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문제 정의
- 본 연구에서는 HA에 대하여 UVB로 주름을 유도시킨 hairless mice에게 경구 투여를 하였을 때, 주름 개선에 미치는 영향을 관찰하였다. 쥐는 UV를 쪼여 광노화를 진행하였으며, HA는 UVB에 노출시키기 4주 전부터 투여하여 총 14주 동안 투여 하였다.
제안 방법
- 1). 10주 동안 조사하여 총 UV 조사량이 90 MED(13,500 mJ/cm2)가 되도록 했으며, UV 조사량은 UV radiometer로 측정하였다.
- 10주간의 UVB 조사가 끝난 후, 시험동물의 등에 주름 replica를 제작하여 주름지표를 측정하였다(Fig. 4). 주름 유발 10주차에서는 주름유발군은 주름의 깊이가 22.
- Mice를 Ether로 마취하여 등 아래쪽 동일한 부위에 disc(diameter 10 mm)를 붙이고 silicon rubber(silflo, Germany)에 catalyst 1~2방울과 섞어주어 disc 위에 바른다. 1~2분 후에 silicon rubber가 굳으면 떼어내어 측정용 replica에 고정시켜 dust-free 상태에서 skin visioline VL650(Courage Khanzaka, Germany)을 이용해 주름의 개수와 깊이 그리고 주름 길이를 측정하였다. 또한 사진촬영(D3.
- 01% 농도로 3회, 100 μL/회 도포하였다. HA 투여군은 UVB 조사 4주전부터 투여하여 UVB 조사기간 10주를 포함한 총 14주 동안 10 mL/kg으로 1일 1회 경구 투여하였다(Fig. 1).
- UV 조사가 시작된 시점으로부터 10주 후 쥐의 등 가운데 부분에서 조금 아래쪽으로 너비 1 cm 되는 부위를 표시하여 vernier caliper로 피부 두께를 측정하였다.
- 먼저 예비시험을 통해 100 mJ/cm2, 150 mJ/cm2, 200 mJ/cm2 조사량을 조사하고, 24시간이 지난 후 최초의 홍반이 나타나는 자외선 조사량인 1MED(minimal erythemal dose)를 150 mJ/cm2로 정하였다. UV 조사를 시작한 첫째 주에 1 MED(150 mJ/cm2), 둘째 주에 2 MED, 셋째 주에 3 MED, 넷째 주에서 열째 주까지 4 MED를 조사하였다(Fig. 1). 10주 동안 조사하여 총 UV 조사량이 90 MED(13,500 mJ/cm2)가 되도록 했으며, UV 조사량은 UV radiometer로 측정하였다.
- UVB 조사로 유도된 광노화로부터 HA가 주름에 미치는 영향을 알아보기 위하여 UVB 조사 후 10주가 지난 후의 시험동물의 등에 replica를 이용해 피부주름의 형태를 확인하였다(Fig. 3). 주름유발군(Con.
- UVB에 의해 생성된 주름에 대한 개선 효과를 알아보기 위해 육안평가 및 주름 replica를 제작하여 주름 길이와 깊이, 주름의 수를 측정하였다(Bae 등 2012). 주름 replica는 10주 후 제작하였다.
- 광노화 중 탄력섬유의 양과 형태 및 HA 급여의 효과를 관찰하기 위해 Verhoeff’s staining을 진행하였다(Bae 등 2012).
- 광노화에 의한 주름을 발생시키기 위해 정상 대조군을 제외한 5군에 매 주 3번 조사를 원칙으로 하여 UVB 조사를 실시하였다(UV 조사장치, L&T, Korea).
- 광노화에 의해 발생한 교원섬유와 탄력섬유의 양과 형태 및 HA의 급여효과를 관찰하기 위해 Masson's trichrome staining 및 Verhoeff’s staining을 진행하였다.
- 본 평가를 위한 실험동물은 4주령 암컷 SKH-1 hairless mice를 ㈜대한바이오링크(Korea)에서 구입하여 사용하였다. 동물 입수 후 2주의 적응기간을 거친 후, 8마리씩 총 6군으로 분리하여 실험하였다. 실험군은 정상 대조군(Nor.
- 따라서, 본 연구에서는 HA를 hairless 쥐에게 경구 투여하였을 때 주름 개선 및 피부 두께 등의 평가를 진행하였으며, 피부 조직학적 평가를 통해 UV로부터 유도된 광노화에 대한 HA의 피부 개선효과를 평가하였다.
- 1~2분 후에 silicon rubber가 굳으면 떼어내어 측정용 replica에 고정시켜 dust-free 상태에서 skin visioline VL650(Courage Khanzaka, Germany)을 이용해 주름의 개수와 깊이 그리고 주름 길이를 측정하였다. 또한 사진촬영(D3.100, Nikon, Japan)을 통해 육안적 피부변화의 관찰에 대한 참고자료로서 이용하였고, UV 조사 개시 후 10주 후 실시하였다.
