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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 오래전부터 식용하여 오던 약용식물중 오크라(Hibiscus esculentus), 엉컹퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense), 줄풀(Zizania latifolia), 엄나무(Kalopanax pictus) 등을 선별하여 생리활성 물질 탐색의 일환으로 항산화 효과를 검토하여 질병의 원인인 활성산소를 감소시켜 안전성이 확보된 새로운 천연항산화제로서의 이용 가능성을 확인하고자 한다.
제안 방법
- DPPH radical에 대한 소거활성은 Blois의 방법(1958)을 변형하여 측정하였다. 각 시료 1 mL에 60 μM 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH)(Sigma-Aldrich Co, Louis, MO, USA) 3 mL를 넣고 vortex한 후 실온에서 15분 동안 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH radical 소거활성(%)은 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도) × 100으로 계산하였다.
- ussuriense), 줄풀(Zizania latifolia), 엄나무(Kalopanax pictus), 오크라 (Hibiscus esculentus)를 40 mesh로 분쇄하여 사용하였다. 각 시료 추출의 최적 조건을 알아보기 위해 추출용매로 물과 ethanol 을 0~100%의 농도로 추출하여 최적 조건의 농도를 정하였다. 정해진 최적 조건의 농도에 따라 각 시료 분말 1g을 물과 ethanol 100 mL에 침지하여 추출교반기로 24시간 동안 추출하여 Whatman No.
- 시료 용액 100 μL에 5 mL의 emulsion용액을 혼합하여 vortex한 후 50oC에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 후, 470 nm에서 흡광도를 측정하여 PF값은 반응구의 흡광도/대조구의 흡광도의 비로 계산하였다.
- 시료용액 50 μL와 ABTS solution 1 mL를 혼합하여 30초간 vortex한 후 2.5분간 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하여 다음의 식에 의해 ABTS radical 소거활성(%)은 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도) × 100으로 계산하였다.
- 식물성 식품 내에 존재하는 flavonoid류, carotenoid류, phenol성 화합물 등은 대표적인 항산화 물질로 알려져 있으며, 특히 phenol성 물질은 phenolic hydroxyl기를 가지고 있어 유해한 radical 제거 효과가 뛰어나 항암 작용, 항산화 등의 생리활성을 가진다고 보고되어 있으며(Lee, 2007), phenol성 물질은 극성용매에서 용해도가 높아 유기용매로 추출했을 때 추출수율이 높은 것으로 알려져 있으나(Shin, 2003), 유기용매를 이용한 추출물은 식품에 적용시키기 어려워 본 연구에서는 식용이 가능한 물과 에탄올을 추출용매로 사용하여 연구를 진행 하였다.
- 안전한 천연물을 이용한 천연항산화제 개발 연구의 일환으로, 오크라, 엉컹퀴, 엄나무 및 줄풀 등 4종의 천연 약용식물 추출물의 항산화 활성을 측정해보았다. 추출물의 총 phenolic compounds 함량은 오크라와 엉컹퀴는 50% ethanol, 엄나무는 40% ethanol, 줄풀은 60% ethanol에서 최대용출을 나타내었으며, water 추출물에서 2.
- 오크라, 엉컹퀴, 엄나무, 줄풀 등 각 시료 추출의 용매 최적 조건을 알아보기 위해 추출용매로 물과 ethanol(10~100%)을 사용하여 ethanol 농도별 total phenolic compounds 함량을 비교하여 Figure 1-A에 나타내었다. 그 결과 오크라와 엉컹퀴는 50% ethanol extracts에서, 엄나무는 40% ethanol extracts에서, 줄풀은 60% ethanol extracts에서 가장 높은 total phenolic compounds 함량을 확인할 수 있었으며, 이를 phenolic compound 용출을 위한 최적 농도로 판단하였다.
- 원심분리 한 액을 실온에서 10분간 방치 한 후 상층액을 취해 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며, TBARs 값은 (흡광도 수치 × 0.0154)로 1 mL 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3- tetraethoxypropane(TEP)의 μM로 표시하였다.
- 각 시료 추출의 최적 조건을 알아보기 위해 추출용매로 물과 ethanol 을 0~100%의 농도로 추출하여 최적 조건의 농도를 정하였다. 정해진 최적 조건의 농도에 따라 각 시료 분말 1g을 물과 ethanol 100 mL에 침지하여 추출교반기로 24시간 동안 추출하여 Whatman No. 1 filter paper(Advantec, Tokyo, Japan)로 여과 후 필요에 따라 농축하여 추출물을 제조하여 시료로 사용 하였다.
