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문제 정의
- 본 연구에서는 호르몬의 영향을 최소화하기 위하여 미성숙 생쥐를 이용하여 한국인들이 일반적으로 섭취하는 맥주와 소주에 함유되어있는 에탄올 농도를 4%, 20%로 하여 장ㆍ단 기간 복강 주사함으로써 생쥐 뇌 신경세포의 세포자멸사 및 조직학적변화를 유발하여, 세포자멸사를 관찰할 수 있는 방법인 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick and labeling)과 글루탐산 수용체(glutamate receptor), 그리고 신경세포에 발현되는 neuronal cell adhesion molecule (NCAM)의 발현 변화의 증ㆍ감 여부, 에탄올의 장ㆍ단 기간 투여가 뇌세포의 감소 및 대량손실의 원인이 세포자멸사인지, 또는 뇌세포의 변성인지, 그리고 알코올 농도 및 시간과의 관계가 체중에 어떤 영향을 미치는지를 조사하고자 하였다.
- 본 연구는 호르몬 영향을 최소화 시킬 수 있는 미성숙 생쥐를 대상으로 알코올 농도 및 시간 등의 실험기준을 마련하여 향후 인체에 유용한 자료를 제공하는 실험의 기초가 되고자 했다. 뇌세포독성에 대한 자세한 기전을 밝히기 위해서는 어떤 전사나 발현에 관계되는 세포내 2차 전달단백질인 ca2+채널과 관련된 수용체 및 Gprotein 같은 다양한 분야에서 연구가 동시에 수행되어져야 할 것이라 생각된다.
제안 방법
- 실내온도 25℃, 상대습도 50∼60%인 항온항습 조건에서 실험군은 배부에 둥근 면봉을 사용하여 70% 소독용 알코올로 약 2∼3회 도포 후 준비된 시약을 희석 에탄올을 복강 주사 하였으며, 경추탈골법을 이용하여 도살하였다.
- 2007년 3월 2일 오후 6시부터 3월 30일 까지 한양대학교 동물실험실에서 대조군(총 5개 군)과 농도 당 시간 별, 농도 당 기간 별로 normal saline 주사군, 4% 에탄올 주사군, 20% 에탄올 주사군 으로 나누어 체중 kg당 2 g의 조제된 에탄올을 같은 시간에 복강 주사하여 6시간, 24시간에 도살 군(총 9개 군)과 1주, 4주 동안 매일 같은 시간에 복강 주사한 군(총 6개 군)으로 나누었다.
- 절편 박절기(Microtome, Microm)를 사용하여 4μm로 박절한 후 슬라이드를 크실렌에 넣어 파라핀을 제거한 후 알코올 과정을 거쳐 물에 세척하였다.
- 발색이 끝난 후 slide를 DW에 2분씩 3회 세척하고 마지막으로 Mayer's hematoxylin에 10초간 대조염색한 후, Canada balsam으로 봉입하고 광학현미경으로 관찰하였다.
- 이어서 DeadEndTM Fluorometric TUNEL System Kit (Promega Co, Madison, WI, USA)를 이용하여 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick and labeling) 염색을 시행하였고, 그 후 0.1 μg/ml propidium iodide (PI; Sigma chemical Co, St. Louis,MO, USA)로 15분간 상온 암실에서 배경 염색을 시행하여 발색을 유도시킨 다음 glycerin gelly로 봉입한 후 즉시 통상적 형광현미경 (fluorescence microscope)으로 검경하여 조직에서 세포핵의 응축, 분절화 또는 세포자멸사 소체의 소견이 녹색 형광으로 관찰되면 이를 세포자멸사 양성의 소견으로 판정하였다.
- 각 군의 해당 시기에 경추 탈골법으로 도살한 후 두부를 절개하여 해부현미경 하에서 생쥐 뇌를 적출 하였다. 채취한 조직은 일반 조직화학 염색과 면역조직화학 염색을 위해 10% 중성 formalin 고정용액(10% neutral buffered formalin ; NBF) 용액에 고정(1일 1회 새로운 10% NBF 용액으로 바꾸어서 3일간 고정) 하였다.
- 각 군의 해당 시기에 경추 탈골법으로 도살한 후 두부를 절개하여 해부현미경 하에서 생쥐 뇌를 적출 하였다. 채취한 조직은 일반 조직화학 염색과 면역조직화학 염색을 위해 10% 중성 formalin 고정용액(10% neutral buffered formalin ; NBF) 용액에 고정(1일 1회 새로운 10% NBF 용액으로 바꾸어서 3일간 고정) 하였다.