- 주름 개선 평가는 replica 제작하여 주름의 길이, 깊이, 개수, 두께로 평가하였다. 또한, 피부의 조직학적 평가를 통해 진피층 내 교원섬유와 탄력섬유의 양과 형태를 관찰하였다. 10주 동안의 HA를 급여하였을 때 주름의 깊이, 두께, 개수를 측정한 주름 개선 평가에서 세 항목 모두 개선되는 결과를 보였다.
- 광노화에 의한 주름을 발생시키기 위해 정상 대조군을 제외한 5군에 매 주 3번 조사를 원칙으로 하여 UVB 조사를 실시하였다(UV 조사장치, L&T, Korea). 먼저 예비시험을 통해 100 mJ/cm2, 150 mJ/cm2, 200 mJ/cm2 조사량을 조사하고, 24시간이 지난 후 최초의 홍반이 나타나는 자외선 조사량인 1MED(minimal erythemal dose)를 150 mJ/cm2로 정하였다. UV 조사를 시작한 첫째 주에 1 MED(150 mJ/cm2), 둘째 주에 2 MED, 셋째 주에 3 MED, 넷째 주에서 열째 주까지 4 MED를 조사하였다(Fig.
- 시험기간 동안 실험동물의 체중 변화를 관찰하였다. 시험 기간 중 정상 군을 포함한 모든 군에서 체중 증가가 있었으며, 각 군간 체중에 대한 통계적 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig.
- 동물 입수 후 2주의 적응기간을 거친 후, 8마리씩 총 6군으로 분리하여 실험하였다. 실험군은 정상 대조군(Nor. Group), 주름 유발군(Con. group), 양성대조군(Retinoic acid; RA), HA에 대한 농도에 따른 세 군(10 mg/kg, 40 mg/kg, 160 mg/kg)을 포함한 총 6군으로 나누어 14주에 걸쳐 실험을 진행하였다(Fig. 1). 실험동물은 일정한 조건(온도: 22±2 ℃, 습도: 50±10%, 명암 주기: 12시간 점등/12시간 소등, 조도: 200~300 Lux, 환기회수: 10~ 15회/시간)의 환경에서 사육하였다.
- 양성 대조군에 투여하는 시험물질은 Retinoic acid(RA)로 일주일에 0.01% 농도로 3회, 100 μL/회 도포하였다.
- 염색은 56℃ Bouin’s solution에 15분간 담그고, Masson’s trichrome(Masson’s trichrome stain LG solution; Sigma, St. Louis, MO, USA) 염색 후 진피층 내의 교원섬유의 양과 형태를 광학현미경(Olympus CKX41, Tokyo, Japan)을 사용해 200배의 배율로 관찰하였다.
- 이후 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 진행하고, 이 과정을 거친 조직을 paraffin으로 포매하여 5 μm의 두께로 절편한 후 염색과정을 진행하였다. 염색은 elastin staining kit(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 있는 elastin stain solution으로 먼저 염색하고, ferric chloride solution으로 감별 수세 후 Van Gieson solution으로 염색하여 진피층 내의 탄력섬유의 변형을 광학현미경(Olympus CKK41, Tokyo, Japan)을 통해 관찰하였다.
- 이후 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 진행하고, 이 과정을 거친 조직을 paraffin으로 포매하여 5 μm의 두께로 절편한 후 염색과정을 진행하였다.
- 쥐는 UV를 쪼여 광노화를 진행하였으며, HA는 UVB에 노출시키기 4주 전부터 투여하여 총 14주 동안 투여 하였다. 주름 개선 평가는 replica 제작하여 주름의 길이, 깊이, 개수, 두께로 평가하였다. 또한, 피부의 조직학적 평가를 통해 진피층 내 교원섬유와 탄력섬유의 양과 형태를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 HA에 대하여 UVB로 주름을 유도시킨 hairless mice에게 경구 투여를 하였을 때, 주름 개선에 미치는 영향을 관찰하였다. 쥐는 UV를 쪼여 광노화를 진행하였으며, HA는 UVB에 노출시키기 4주 전부터 투여하여 총 14주 동안 투여 하였다. 주름 개선 평가는 replica 제작하여 주름의 길이, 깊이, 개수, 두께로 평가하였다.
대상 데이터
- 본 평가를 위한 실험동물은 4주령 암컷 SKH-1 hairless mice를 ㈜대한바이오링크(Korea)에서 구입하여 사용하였다. 동물 입수 후 2주의 적응기간을 거친 후, 8마리씩 총 6군으로 분리하여 실험하였다.
- Streptococcus zooepidemicus를 37℃, pH 7의 조건에서 16~18시간 배양한다. 사용된 배지는 멸균수에 포도당, 소이펩톤, 이스트와 KH2PO4을 첨가하여 제조하였다. 배양이 완료되면, 배지를 살균 및 여과한다.
