 동정한 유산균 중 11종은 Fig.
- Denaturing gradients는 30%∼60%로 농도 구배가 연속적으로 형성된 gel을 제작하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA) 50 μl를 혼합한 후 실온에서 10분간 반응시키고 720 nm에서 UV ELISA microplate reader를 이용해 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준 물질로 사용하였고 표준곡선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 환산하여 표시하였다. 총 플라보노이드 함량은 시료 500 μl에 5% NaNO2 300 μl를 혼합하여 5분간 반응시킨 후 10% AlCl3 300 μl를 혼합하여 5분간 반응시킨 다음 1 M NaOH 2 ml로 반응을 정지시키고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Genomic DNA는 universal bacterial 16s rRNA gene primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)을 이용하여 nested-polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. PCR 산물은 1% agarose gel에 전기영동하여 크기를 확인한다음 약 1.5 kb에서 증폭된 밴드만 잘라 Accuprep gel purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다. 2차 PCR은 GC clamp가 부착된 GC338F (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)와 518R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)을 사용하여 수행하였다.
- RAPD-PCR을 위하여 M13 primer (5’-GAG GGT GGC GGT TCT-3’)를 사용하였으며 PCR은 94에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 1분, 45℃에서 20초, 72℃에서 2분의 반응을 총 40회 수행한후 72℃에서 10분간 최종 신장하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel에 로딩한 후 100 V에서 3분, 50 V에서 2시간 동안 전기영동한 후 UV illumination (LAS-3000; Fuji photofilm)을 사용하여 밴드를 확인하였다. 밴드 패턴이 비슷한 균주를 그룹으로 나눈 다음 Genomic DNA를 추출하였고 DNA의 염기서열 분석은 Macrogen Inc.
- PCR-DGGE를 통해 분리된 각 DNA 밴드의 염기서열을 분석하고 동정하기 위해 각 위치의 밴드를 자른 후 tube에 옮겨 Gel & PCR Purification System (BioFACT Co. Ltd., Daejeon, Korea)의 protocol을 변형하여 실시하였다.
- 2차 PCR은 GC clamp가 부착된 GC338F (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)와 518R (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)을 사용하여 수행하였다. Polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis (PCRDGGE)는 D Code universal mutation detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 분석을 수행하였다. Denaturing gradients는 30%∼60%로 농도 구배가 연속적으로 형성된 gel을 제작하여 사용하였다.
- RAPD-PCR을 위하여 M13 primer (5’-GAG GGT GGC GGT TCT-3’)를 사용하였으며 PCR은 94에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 1분, 45℃에서 20초, 72℃에서 2분의 반응을 총 40회 수행한후 72℃에서 10분간 최종 신장하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 시료 500 μl에 5% NaNO2 300 μl를 혼합하여 5분간 반응시킨 후 10% AlCl3 300 μl를 혼합하여 5분간 반응시킨 다음 1 M NaOH 2 ml로 반응을 정지시키고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. chtechin을 표준물질로 사용하였고 표준곡선을 작성하여 총플라보노이드 함량을 환산하여 표시하였다.
- 발효 시간별로 채취한 삼정환은 PCR-DGGE를 통해 미생물의 변화 양상을 비교하였다. 그 결과, 삼정환은 발효를 시작하고 1주일 후 미생물 패턴이 급격히 변화하였으며, 5주까지 그 패턴이 비슷하게 유지되었다(Fig.
- 발효과정 중 pH 변화를 측정하기 위하여 1 g 시료를 9 ml 의 0.85% NaCl로 희석한 후 pH를 측정하였다. 총 산도는 1 g 시료를 9 ml의 0.
- 발효된 삼정환의 미생물의 다양성을 분석하기 위해 시료는 PowerFood TM Microbial DNA isolation kit (MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 total DNA를 추출하였고 샘플은 −20°C에 보관하였다.
- 발효된 삼정환의 유산균은 MRS와 LBS agar 배지를 사용하여 무작위로 크기와 모양이 다른 콜로니를 선발하였다. 40개의 콜로니를 선발하였고, RAPD-PCR를 통해 그 밴드의 패턴이 다른 콜로니를 얻었으며 총 13개의 유산균을 동정하였고 그 결과는 Table 2와 같다.
- 희석된 시료는 선발 배지에 100 μl씩 분주하여 도말 후 배양하였다. 삼정환 내 총 세균수를 확인하기 위해 nutrient agar (Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 배지를, 총 유산균수를 분석하기 위해 MRS agar (Difco) 배지를, lactobacillus 속의 세균수를 분석하기 위해 LBS agar (MB cell, St. Los Angeles, CA USA)를 사용하였다. 30℃에서 48시간 배양하였고 생균수는 생성 콜로니 개수 (colony forming units per gram, CFU/g)로 나타냈다.
- 삼정환 발효 과정 중 미생물의 변화과정을 비교하기 위하여 PCR-DGGE를 수행하였다. 삼정환은 발효 전 Lc.