- 미성숙 생쥐 뇌세포의 핵과 세포질을 관찰하기 위하여 헤마톡실린과 에오신에 5분 동안 염색한 후, 1% HCl-alcohol에 탈색시키고, 1% Ammonia Water에 청색화 과정을 거친 후 흐르는 물에 10분 동안 방치하였다. 그 후 에오신으로 2분간 세포질을 염색한 후 알코올 과정을 거쳐 탈수시켰으며, 크실렌에서 투명시킨 후 Canada balsam으로 봉입하여 영구표본을 제작하였다.
- 미성숙 생쥐 뇌세포의 핵과 세포질을 관찰하기 위하여 헤마톡실린과 에오신에 5분 동안 염색한 후, 1% HCl-alcohol에 탈색시키고, 1% Ammonia Water에 청색화 과정을 거친 후 흐르는 물에 10분 동안 방치하였다. 그 후 에오신으로 2분간 세포질을 염색한 후 알코올 과정을 거쳐 탈수시켰으며, 크실렌에서 투명시킨 후 Canada balsam으로 봉입하여 영구표본을 제작하였다.
- 미성숙 생쥐 뇌세포에서 세포자멸사를 관찰하기 위하여 생리식염수로 5분간 처리하고 PBS로 세척한 후 4% 메탄올 고정액을 조직슬라이드에 점적하고 실온에서 15분간 정치한 다음 다시 PBS로 5분씩 2번 세척하였다. 그 후 조직 내의 단백질을 제거하기 위하여 슬라이드의 조직표본을 proteinase K (0.
- 알코올에 유발된 생쥐 뇌세포의 글루탐산 수용체의 변화를 관찰하기 위하여 표본을 3% H2O2로 10분간 처리하여 내인성 효소를 제거한 후 세척하였다. 항원부활을 위하여 10 mM citric acid buffer pH6.
- 생쥐 뇌세포에서 신경세포의 부착능을 관찰하기 위하여 면역조직화학 방법을 이용하여 파라핀이 제거된 슬라이드를 3% H2O2로 10분간 처리하여 내인성 효소를 제거한 후 세척하였다. 항원부활을 위하여 10 mM citric acid buffer pH6.
- 발색이 끝난 후 slide를 DW에 2분씩 3회 세척하고 Mayer's hematoxylin에 10초간 대조염색한 후, Canada balsam으로 봉입하고 광학현미경으로 관찰하였다.
- 뇌의 일반적인 형태인 핵과 세포질을 보기위하여 H-E 염색을 실시하였다. 대뇌의 회색질과 백질을 구별 할 수 있었고 회색질에서 신경세포(신경원), 신경세포돌기 구분 할 수 있었다.
- 부챗살층, 피라미드층, 뭇모양층, 해마 형성체를 관찰하였다(Fig. 2B). 해마형성체에 존재하는 세포의 변화는 알코올농도, 시간에 변화가 없었다.
대상 데이터
- 실험동물은 3주 동안 동일한 조건으로 사육한 18∼20 g 되는 미성숙 ICR 암컷 생쥐를 각 군당 5마리로 하여 15개 군으로 나누었다 (Fig. 1).
- 생후 3주된 ICR (Institute of Cancer Research)암컷 생쥐((주) 오리엔트바이오)를 동일한 표준사료로 사육한 후 실험에 사용하였고, 사료는 삼양유지사료주식회사의 실험동물 사료를 먹게 하였다. 사육은 14/10 hrs (light/dark)의 조명조건에서, 먹이와 물을 상시 먹을 수 있도록 충분히 공급해 주었으며, 1주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 에탄올 용액은 SigmaⓇ (St.Louis,MO,USA)제품을 사용하였고, 4%, 20%, 대조군의 희석용액(pH 0.85)은 생리식염수(중외제약)를 사용하였다.
- Tip과 1 mL disposable syringe 등은 일회용품을 사용하였으며, 실험에 사용된 모든 초자기구와 해부용 가위와 핀셋 등은 121℃에서 30분간 고압증기멸균한 뒤 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 모든 시약은 별도의 표시가 없는 경우, SigmaⓇ (St.Louis,MO,USA)사의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과 에탄올 투여 군의 생쥐 몸무게를 알아보기 위하여 체중을 측정하였고, 통계적 유의성은 Student's t-test를 사용하여 실시하였으며, 유의수준은 0.05 미만으로 설정하였다.