- 지질 산화과정 중 생성되는 peroxy radical과 반응하여 불활성 물질을 형성하고, free radical에 의한 연쇄반응을 중단시키는 β-carotene linoleate system으로 지용성 물질에 대한 항산화 효과인 PF를 측정하였다(Zielinski and Kozlowska, 2000).
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 약용식물은 2014년 6월 대구 소재의 시중 한약방에서 구입한 엉컹퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense), 줄풀(Zizania latifolia), 엄나무(Kalopanax pictus), 오크라 (Hibiscus esculentus)를 40 mesh로 분쇄하여 사용하였다. 각 시료 추출의 최적 조건을 알아보기 위해 추출용매로 물과 ethanol 을 0~100%의 농도로 추출하여 최적 조건의 농도를 정하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 6회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리는 SPSS 7.5 for windows(Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균 ± 표준편차(mean±standard deviation)로 표시하였고 분산분석(ANOVA)과 Duncan의 다중 범위검정(Duncan’s multiple range test)을 실시하여 시료간의 유의차를 P<0.05 수준으로 비교 분석하였다.
이론/모형
- ABTS [2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법(1998)에 의해 측정하였다. 7 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co, Louis, MO, USA) 5 mL와 140 mM K2S2O8 88 μL를 섞어 암실에서 14~16시간 반응시켜 radical을 형성시켰다.
- PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법(1999)으로 측정하였다. 10 mg의 β-carotene(TCI, Tokyo, Japan)을 50 mL의 chloroform에 녹인 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40o C water bath에서 chloroform을 증류시킨 후 20 μL Linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H2O2를 가하여 emulsion을 만들었다.
- TBARs는 Burge와 Aust의 방법(1978)에 따라 측정하였다. 1% Linoleic acid(Wako, Osaka, Japan)와 1% Tween 40(JUNSEI, Tokyo, Japan)으로 emulsion을 만들고, 시료 0.
- Total phenolic compounds의 정량은 Folin-Denis 방법(1912)으로 측정하였으며, 시료 추출물 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent(JUNSEI, Tokyo, Japan) 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, 종료시약 Na2CO3 1 mL를 가한 후, UV-visible spectrophotometer (Optizen 2120UV Mecasys, Daejeon, Korea)로 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
성능/효과
- 4종류 약용식물 water 과 ethanol 추출물의 DPPH radical 소거능은 50 μg/mL의 저농도에서 모두 74% 이상의 높은 소거활성을 나타내었다.
- ABTS radical cation decolorization을 측정한 결과, 4종의 약용식물 water 추출물과 ethanol 추출물 100 μg/mL의 농도에서 모두 88% 이상의 높은 저해율을 나타내었다.
- 76 PF로 다른 약용식물 보다 높은 항산화 효과를 나타내었다. TBARs 생성 억제율을 측정한 결과 오크라를 제외한 3종의 약용식물 추출물 50 μg/mL phenolic 농도에서 80% 이상의 생성억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과에 따라 다양한 약용식물 추출물이 항산화 및 기능성 식품 소재로 활용이 가능하다고 판단되었다.
- 23 mg/g의 용출량을 나타내었다. 각 샘플 간에는 매우 높은 phenolic compound의 함량차이를 나타내었으며, 엄나무 물과 ethanol 추출물에서 각각 34.15 mg/g와 34.23 mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 오크라 ethanol 추출물은 5.
- 그 결과 Table 4에서와 같이 오크라, 엉컹퀴, 엄나무 및 줄풀의 water 추출물 50~200 μg/mL 처리하였을 때 1.32~1.83 PF를 나타내었고, ethanol 추출물에서는 1.39~1.82 PF를 나타내었다.
- 오크라, 엉컹퀴, 엄나무, 줄풀 등 각 시료 추출의 용매 최적 조건을 알아보기 위해 추출용매로 물과 ethanol(10~100%)을 사용하여 ethanol 농도별 total phenolic compounds 함량을 비교하여 Figure 1-A에 나타내었다. 그 결과 오크라와 엉컹퀴는 50% ethanol extracts에서, 엄나무는 40% ethanol extracts에서, 줄풀은 60% ethanol extracts에서 가장 높은 total phenolic compounds 함량을 확인할 수 있었으며, 이를 phenolic compound 용출을 위한 최적 농도로 판단하였다. 최적 용매 농도에서 약용식물 4종에 대하여 물과 ethanol 추출물의 total phenolic compounds 함량을 측정한 결과는 Table 1에서와 같이, total phenolic compounds 함량은 물추출물에서 2.