- 삼정환 발효 중 free radical 소거활성의 변화를 확인하기 위해 free radical인 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH;Sigma-Aldrich Corp.)에 대한 환원력을 측정하였다. DPPH 는 ethanol에 용해시켜 0.
- 삼정환의 발효 동안의 생리활성의 변화를 보기 위하여 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 분석하였다. 페놀 화합물은 과일, 채소, 차와 같은 식품에 존재하며 항산화 활성 및 암과 심혈관계 질환 같은 산화스트레스와 관련된 다양한 질병을 예방하는 효과를 가지고 있다.
- 삼정환은 일정한 기간 동안 발효 중 총 세균과 유산균, Lactoabacillus sp.의 생균 수 변화를 조사하였다. 발효를 시작한 시점에서 총 균수는 5.
- 하지만 자연발효법을 이용한 발효한약에 대한 연구는 미미하였다. 이에 본 연구는 자연발효법을 이용한 삼정환을 제조하여 발효과정에 따른 특성 및 항산화 활성을 비교하였고 더 나아가 삼정환 발효에 관여하는 미생물 분석 및 분리하였다.
- 제작된 gel에 2차 PCR 산물을 로딩하고 1X Tris-acetate-EDTA buffer (60°C)에서 20 V로 30분을 전기영동한 다음 60 V로 13시간을 전기영동하였다. 전기영동이 종료된 gel은 EtBr 로 염색시킨 후 UV illumination (LAS-3000; Fuji photo film, Tokyo, Japan)을 사용하여 밴드를 확인하였다.
- 잘라진 gel 무게의 3배의 UB를 첨가한 다음 4℃에서 overnight 로 배양 후 다음과정은 protocol과 같은 방법으로 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA의 염기서열 분석은 Macrogen Inc. (Seoul, Korea)에 의뢰하였으며, 분석된 염기서열은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)에서 BLAST 분석하여 동정하였다.
대상 데이터
- 상심자, 지골피, 창출은 동국대학교 일산한방병원에서 구입하였다. 상심자는 분쇄하여 즙으로 제조하였고 지골피, 창출은 건조시료를 사용하여 분쇄하였다.
- 유산균은 MRS agar와 LBS agar plate에서 자란 콜로니중 무작위로 40개씩 선발하여 순수배양하였다. 순수 분리한 유산균은 random amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR을 이용하여 균주를 분류하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값과 표준편차로 표시하였으며, 각실험군 간의 통계분석은 Student’s t-test를 통해 시행하였다.
- 밴드 패턴이 비슷한 균주를 그룹으로 나눈 다음 Genomic DNA를 추출하였고 DNA의 염기서열 분석은 Macrogen Inc.에 의뢰하였으며, 분석된 염기서열은 NCBI에서 BLAST 분석하여 동정하였다.
이론/모형
- 유산균은 MRS agar와 LBS agar plate에서 자란 콜로니중 무작위로 40개씩 선발하여 순수배양하였다. 순수 분리한 유산균은 random amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR을 이용하여 균주를 분류하였다. RAPD-PCR을 위하여 M13 primer (5’-GAG GGT GGC GGT TCT-3’)를 사용하였으며 PCR은 94에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 1분, 45℃에서 20초, 72℃에서 2분의 반응을 총 40회 수행한후 72℃에서 10분간 최종 신장하였다.
- 총 페놀함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 이용하여 측정하였다. 시료는 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 얻어 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 5배 더 증가하였다. pH, 총산도, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, DPPH free radical 소거능 등의 결과를 종합해 볼 때 삼정환 최적의 발효 조건은 4주 후가 적합할 것으로 예상된다. 본 연구는 처음으로 삼정환의 발효특성을 분석했다는 점에서 의의가 있다.
- 발효 시간별로 채취한 삼정환은 PCR-DGGE를 통해 미생물의 변화 양상을 비교하였다. 그 결과, 삼정환은 발효를 시작하고 1주일 후 미생물 패턴이 급격히 변화하였으며, 5주까지 그 패턴이 비슷하게 유지되었다(Fig. 5). 주요 밴드는 16S rRNA gene을 동정하였고 그 결과는 Table 1에 나타냈다.
- 40개의 콜로니를 선발하였고, RAPD-PCR를 통해 그 밴드의 패턴이 다른 콜로니를 얻었으며 총 13개의 유산균을 동정하였고 그 결과는 Table 2와 같다. 동정한 유산균 중 11종은 Fig. 5의 결과와 같이 L. brevis가 가장 많이 분리되었고 그 다음으로 L. plantarum 2종이 분리되었다.
- brevis는 피클이나 사워도우, 김치와 같은 식물성 식품에서 분리되는 유산균이다22). 따라서 L. brevis는 식물성 성분에 잘 적응하여 그 수가 유지된 반면, E. mundtii는 환경이 변화하면서 적응하지 못하고 그수가 줄어들었을 것이다. 삼정환 발효 동안의 생균수 변화를 측정해 보았을 때, Lactobacillus 속이 초기에 발견되지 않았으나 발효 1주 후 그 수가 급격히 증가하였다.
