박태순
(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry)
,
김동희
(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry)
,
손준호
(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry)
본 연구에서는 단삼 열수 추출물의 human epidermal melanocye (HEM) 세포에서의 미백활성을 측정하였다. 버섯유래의 tyrosinase 저해능 측정결과 $1,000{\mu}g/mL$의 농도에서 42%의 저해율을 나타내었으며, HEM 세포내의 tyrosinase, 멜라닌 생합성 저해능은 $5{\mu}g/mL$에서 26, 25%의 저해능을 나타내었다. 단삼 추출물의 미백과 관련된 tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), microphthalmia associated transcription factor (MITF)의 단백질 및 유전자 양이 감소함을 나타내었다. 또한 그 상위 단계인 cAMP 발현이 $5{\mu}g/mL$ 농도에서 41% 감소하는 것을 확인하였다. 본 실험을 통하여 단삼 추출물이 cAMP를 효과적으로 억제함으로써, 이를 통해 tyrosinase 활성뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2 그리고 MITF 발현을 효과적으로 저해 한다는 사실을 확인하여 기능성 미백 화장품 소재로서의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
본 연구에서는 단삼 열수 추출물의 human epidermal melanocye (HEM) 세포에서의 미백활성을 측정하였다. 버섯유래의 tyrosinase 저해능 측정결과 $1,000{\mu}g/mL$의 농도에서 42%의 저해율을 나타내었으며, HEM 세포내의 tyrosinase, 멜라닌 생합성 저해능은 $5{\mu}g/mL$에서 26, 25%의 저해능을 나타내었다. 단삼 추출물의 미백과 관련된 tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), microphthalmia associated transcription factor (MITF)의 단백질 및 유전자 양이 감소함을 나타내었다. 또한 그 상위 단계인 cAMP 발현이 $5{\mu}g/mL$ 농도에서 41% 감소하는 것을 확인하였다. 본 실험을 통하여 단삼 추출물이 cAMP를 효과적으로 억제함으로써, 이를 통해 tyrosinase 활성뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2 그리고 MITF 발현을 효과적으로 저해 한다는 사실을 확인하여 기능성 미백 화장품 소재로서의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
The objective of this study was to investigate the whitening effect of Salvia miltorrhiza Bunge water extract (SM-W) in human epidermal melanocyte (HEM). Mushroom tyrosinase inhibitory effect of SM-W was approximately 42% at $1,000{\mu}g/mL$. The HEM cellular tyrosinase and melanin synthe...
The objective of this study was to investigate the whitening effect of Salvia miltorrhiza Bunge water extract (SM-W) in human epidermal melanocyte (HEM). Mushroom tyrosinase inhibitory effect of SM-W was approximately 42% at $1,000{\mu}g/mL$. The HEM cellular tyrosinase and melanin synthesis inhibition activity were 26 and 25% at $5{\mu}g/mL$, respectively. Whitening related proteins and mRNAs including tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1) and TRP-2, and microphthalmia associated transcription factor were reduced by SM-W treatment. In addition, the cAMP expression inhibitory effect of SM-W was decreased by 41% at $5{\mu}g/mL$ concentration. These results indicated that Salvia miltorrhiza Bunge could be used to the possible utilization of functional cosmetic ingredients by confirming whitening activity related with melanin content.
The objective of this study was to investigate the whitening effect of Salvia miltorrhiza Bunge water extract (SM-W) in human epidermal melanocyte (HEM). Mushroom tyrosinase inhibitory effect of SM-W was approximately 42% at $1,000{\mu}g/mL$. The HEM cellular tyrosinase and melanin synthesis inhibition activity were 26 and 25% at $5{\mu}g/mL$, respectively. Whitening related proteins and mRNAs including tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1) and TRP-2, and microphthalmia associated transcription factor were reduced by SM-W treatment. In addition, the cAMP expression inhibitory effect of SM-W was decreased by 41% at $5{\mu}g/mL$ concentration. These results indicated that Salvia miltorrhiza Bunge could be used to the possible utilization of functional cosmetic ingredients by confirming whitening activity related with melanin content.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 단삼의 열수 추출물을 이용하여 인간 정상 세포에서도 미백효능을 밝히고자 인간의 표피 멜라닌 세포인 human epidermal melanocyte (HEM)에서의 cAMP/PKA 경로를 통한 멜라닌 생합성 억제로 인한 미백효과를 검증하고 미백화장품의 소재로서의 기능성을 확인하였다.
