Brazzein은 열대식물인 P. brazzeana Baillon의 과실에서 분리된 가장 작은 감미단백질로 토착민들의 단맛원료로 사용되어 왔다. Brazzein은 sucrose보다 분자량 기준으로 500 ~ 2000배, 몰 기준으로 9500배 당도가 높아 감미료로써 매우 높은 평가를 받고 있다. 그러나 이 감미단백질은 재배가 어렵고 생산 비용이 높아서 brazzein 단백질의 이용 가능성을 높이기 위한 대체 생산 시스템으로 형질전환 식물체 육성 하고자 하였다. 본 연구에서는 brazzein 관련 유전자를 벼에 도입하기 위하여 식물형질전환용 Ti-plasmid에 $2{\times}CaMV\;35S$프로모터에 의해 지배되어 발현하도록 하고, 선발 마커로 bar 유전자가 삽입된 식물발현 벡터를 구축하여 A. tumefaciens EHA105에 형질전환시켜 17개의 재분화 식물체를 육성하였다. 17개 재분화 식물체는 PCR 및 RT-PCR 분석을 통하여 유전자 도입 및 발현을 확인하였으며, TaqMan PCR을 통해 single copy로 도입된 T0 세대 9개체를 선발하였다. 또한 FST 분석을 통하여 도입 유전자가 intergenic으로 삽입된 개체 5개를 선발하였다. 이들 5개체를 이용하여 western blot 분석에 의해 단백질 발현량을 분석한 결과 선발된 모든 개체에서 발현 밴드를 확인하였다. 그 중 brazzein 단백질의 발현량이 높은 개체를 TG11으로 계통화하여 후대 종자를 육성하였다. TG11 계통은 천연 감미료 brazzein을 생산하는 새로운 벼 품종을 개발하기 위한 육종 소재로 활용 가능하다고 시사된다.
Brazzein은 열대식물인 P. brazzeana Baillon의 과실에서 분리된 가장 작은 감미단백질로 토착민들의 단맛원료로 사용되어 왔다. Brazzein은 sucrose보다 분자량 기준으로 500 ~ 2000배, 몰 기준으로 9500배 당도가 높아 감미료로써 매우 높은 평가를 받고 있다. 그러나 이 감미단백질은 재배가 어렵고 생산 비용이 높아서 brazzein 단백질의 이용 가능성을 높이기 위한 대체 생산 시스템으로 형질전환 식물체 육성 하고자 하였다. 본 연구에서는 brazzein 관련 유전자를 벼에 도입하기 위하여 식물형질전환용 Ti-plasmid에 $2{\times}CaMV\;35S$ 프로모터에 의해 지배되어 발현하도록 하고, 선발 마커로 bar 유전자가 삽입된 식물발현 벡터를 구축하여 A. tumefaciens EHA105에 형질전환시켜 17개의 재분화 식물체를 육성하였다. 17개 재분화 식물체는 PCR 및 RT-PCR 분석을 통하여 유전자 도입 및 발현을 확인하였으며, TaqMan PCR을 통해 single copy로 도입된 T0 세대 9개체를 선발하였다. 또한 FST 분석을 통하여 도입 유전자가 intergenic으로 삽입된 개체 5개를 선발하였다. 이들 5개체를 이용하여 western blot 분석에 의해 단백질 발현량을 분석한 결과 선발된 모든 개체에서 발현 밴드를 확인하였다. 그 중 brazzein 단백질의 발현량이 높은 개체를 TG11으로 계통화하여 후대 종자를 육성하였다. TG11 계통은 천연 감미료 brazzein을 생산하는 새로운 벼 품종을 개발하기 위한 육종 소재로 활용 가능하다고 시사된다.
Brazzein is the smallest sweet protein and was isolated from the fruit pulp of Pentadiplandra brazzeana Baillon, native to tropical Africa. From ancient times, the indigenous people used this fruit in their diet to add sweetness to their daily food. Brazzein is 500 to 2000 times sweeter than sucrose...
Brazzein is the smallest sweet protein and was isolated from the fruit pulp of Pentadiplandra brazzeana Baillon, native to tropical Africa. From ancient times, the indigenous people used this fruit in their diet to add sweetness to their daily food. Brazzein is 500 to 2000 times sweeter than sucrose on a weight basis and 9500 times sweeter on a molar basis. This unique property has led to increasing interest in this protein. However, it is expensive and difficult to produce brazzein other than in its native growing conditions which limits its availability for use as a food additive. In this study, we report high production yields of, brazzein protein in transgenic rice plants. An ORF region encoding brazzein and driven by the $2{\times}CaMV\;35S$ promoter was introduced into rice genome (Oryza sativa Japonica) via Agrobacterium-mediated transformation. After transformation, 17 regenerated plant lines were obtained and these transgene-containing plants were confirmed by PCR analysis. In addition, the selected plant lines were analyzed by Taqman PCR and results showed that 9 T0 lines were found to have a single copy out of 17 transgenic plants. Moreover, high and genetically stable expression of brazzein was confirmed by western blot analysis. These results demonstrate that recombinant brazzein was efficiently expressed in transgenic rice plants, and that we have developed a new rice variety with a natural sweetener.