- lactis 같은 유산균에 의해 발효되며 발효 기간에 따라 pH 및 총산도와 특성이 변하였다. 또한 발효 후 폴리페놀과 플라보노이드 등 생리 활성 물질이 증가하였고 특히 DPPH free radical 소거능은 발효 전보다 발효 4주 후 5.5배 더 증가하였다. pH, 총산도, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, DPPH free radical 소거능 등의 결과를 종합해 볼 때 삼정환 최적의 발효 조건은 4주 후가 적합할 것으로 예상된다.
- brevis의 밴드가 진해진 결과와 일치하였다. 또한 전체적인 생균 수가 발효 5주 후 감소하였고 PCR-DGGE 결과에서도 전제적인 밴드의 진하기가 줄어든 결과를 보였다.
- lactis는 발효 전부터 존재하여 발효 5주 후까지 그 분포도가 유지되었다. 반면 Enterococcus mundtii는 발효 1주 후 나타났다 발효가 진행됨에 따라 점차 사라졌으며, Pseudanabaena 속도 발효 전부터 나타났으나 발효 5주 후 그 분포도가 급격히 감소되었다. 삼정환은 발효 4주 후 전체적으로 밴드의 굵기가 흐려졌다.
- lactis는 가장 큰 영향을 미쳤을 것이다. 반면 Pseudanabaena 속은 발효 전부터 존재하였지만 유산균들이 자라면서 그 분포도가 크게 감소하였고 E. mundtii는 발효 1주 후밴드가 진하게 존재하였지만 발효가 진행됨에 따라 밴드가 사라지는 패턴을 보였다. 이는 발효 1주 후 그 분포가 크게 증가한 L.
- 반면, 총 플라보노이드 함량은 발효 전 3.25 μg/mg에서 발효 기간이 증가할수록 그 함량이 증가하였으며, 발효 4주 후 5.63 μg/ml로 약 1.7배 증가하였고 발효 5주 후 5.36 μg/mg 의 함량으로 4주 후 총 플라보노이드 함량과 유의적 차이는 나타나지 않았다(Fig. 3).
- 가 주로 존재하였고 이 미생물은 삼정환의 원료인 오디, 지골피, 창출에서 유래했을 것으로 생각된다. 발효 1주 후 미생물의 분포가 다르게 변화하였는데 그 중 L. brevis는 주요 미생물로 나타났고 그 L. brevis의 밴드는 발효가 종료될 때까지 진하게 유지되었다. Lc.
- 4와 같다. 발효 전 11.26%에서 발효 1주 후 45.44%로 약 4배로 급격히 증가하였고, 발효 1, 2, 3, 4주 후 각각 45.44, 48.99, 55.39%로 계속해서 증가하였고, 발효 4주 후 1.84%로 발효 전보다 약 5.5배 더 증가하였다. 하지만 발효 5주 후 58.
- 발효 전 삼정환의 총 폴리페놀 함량은 9.93 μg/mg의 함량을 나타내었고, 발효 후 1주 및 2주 후 각각 8.89 μg/mg 과 9.30 μg/mg의 함량으로 감소하였다.
- 6).발효가 시작되면서 총 세균수는 계속적으로 증가하여 4주후 7.66 log CFU/ml까지 증가하였다가 5주 후 그 수가 감소하였다. 유산균 역시 초기 5.
- 9 를 유지했다. 산도는 발효 전 0.45%에서 발효 1주 후 0.90%, 2주 후 1.44%로 급격히 증가하였고, 발효 4주 이후 1.71%로 일정하게 나타났다. pH와 산도 모두 발효 4주 이후로 일정하게 나타났다.
- 삼정환 발효에 관여하는 유산균을 분리하였을 때, L.brevis가 가장 많이 분리되었고 다음으로 L. plantarum이 2종 분리되었다. 이전 연구에서 삼정환은 L.
- 오디의 당은 삼정환 발효 동안 주요 에너지원으로 사용된 것으로 예상된다. 이에 따라 발효 전 pH는 4.7이었으나 발효가 진행됨에 따라 pH가 꾸준히 감소하였고, 발효 4주 후 pH 3.9를 나타났다. 산도는 발효 전 0.
- 하지만 발효 3주 후 10.54 μg/mg의 함량으로 발효 전보다 높아졌고, 발효 4주후 11.45 μg/mg으로 가장 높게 나타났d으며, 5주 후 11.38 μg/mg으로 나타났지만 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
후속연구
- lactis 는 분리하지 못하였고 항산화 활성과 관련된 특성을 DPPH free radical 소거능으로만 측정했다는 한계가 있다. 따라서 추후 발효삼정환 제조를 위한 스타터 개발과 천연발효 삼정 환의 항산화, 항비만 등 삼정환의 생리활성 기능을 구체적으로 규명할 수 있는 연구가 필요하다.
- plantarum를 이용하여 발효시켜 3T3-L1 지방세포로 실험을 하였을 때, 염색된 지방구 수가 감소한 보고가 있다11). 하지만 가장 많이 분리된 L. brevis를 이용한 연구는 아직 수행되지 않아 추후 자세한 연구가 필요할 것으로 여겨진다.
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