또한 그 상위 단계인 cAMP 발현이 5 µg/mL 농도에서 41% 감소하는 것을 확인하였다. 본 실험을 통하여 단삼 추출물이 cAMP를 효과적으로 억제함으로써, 이를 통해 tyrosinase 활성뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2 그리고 MITF 발현을 효과적으로 저해 한다는 사실을 확인하여 기능성 미백 화장품 소재로서의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
3×105개의 HEM 세포를 0.1 M HCl에 용해하여 phosphodiesterase 활성을 억제하였다.
분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. MMP-1 각각의 1차 항체를 1:1000으로 희석하여 4oC에서 over night 한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 붙이고, 3회 세척 후 LAS 4000 image analyzer (Fugifilm life science, Japan)기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다.
Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 염기서열은 Table 1과 같다. RT의 조건은 42oC에서 1시간 방치하여 cDNA를 제조하고 94oC에서 5분간 방치하여 reverse transcriptase를 불활성화 시켰다. 이후의 PCR 조건은 94에서 30초(denaturation), 50oC에서 30초(annealing), 72oC에서 90초(extension)의 반응을 25−35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다.
Tyrsosinase 저해활성 측정은 버섯유래의 tyrosinase와 HEM 세포 유래의 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 먼저 버섯 유래의 tyrosnase 저해능은 0.
본 실험에 사용한 담삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 2014년 6월에 경상북도 경산시 소재의 H사의 규격 포장한 중국산을 구입하여 사용하였다. 단삼 100 g에 10배의 물을 가하여 70oC에서 3시간 환류 냉각 추출한 뒤 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 획득한 추출액을 whatman No.
단삼 열수 추출물의 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 유전자 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 cell line (HEM)을 6-well에 1×105 cells/well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다.
MITF는 멜라닌합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자로 tyrosinase, TRP-1, 2의 전사를 촉진 시킨다(Busca와 Ballotti, 2000; Sassone-Corsi, 1998; Saha 등, 2006). 단삼 열수 추출물의 멜라닌 합성관련 인자 단백질 및 유전자 발현 정도를 측정하였다(Figs. 4, 5). 먼저 미백관련 단백질 발현의 경우 단삼 추출물의 농도 의존적으로 발현을 저해시켰다.
먼저 버섯 유래의 tyrosnase 저해능은 0.175 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 500 µL에 10 mM L-DOPA를 녹인 기질액 200 µL 및 시료용액 100 µL의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110 U/mL) 200 µL를 첨가하여 25oC에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 측정하였으며(Yagi 등, 1986), HEM에서 유래된 tyrosinase 저해활성은 1×105개 세포에 lysis buffer (67 mM sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.1 mM phenylmethyl sulfonyfluoride) 100 µL를 첨가한 후 얼음에 방치한 후 초음파 분쇄 하였다.
멜라닌 함량 측정은 상기의 HEM세포의 원심분리 후 남은 pellet을 이용하여 멜라닌 함량 측정에 사용하였다. 상등액이 제거 된 pellet을 건조 시킨 뒤 1 N NaOH 1 mL를 넣어 80oC에서 1시간 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
미백관련 인자 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 cell line (HEM)을 6-well에 1×105 cells/well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다.
세포 내 cAMP 농도 측정.
세포 내 cAMP 농도는 Cayman사의 cAMP immunoassay kit (USA)를 사용하여 측정하였다. 3×105개의 HEM 세포를 0.
세포내 cAMP 활성 측정.
2). 이 3가지의 결과에서 단삼 추출물은 세포내에서 tyrosinase가 작용하는 상위단계 과정에 영향을 미쳐 활성을 억제한 것이라 추정되어 cAMP/PKA경로의 인자들의 단백질 및 유전자 발현 저해능을 측정하였다.
이후의 PCR 조건은 94에서 30초(denaturation), 50oC에서 30초(annealing), 72oC에서 90초(extension)의 반응을 25−35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다.