Brazzein is the smallest sweet protein and was isolated from the fruit pulp of Pentadiplandra brazzeana Baillon, native to tropical Africa. From ancient times, the indigenous people used this fruit in their diet to add sweetness to their daily food. Brazzein is 500 to 2000 times sweeter than sucrose on a weight basis and 9500 times sweeter on a molar basis. This unique property has led to increasing interest in this protein. However, it is expensive and difficult to produce brazzein other than in its native growing conditions which limits its availability for use as a food additive. In this study, we report high production yields of, brazzein protein in transgenic rice plants. An ORF region encoding brazzein and driven by the $2{\times}CaMV\;35S$ promoter was introduced into rice genome (Oryza sativa Japonica) via Agrobacterium-mediated transformation. After transformation, 17 regenerated plant lines were obtained and these transgene-containing plants were confirmed by PCR analysis. In addition, the selected plant lines were analyzed by Taqman PCR and results showed that 9 T0 lines were found to have a single copy out of 17 transgenic plants. Moreover, high and genetically stable expression of brazzein was confirmed by western blot analysis. These results demonstrate that recombinant brazzein was efficiently expressed in transgenic rice plants, and that we have developed a new rice variety with a natural sweetener.
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문제 정의
Brazzein은 sucrose보다 분자량 기준으로 500 ~ 2000배, 몰 기준으로 9500배 당도가 높아 감미료로써 매우 높은 평가를 받고 있다. 그러나 이 감미단백질은 재배가 어렵고 생산 비용이 높아서 brazzein 단백질의 이용 가능성을 높이기 위한 대체 생산 시스템으로 형질전환 식물체 육성 하고자 하였다. 본 연구에서는 brazzein 관련 유전자를 벼에 도입하기 위하여 식물형질전환용 Ti-plasmid에 2 x CaMV 35S 프로모터에 의해 지배되어 발현하도록 하고, 선발 마커로 bar 유전자가 삽입된 식물발현 벡터를 구축하여 A.
따라서 본 연구에서는 천연 감미단백질로 알려진 brazzein 단백질을 벼 세포에 발현시키고자, brazzein 관련 유전자가 삽입된 Ti-plasmid를 Agrobacterium법에 의해 형질전환 한 후, 벼 게놈에 도입 및 발현 여부를 분석하여 brazzein단백질의 안정적 발현 계통을 육성하고자 한다.
본 연구에서는 brazzein 감미단백질을 벼에 도입하여 얻어진 형질전환 벼로부터 유전자의 안정적 발현 및 후대 육성에 대하여 기술 하였다. 선발된 형질전환 계통은 single copy이면서 intergenic 계통을 선발하여 도입 유전자 brazzein 단백질의 발현이 가장 높은 TG11 계통을 선발하고 후대 종자를 확보하였다.
2007). 열대식물인 P. brazzeana Baillon의 과실유래 brazzein은 본래의 환경 이외의 다른 곳에서 재배하는 것은 비용이 많이 들고 때로는 재배가 불가능하기 때문에 brazzein 단백질의 이용 가능성을 높이기 위한 대체 생산시스템으로 형질전환 식물체 육성 하고자 하였다.
제안 방법
tumefaciensEHA105에 형질전환시켜 17개의 재분화 식물체를 육성하였다. 17개 재분화 식물체는 PCR 및 RT-PCR 분석을 통하여 유전자 도입 및 발현을 확인하였으며, TaqMan PCR을 통해 single copy로 도입된 T0 세대 9개체를 선발하였다. 또한 FST 분석을 통하여 도입 유전자가 intergenic으로 삽입된 개체 5개를 선발하였다.
3일 후 감염된 callus를 멸균된 증류수로 3회이상 세척하여 400 mg/L carbenicillin과 6 mg/L PPT(phosphinothricin)가 들어간 N6 고체배지에 16개씩 치상하고 28°C에서 4주간 암배양한 다음 0.2 mg/L NAA,2 mg/L Kinetin, 400 mg/L carbenicillin, 6 mg/L PPT가 포함된 MS고체배지에 2주마다 계대배양을 실시하여 재분화를 유도하였다(Jung et al. 2014; Jung et al. 2017).