- 따라서 4종의 약용작물 추출물의 DPPH radical에 대한 소거활성을 측정한 결과는 Table 2에서와 같이 대조구인 BHT를 50 μg/mL 처리하였을 때 54.1%인 것에 비해 오크라, 엉컹퀴 및 줄풀의 water 추출물과 ethanol 추출물을 50 μg/mL 처리하였을 때 80% 이상의 높은 소거활성을 나타내었으며, 줄풀의 경우 water 추출물이 ethanol 추출물에 비해 100 μg/mL 이하의 저 농도에서 상대적으로 더 높은 항산화 효과를 나타내었다.
- 약용작물 4종에 대한 ABTS radical 제거 효과를 측정한 결과 Table 3에서와 같이 대조구인 BHT의 ABTS radical cation decolorization이 50 μg/mL의 첨가 농도에서 4.53%인 것에 비해 오크라, 엉컹퀴, 엄나무, 줄풀의 water 추출물을 50 μg/ mL 처리하였을 때 모두 약 50% 이상의 더 높은 저해율을 나타내었고, ethanol 추출물을 50 μg/mL 처리하였을 때도 역시 40% 이상의 저해율을 나타내었다.
- 엉컹퀴 및 엄나무의 water 추출물과 ethanol 추출물에서는 50 μg/mL의 저농도에서도 94% 이상의 높은 저해율을 나타내어 항산화 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
- 오크라의 경우 나머지 3종류의 약용작물에 비해 상대적으로 낮은 항산화 효과를 나타내었으나, 오크라 추출물은 첨가되는 phenolic compound에 대하여 농도 의존적으로 항산화 효과가 높아지는 양상을 나타내고 있으며, ethanol 추출물의 경우 200 μg/mL 처리에서 76%의 항산화 효과를 나타내어 4가지 약용작물 모두 지용성 물질에 대한 항산화 활성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.
- 2 PF보다는 높은 수준을 나타내었다(Andarwulan and Shetty, 1999). 이러한 결과를 통해 오크라, 엉컹퀴, 엄나무 및 줄풀 추출물이 지용성 물질에 대한 항산화 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다. Park 등(2012)은 지유, 진피, 천련자, 천문동, 청피, 편축, 하고초 등 7종의 약용작물의 water과 ethanol 추출물의 PF를 측정한 결과 천문동 water 추출물의 1.
- 이상의 결과 본 연구에 사용된 4가지 약용식물에 함유된 phenolic compound는 항산화 효과에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 따라서 오크라, 엉컹퀴, 엄나무 및 줄풀 등 4종의 천연 약용식물 추출물은 기존에 우리가 식용으로 이용하던 식물로서 안전성이 확보된 새로운 천연항산화제로서의 활용가치가 높은 자원으로 확인되었으며, 향후 다양한 생리활성 물질 탐색에 대한 연구가 진행된다면 유용한 기능성 소재로서 개발이 가능하다고 판단된다.
- 특히 줄풀의 경우 50 μg/ mL의 저 농도 water과 ethanol 추출물에서 97% 이상의 매우 높은 활성을 나타내었으며, 오크라, 엉컹퀴 및 줄풀도 150 μg/ mL이상의 첨가 농도에서 97% 이상의 ABTS radical 제거 효과를 나타내었다. 이상의 결과를 통해 본 연구에 사용된 4종의 시료 모두 친수성 및 lipophilic 물질에 대해 매우 우수한 산화 억제력을 가지고 있음이 입증되었다. Park 등(2012)은 지유, 진피, 천련자, 천문동, 청피, 편축, 하고초 등 7종의 약용작물의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 100 μg/mL 이상의 phenolic 농도에서 모두 90% 이상의 높은 ABTS radical 소거능을 나타내었다는 보고와 유사하였으며, Lee 등(2012)은 한약재 복합물의 ABTS radical 소거능이 1000 μg/mL의 농도에서 70% 이상의 소거능을 나타내었다는 결과에 비하면, 본 실험에 사용된 약용식물이 ABTS free radical에 대해 매우 우수한 산화 억제력을 가지고 있음이 확인되었다.
- 이상의 결과와 비교하였을 때, 본 연구에 사용된 4종의 약용작물은 50 μg/mL 의 농도에서 80% 이상의 소거능을 나타내어 DPPH radical에 대한 산화 억제력이 매우 우수한 것으로 판단되었다.