이후의 PCR 조건은 94에서 30초(denaturation), 50oC에서 30초(annealing), 72oC에서 90초(extension)의 반응을 25−35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.2% agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 LAS 4000 image analyzer 으로 확인하였다.
추출물의 농도를 0.5−20 µg/mL 처리 후 세포 독성을 측정한 결과 0.5−10 µg/mL의 농도까지 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어, HEM 세포를 이용한 tyrosinase, 멜라닌 생합성, 미백관련 신호전달 단백빌 및 유전자 발현 실험은 5 µg/mL 이하의 농도에서 실험을 진행하였다.
대상 데이터
4% trypan blue stain은 Gibco BRL (USA)에서 구입하여 사용하였다. cAMP kit는 Cayman (USA)에서 구매하였으며, 1차 항체 mouse anti-MITF, TRP1, TRP2, goat anti-tyrosinase 와 mouse-anti-goat IgG, rabbit-anti-mouse IgG 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (USA)에서 구입하였다. 또한 사용된 측정기기는 ELISA reader (Tecan, Austria)를 이용하여 분석하였다.
본 실험에 사용한 담삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 2014년 6월에 경상북도 경산시 소재의 H사의 규격 포장한 중국산을 구입하여 사용하였다. 단삼 100 g에 10배의 물을 가하여 70oC에서 3시간 환류 냉각 추출한 뒤 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다.
또한 상위단계 인자인 PKA, ERK, CREB 단백질의 발현량을 측정한 결과 CREB 및 인산화된 CREB의 단백질 발현저해는 미비하였으나, 멜라닌 생합성에 직접 관여하는 PKA와 인산된 ERK의 단백질 발현량이 급격하게 줄어드는 것을 확인하였다. 단삼 추출물의 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 유전자발현에 미치는 영향을 확인한 결과 미백관련 단백질 발현 저해능과 유사한 결과를 나타내었다. 단삼 열수 추출물 농도 5 µg/mL에서 대조군과 비교하여 tyrosinase, TRP-1의 경우 40%의 저해능을 나타내었으며, MITF의 경우는 50% 이상의 발현 저해를 나타내었다.
버섯유래의 tyrosinase 저해능 측정결과 1,000 µg/mL의 농도에서 42%의 저해율을 나타내었으며, HEM 세포내의 tyrosinase, 멜라닌 생합성 저해능은 5 µg/mL에서 26, 25%의 저해능을 나타내었다. 단삼 추출물의 미백과 관련된 tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), microphthalmia associated transcription factor (MITF)의 단백질 및 유전자 양이 감소함을 나타내었다. 또한 그 상위 단계인 cAMP 발현이 5 µg/mL 농도에서 41% 감소하는 것을 확인하였다.
단삼의 열수 추출물이 cAMP를 저해함으로서 tyrosinase 활성뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2, MITF의 단백질 및 유전자 발현을 효과적으로 저해함을 확인하였으며, 단삼 추출물이 PKA의 단백질 발현을 감소 시켜 멜라닌 생성에 있어서 분자적 기작의 상위에 위치하는 신호전달을 억제함을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 단삼 추출물이 cAMP/PKA 경로에서 cAMP, PKA의 발현 저해를 통해 하위 단백질 및 유전자들의 발현을 효과적으로 저해하여 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 사료된다.
따라서 본 연구에서는 먼저 버섯 유래의 tyrosinase를 사용하여 1, 10, 100, 1,000 µg/mL 의 단삼 추출물을 처리하여 효소활성을 측정한 결과 1,000 µg/mL의 농도에서 42%의 저해능을 나타내었다.
또한 그 상위 단계인 cAMP 발현이 5 µg/mL 농도에서 41% 감소하는 것을 확인하였다.
특히 tyrosinase의 경우 5 µg/mL에서 57%의 발현을 저해하여 가장 높은 저해능을 나타내었으며, MITF는 45%, TRP-1은 48%, TRP-2는 22%의 발현 저해능을 나타내었다. 또한 상위단계 인자인 PKA, ERK, CREB 단백질의 발현량을 측정한 결과 CREB 및 인산화된 CREB의 단백질 발현저해는 미비하였으나, 멜라닌 생합성에 직접 관여하는 PKA와 인산된 ERK의 단백질 발현량이 급격하게 줄어드는 것을 확인하였다. 단삼 추출물의 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 유전자발현에 미치는 영향을 확인한 결과 미백관련 단백질 발현 저해능과 유사한 결과를 나타내었다.