성능/효과
- 에탄올 농도와 성장기간에 따른 생쥐의 몸무게 변화를 보면 Table 1에서 보는 바와 같이 1주후 대조군의 몸무게(g)는 21.18±0.51, 4% 에탄올 투여군 몸무게는 19.9 g±0.97, 20%에탄올 투여군의 몸무게는 19.04 g±1.51을 나타내었으며, 4주후 대조군의 몸무게는 27.58±1.15, 4% 에탄올 투여군은 25.24 g±1.20, 20% 에탄올 투여군은 24.02 g±0.63을 나타내었다.
- 1주에서 4% 에탄올 투여군은 대조군과 비교하여 평균이 1.28 g 차이가 나며, 20% 에탄올 투여군은 2.14 g 차이가 발생하였고, 4주에서 4% 에탄올 투여군은 대조군과 비교하여 평균이 2.34 g 차이가 나며, 20% 에탄올 투여군과는 3.56 g 차이가 발생하였으며, 이를 통하여 1주에는 각 군당의 몸무게 차이가 없었으나, 4주에는 대조군과 4%와 20% 에탄올 투여 군의 몸무게가 대조군에 비하여 2.34g, 3.56 g 감소한 것으로 나타났으며, t-값은 각각 0.01로서 대조군과의 유의성이 있었다(Table 1).
- 뇌의 일반적인 형태인 핵과 세포질을 보기위하여 H-E 염색을 실시하였다. 대뇌의 회색질과 백질을 구별 할 수 있었고 회색질에서 신경세포(신경원), 신경세포돌기 구분 할 수 있었다. 대뇌 겉질 분자층에서 약간의 수평세포와 마르티노티세포의 축삭과 pyramidal cell, 방추세포의 가지돌기를 포함하는 많은 신경섬유를 관찰 할 수 있었다.
- 대뇌의 회색질과 백질을 구별 할 수 있었고 회색질에서 신경세포(신경원), 신경세포돌기 구분 할 수 있었다. 대뇌 겉질 분자층에서 약간의 수평세포와 마르티노티세포의 축삭과 pyramidal cell, 방추세포의 가지돌기를 포함하는 많은 신경섬유를 관찰 할 수 있었다. Small pyramidal cell의 소실, 잔존하는 신경원의 종창, 핵응축, 색소성 위축 등 알코올 농도와 시간별 변화는 대뇌에서 뚜렷하게 구분 할 수는 없었다(Fig.
- 핵에 비하여 세포질이 적어 임파구와 비슷하게 핵만 염색되어 나타났다. 과립층과 분자층사이에 purkinje신경원들이 일렬로 배열된 것을 관찰 할 수 있었고, 이 세포에 가지 돌기가 나타남을 확인 할 수 있었다(Fig.2D).
- 알코올 투여 후 형광현미경(Olympus BX51, FITC filter) 관찰결과 6시간 후에 TUNEL 염색결과 대뇌에서 세포자멸사 소체가 TUNEL에 양성 결과(arrow)를 나타내었으나 대량적인 세포자멸사 소체는 발견되지 않았고(Fig. 3A), 해마형성체나, 소뇌 등에서도 거의 발견되지 않았으며 24시간 군에서는 많은 수의 뇌신경세포들이 TUNEL 양성결과를 나타냈다(Fig. 3B). 양성 부위는 대뇌 혈관분포지역에 국한되어 나타났으며 소뇌의 과립층이나 분자층에는 거의 나타나지 않았으며(Fig.
- 3B). 양성 부위는 대뇌 혈관분포지역에 국한되어 나타났으며 소뇌의 과립층이나 분자층에는 거의 나타나지 않았으며(Fig. 3D), 소뇌에서 purkinje cell은 양성결과가 나타나지 않았다. TUNEL 염색 상 세포자멸사에 민감한 희소돌기세포나 microglial cell는 뇌세포가 PI 배경염색에 빨강색으로 염색되어 구분 할 수가 없었다.
- 신경세포체들이 분포되어 있는 대뇌피질에서 글루탐산 수용체의 발현은 약하게 나타났고 작은 삼각형 모양의 신경세포들이 존재하는 과립 모양 신경원들의 염색은 좀 더 강하게 나타났다. 위축되거나 변성으로 보이는 pyramidal cell에서는 수용체의 염색성이 강하게 나타났다.
- 신경세포 부착단백질의 일종인 L1 은 크고 작은 신경세포 들이 주로 존재하는 회색질에서 신경세포들의 염색성이 다양하게 나타났으며 주로 신경아교세포들로 구성된 백색질에는 L1 염색성이 나타나지 않았다. 염색결과 성장이 활발한 신경세포에서 강하게 발현되었고 위축이나 퇴행 등으로 보이는 신경세포에서 발현은 세포질에 약하게 나타났다. 신경세포체의 크기가 큰 속피라밋층의 가지돌기를 가진 거대 신경세포들의 세포질에 강하게 염색되었다(arrow).