- 실험동물은 일정한 조건(온도: 22±2 ℃, 습도: 50±10%, 명암 주기: 12시간 점등/12시간 소등, 조도: 200~300 Lux, 환기회수: 10~ 15회/시간)의 환경에서 사육하였다.
데이터처리
- One-way analysis of variation(ANOVA)을 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 시험 군을 확인하기 위해 Dunnett's t-test 다중검정을 실시하였다(유의수준 p<0.05)
- 모든 자료들은 평균과 표준편차로 나타내었으며, SPSS program(SPSS INC, ver.12.0)을 이용하여 통계해석을 실시하였다. One-way analysis of variation(ANOVA)을 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 시험 군을 확인하기 위해 Dunnett's t-test 다중검정을 실시하였다(유의수준 p<0.
이론/모형
- UVB로부터 발생한 광노화 중 교원섬유의 양과 형태를 관찰하기 위해 Masson’s trichrome staining을 진행하였다(Song 등 2013).
- 진피층 내 교원섬유의 양과 형태를 확인하기 위해 Masson’s trichrome staining을 진행하였다(Fig. 5).
- 진피층 내 탄력섬유의 양과 형태를 관찰하기 위해 Verhoeff’s staining을 진행하였다(Fig. 6).
성능/효과
- 또한, 피부의 조직학적 평가를 통해 진피층 내 교원섬유와 탄력섬유의 양과 형태를 관찰하였다. 10주 동안의 HA를 급여하였을 때 주름의 깊이, 두께, 개수를 측정한 주름 개선 평가에서 세 항목 모두 개선되는 결과를 보였다. 특히 HA의 160 mg/kg 농도에서는 주름의 깊이는 19.
- 반면, 주름 길이는 주름유발군에 비해 감소하는 경향이 있지만, 통계적 유의성은 없었다. 40 mg/kg과 160 mg/kg의 결과에서 주름의 깊이와 길이의 효능은 확인할 수 있으며, 평균값이 160 mg/kg에서 40 mg/kg보다 증가하는 양상을 보였지만 유의적 차이를 나타내지 않으므로, HA의 피부재생 효과를 확인할 수 있다.
- 하지만, 주름길이의 결과에서는 유의적 차이를 나타내지 않았다. HA의 섭취로 인한 교원섬유 및 탄력섬유 염색을 통한 조직학적 평가에서는 UV에 의해 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이던 섬유들이 개선된 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 보아 HA를 경구 투여 시 UV로부터 유도된 광노화 억제 및 피부주름 개선에 효능이 있음을 확인하였다.
- )에 비해 굴곡이 두껍고 깊은 주름의 형상을 띠고 있었다. 농도별로 시료를 급여하였을 때, 시료의 농도가 높아질수록 주름의 깊이와 형상이 주름유발군과 분명하게 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 양성대조군(RA)에서 주름의 깊이, 두께 및 주름 개수는 각각 19.28±0.95 μm, 1.34±0.07 mm, 653.57±83.54로 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
- 정상대조군은 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적이지만, 주름유발군은 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이며 양도 많이 줄어 있다. 양성대조군과 시료처리군에서는 주름 유발군에 비해 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적으로 나타났으며, 시료처리군의 농도가 높아짐에 따라 형태가 더욱 조밀해지는 것을 확인하였다.
- 정상대조군은 탄력섬유의 배열이 규칙적이고 조밀하지만, 주름유발군은 변성되고 엉긴 탄력섬유증이 관찰되었다. 양성대조군과 시료처리군에서는 주름유발군에 비해 변성된 탄력섬유증의 크기와 빈도가 줄어들었으며, 시료의 농도가 높아질수록 뚜렷하게 관찰되었다.
- HA의 섭취로 인한 교원섬유 및 탄력섬유 염색을 통한 조직학적 평가에서는 UV에 의해 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이던 섬유들이 개선된 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 보아 HA를 경구 투여 시 UV로부터 유도된 광노화 억제 및 피부주름 개선에 효능이 있음을 확인하였다.
- 6). 정상대조군은 탄력섬유의 배열이 규칙적이고 조밀하지만, 주름유발군은 변성되고 엉긴 탄력섬유증이 관찰되었다. 양성대조군과 시료처리군에서는 주름유발군에 비해 변성된 탄력섬유증의 크기와 빈도가 줄어들었으며, 시료의 농도가 높아질수록 뚜렷하게 관찰되었다.
- 특히 HA의 160 mg/kg 농도에서는 주름의 깊이는 19.44±0.75 μm, 주름 수는 654.00±98.34, 주름두께는 1.35±0.08 mm로 양성 대조군(RA)의 결과(주름깊이; 19.28±0.95 μm, 주름 수; 953.57±83.54, 주름두께; 1.34±0.07 mm)와 비슷한 수치를 나타내며, 우수한 피부 광노화 개선효과를 보였다.
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