- ABTS radical cation decolorization을 측정한 결과, 4종의 약용식물 water 추출물과 ethanol 추출물 100 μg/mL의 농도에서 모두 88% 이상의 높은 저해율을 나타내었다. 지용성 물질에 대한 항산화 효과를 측정하기 위해 antioxidant protection factor(PF) 를 측정한 결과, 엉컹퀴 water과 ethanol 추출물 50 Ïg/mL의 저농도에서 각각 1.73과 1.76 PF로 다른 약용식물 보다 높은 항산화 효과를 나타내었다. TBARs 생성 억제율을 측정한 결과 오크라를 제외한 3종의 약용식물 추출물 50 μg/mL phenolic 농도에서 80% 이상의 생성억제 효과를 나타내었다.
- 안전한 천연물을 이용한 천연항산화제 개발 연구의 일환으로, 오크라, 엉컹퀴, 엄나무 및 줄풀 등 4종의 천연 약용식물 추출물의 항산화 활성을 측정해보았다. 추출물의 총 phenolic compounds 함량은 오크라와 엉컹퀴는 50% ethanol, 엄나무는 40% ethanol, 줄풀은 60% ethanol에서 최대용출을 나타내었으며, water 추출물에서 2.72~34.15 mg/g, ethanol 추출물에서 2.83~34.23 mg/g의 용출율을 나타내었다. 4종류 약용식물 water 과 ethanol 추출물의 DPPH radical 소거능은 50 μg/mL의 저농도에서 모두 74% 이상의 높은 소거활성을 나타내었다.
- 특히 줄풀의 경우 50 μg/ mL의 저 농도 water과 ethanol 추출물에서 97% 이상의 매우 높은 활성을 나타내었으며, 오크라, 엉컹퀴 및 줄풀도 150 μg/ mL이상의 첨가 농도에서 97% 이상의 ABTS radical 제거 효과를 나타내었다.
- 오크라의 경우 나머지 3종류의 약용작물에 비해 상대적으로 낮은 항산화 효과를 나타내었으나, 오크라 추출물은 첨가되는 phenolic compound에 대하여 농도 의존적으로 항산화 효과가 높아지는 양상을 나타내고 있으며, ethanol 추출물의 경우 200 μg/mL 처리에서 76%의 항산화 효과를 나타내어 4가지 약용작물 모두 지용성 물질에 대한 항산화 활성이 매우 높음을 확인할 수 있었다. 항산화활성 등 생리활성 효과는 일반적으로 식물에 함유된 phenolic compounds 함량이 높을수록 항산화 효과도 증가하는 것으로 알려져 있는데(Lee, 2007; Shin, 2003), 배나무 추출물(Lee et al., 2011), 지유, 진피, 천련자, 천문동, 청피, 편축, 하고초 추출물(Park et al., 2012)에서 첨가되는 phenolic compounds 함량이 높아질수록 과 항산화 효과가 높아지는 농도 의존성 상관관계를 나타낸다는 결과와 비교한 결과, 본 연구에 사용된 4종의 천연 약용식물 추출물에서도 첨가되는 phenolic compound의 함량 증가에 따라 농도 의존적으로 항산화 효과가 증가하는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과 본 연구에 사용된 4가지 약용식물에 함유된 phenolic compound는 항산화 효과에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 따라서 오크라, 엉컹퀴, 엄나무 및 줄풀 등 4종의 천연 약용식물 추출물은 기존에 우리가 식용으로 이용하던 식물로서 안전성이 확보된 새로운 천연항산화제로서의 활용가치가 높은 자원으로 확인되었으며, 향후 다양한 생리활성 물질 탐색에 대한 연구가 진행된다면 유용한 기능성 소재로서 개발이 가능하다고 판단된다.
- TBARs 생성 억제율을 측정한 결과 오크라를 제외한 3종의 약용식물 추출물 50 μg/mL phenolic 농도에서 80% 이상의 생성억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과에 따라 다양한 약용식물 추출물이 항산화 및 기능성 식품 소재로 활용이 가능하다고 판단되었다.
- 1%인 것에 비해 오크라, 엉컹퀴 및 줄풀의 water 추출물과 ethanol 추출물을 50 μg/mL 처리하였을 때 80% 이상의 높은 소거활성을 나타내었으며, 줄풀의 경우 water 추출물이 ethanol 추출물에 비해 100 μg/mL 이하의 저 농도에서 상대적으로 더 높은 항산화 효과를 나타내었다. 줄풀의 경우 water 추출물이 ethanol 추출물에 비해 상대적으로 다소 높은 활성을 나타내는 것은 추출물에 존재하는 phenolic profile의 차이에 기인한 것으로 추측되며, 향후 물질 동정에 대한 추가적인 연구는 진행되어야 할 것으로 판단되었다. Lee 등 (2002)은 천종의 ethanol 추출물이 500 ppm의 농도에서 41.
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