- 대뇌피질에서의 L1 염색의 경우, 시간이나 알코올농도 투여에 따른 염색성의 변화는 매우 차이가 없었다. 소뇌에서의 염색결과 헤마톡실린에 엷게 염색되는 분자층 내의 별신경원세포, basket cell 염색성은 나타나지 않았고, 조롱박신경원층의 일렬로 배열된 핵소체가 뚜렷하고 핵이 분명한 purkinje cell에 강하게 염색되었고 (Fig. 5A, 5B), 이 세포의 주가지 돌기에도 강하게 염색되었다. 세포질의 응축이나, 위축된 핵, 핵소체 소실, purkinje cell에서는 L1의 염색성이 나타나지 않았다.
- , 2001), 특히 에탄올 투여 후 24시간 후에 대뇌의 피질층 II에서 TUNEL 염색이 강하게 발현되었다고 보고되어, 본 실험결과와 같은 결과를 나타내었다. 그러나 시간이 1주, 4주 등 시간이 긴 군 일수록 TUNEL 염색성은 미비하거나 나타나질 않아 뇌 발달 이전과 이후의 세포사멸에 차이가 나타남을 확인할 수 있었다.
- 본 연구 결과 에탄올 투여 후 6시간, 24시간, 1주일에서는 대뇌와 소뇌의 위축 등 뚜렷한 변화는 관찰할 수 없었는데, 4주간의 장기간 투여 시 purkinje cell의 대량 소실이 소뇌의 위축이나 변성을 초래할 수 있다고 사료된다(Fig. 2). 중추신경세포들은 대사성 손상을 비롯한 여러 종류의 물리-화학적 손상에 특히 민감하다고 보고되었다.
- , 2000). 본 연구 결과 에탄올을 투여하지 않은 글루탐산 수용체 염색결과, 대조군에서는 purkinje cell에 일정하게 염색되었으나, 실험 군에서는 염색된 세포의 수적감소 및 발현감소가 확연히 나타났으며(Fig. 4), 이런 수적 감소, 발현감소가 결국 세포의 기능을 감소시키고, 이는 수많은 신경전달계에 영향을 미쳐 이상을 초래할 것이라 판단된다.
- , 2001). NCAM 염색결과 알코올투여가 길고 농도가 높은 군 일수록 NCAM의 발현이 매우 약하거나 없었다. 세포가 생존, 발달, 이주하기 위해서는 세포와 세포가 접촉되어 이웃세포에게 신호전달 등 여러 가지 기능을 수행해야 하는데, 세포 부착능의 결여는 신호전달의 감소로 세포의 이상을 초례한다고 판단된다.
후속연구
- 그러나 뇌세포 발달이 이루어지고 성장이 이루어진 3주 이후의 설치류에 에탄올 투여 후 신경세포의 조직학적변화를 알아보기 위한 연구는 매우 미흡한 실정이며, 특히 사람에게 청소년기의 음주에 대한 신경세포의 변화 및 알코올독성에 대한 실험결여, 홍보 및 교육 등이 미비한 실정이다. 또한 알코올 섭취 후 간손상 및 지방간 발생을 억제 하는 물질에 대한 연구가 수행 되고는 있으나, 향후 좀 더 많은 연구가 필요하다(Lee et al., 2014).
- 본 연구는 호르몬 영향을 최소화 시킬 수 있는 미성숙 생쥐를 대상으로 알코올 농도 및 시간 등의 실험기준을 마련하여 향후 인체에 유용한 자료를 제공하는 실험의 기초가 되고자 했다. 뇌세포독성에 대한 자세한 기전을 밝히기 위해서는 어떤 전사나 발현에 관계되는 세포내 2차 전달단백질인 ca2+채널과 관련된 수용체 및 Gprotein 같은 다양한 분야에서 연구가 동시에 수행되어져야 할 것이라 생각된다.
- 본 연구의 결과를 기초로 하여 이러한 여러 사항들을 고려하여 알맞은 실험방법을 선택해야 할 것이며 무엇보다도 에탄올을 이용한 실험에 대한 명확한 기준이 필요하다. 향후 사멸과 변성에 대한 분자적 기전에 대한 더 많은 연구가 진행되어져야 할 것이다.
- 본 연구의 결과를 기초로 하여 이러한 여러 사항들을 고려하여 알맞은 실험방법을 선택해야 할 것이며 무엇보다도 에탄올을 이용한 실험에 대한 명확한 기준이 필요하다. 향후 사멸과 변성에 대한 분자적 기전에 대한 더 많은 연구가 진행되어져야 할 것이다.
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