또한, 세포수준에서의 tyrosinase 활성을 억제하는 알아보기 위하여 HEM 세포에 단삼 추출물 0.5, 1, 5 µg/ mL의 농도로 처리한 결과 각각 6, 13, 26%로 농도 의존적 저해능을 나타내었다(Fig. 2).
2). 이 결과에서 단삼 열수 추출물이 멜라닌 합성 억제 효과는 세포에 작용하여 tyrosinase의 활성을 억제하는 것에 기인하는 것을 알 수 있다. 이는 멜라닌 생합성 저해능 5 µg/mL에서 26%의 저해능을 나타낸 것과 비교시 유사한 결과를 나타내어 높은 상관 관계를 나타내었다(Fig.
단삼의 열수 추출물이 cAMP를 저해함으로서 tyrosinase 활성뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2, MITF의 단백질 및 유전자 발현을 효과적으로 저해함을 확인하였으며, 단삼 추출물이 PKA의 단백질 발현을 감소 시켜 멜라닌 생성에 있어서 분자적 기작의 상위에 위치하는 신호전달을 억제함을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 단삼 추출물이 cAMP/PKA 경로에서 cAMP, PKA의 발현 저해를 통해 하위 단백질 및 유전자들의 발현을 효과적으로 저해하여 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 사료된다. 이는 단삼의 미백 기능성 화장품 소재로서 가능성을 시사한다.
멜라닌합성의 세포내 신호전달 기전 중 cyclic adenosine monophosphate (cAMP)/protein kinase A (PKA) 경로가 멜라닌 합성의 주요 경로로서 자외선에 피부가 노출되 었을 때 멜라닌 세포의 cAMP가 증가되고 하류 신호전달 물질인 PKA를 활성화시키며, cAMP reponse element binding protein (CREB)을 거쳐 microphthalmia associatedntranscription factor (MITF)의 발현을 증가시킨다(Sassone-Corsi, 1998; Busca 와 Ballotti, 2000). MITF는 멜라닌합성 과정에 서 중요한 전사 조절 인자로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진한다 (Busca와 Ballotti, 2000; Saha 등, 2006).
단 삼의 주요 성분에는 어떤 것들이 있는가?
단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 꿀풀과에 속하는 다년생 초본 약용식물로 뿌리의 색이 붉은 특징을 가지고 있으며, 뿌리는 특유의 냄새가 있고 맛은 약간 쓴맛이 난다(Kim, 1989). 단 삼의 주요 성분으로는 tanshinone I, II A, II B 등을 포함한 diterpene 화합물과 danshensu, protocatechuic aldehyde, salvialolic acid B 등을 포함하는 phenolic 화합물, baicaline, β-sitosterol, ursolic acid, vitamin E 및 tannine 등이 보고되어있다(FughBerman, 2000). 단삼의 효능으로는 항염증(Yun 등, 2007), 항혈전(Yang 등, 2007), 항산화(Yang 등, 2007; Kim과 Kim, 2008), 항알러지(Fan 등, 2009), 항균(Mok 등, 1994), 항암(Kim 등, 1999), 신경세포 자연사(Lee와 Kim, 2012) 및 뇌세포 보호 효과(Shim 등, 2008) 등이 보고되었으며, 현재까지의 미백효과에 대한 연구는 버섯유래 tyrosinase 저해능(Kim과 Kim, 2008)과마우스 유래의 흑생종 세포와 같은 동물 암세포를 이용한 멜라닌 생합성 저해능(Chou 등, 2009)에 대한 보고만 되어 있고, 정상 인간 표피 멜라닌 세포를 이용한 미백기전에 관한 보고는 없는 실정이다.
멜라닌이란?
표피의 기저층에 존재하는 멜라닌(melanin)은 피부색을 결정 하는 주요한 색소로서 자외선에 의한 손상을 막고 활성산소를 제거하여 피부를 보호역할을 한다(Choi 등, 2011). 그러나 이의과도한 생성은 기미, 주근깨, 피부 반점 등 유발하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 인해 세포의 사멸 및 피부암 생성이 촉진되기도 한다(Urabe 등, 1994).
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