4주간 암배양하여 형성된 callus를 선발하여 100 mM acetosyringon이 들어간 Agrobacterium현탁액에 담가 10분간 접종한 다음 callus를 멸균된필터페이퍼 위에 5분간 건조시킨 후 2 mg/L 2,4,-D와 10 mg/Lglucose, 100 mM acetosyringon이 포함된 N6 고체배지에 치상하여 25°C에서 3일간 공동배양 하였다.
Brazzein 유전자가 안정적으로 발현하는 형질전환 식물체들로부터 유전자가 single copy로 도입된 개체를 효율적으로 선발하기 위하여 TaqMan PCR 분석을 수행하였다(Jung et al. 2015). TaqMan probe PCR 반응 조건은 95°C에서 10분간 predenaturation 시킨 후, 95°C에서 20초 denuaturation, 56°C에서 1분 annealing을 40회 반복 실시하였고, annealing 반응 중에 fluorescein FAM이 활성화 될 때마다 탐지된 cycle수는 amplification plots로 표현하였다.
각각의 T0 라인으로부터 동일한 양의 총 단백질 20 µg/lane을 12% SDS polyacrylamide gels에서 분리하고(Laemmli, 1970), semi-dry transfer (5 mA /m2, 15분)에 의해 PVDF membrane (Bio-Rad, Korea)으로 옮겼다. FLAG HRP antiflag을 1차항체(1 : 1000, v/v)로 사용하고, anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase (Roche, Korea)를 2차항체(1 : 3000, v/v)로 사용 하여 검출하였다.
PCR 반응은 94°C에서 4분간 predenaturation 시킨 후, 94°C에서 30초간 denaturation, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 하였으며, 마지막으로 72°C에서 5분간 extension을 실시하였다.
PCR 반응은 94°C에서 4분간 predenaturation 시킨 후, 94°C에서 30초간 denaturation, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 하였으며, 마지막으로 72°C에서 5분간 extension을 실시하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel상에 영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여 band를 확인하였다(Table 1 and Fig. 2). Western blot 분석을 위하여 brazzein 유전자가 도입되어 mRNA의 발현량이 높은 형질전환체와 wild type의 잎으로부터 extraction buffer 2.
3). Single copy로 선발된 9개의 형질전환체로부터 intergenic 개체를 선발하여 후대 육성을 하기 위해 FST 분석을 수행하였다(Fig. 4). 형질전환체의 RB와 LB 인접서열을 이용하여 FST 분석을 수행한 결과 T-DNA가 intergenic으로 확인된 식물체를 5개체(TG4, TG8, TG10, TG11, TG12) 선발하였다.
TaqMan probe PCR 반응 조건은 95°C에서 10분간 predenaturation 시킨 후, 95°C에서 20초 denuaturation, 56°C에서 1분 annealing을 40회 반복 실시하였고, annealing 반응 중에 fluorescein FAM이 활성화 될 때마다 탐지된 cycle수는 amplification plots로 표현하였다. TaqMan probe PCR 검사로 증폭된 산물은 nos terminator의 특이적인 labeling한 probeprimer를 이용하여 분석되었다. 각 T0 형질전환 식물체들로부터 선발된 single copy 개체들을 이용하여 도입 유전자의 삽입위치를 확인하기 위해 Thole et al.
TaqMan probe PCR 반응 조건은 95°C에서 10분간 predenaturation 시킨 후, 95°C에서 20초 denuaturation, 56°C에서 1분 annealing을 40회 반복 실시하였고, annealing 반응 중에 fluorescein FAM이 활성화 될 때마다 탐지된 cycle수는 amplification plots로 표현하였다.
형질전환 벼로부터 brazzein 유전자의 발현량과 단백질 축적 여부를 확인하기 위하여 RT-PCR과 western blot 분석을 수행하였다. Total RNA는 FavorPrepTM Plant Total RNA Mini Kit(Favorgen, Korea)를 사용하여 분리하였고, IncloneTM One-step RT-PCR kit (Inclone Biotech, Korea)를 사용하여 total RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. PCR 반응은 94°C에서 4분간 predenaturation 시킨 후, 94°C에서 30초간 denaturation, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 하였으며, 마지막으로 72°C에서 5분간 extension을 실시하였다.
Western blot 분석을 위하여 brazzein 유전자가 도입되어 mRNA의 발현량이 높은 형질전환체와 wild type의 잎으로부터 extraction buffer 2.0M KPO4 (pH 7.8), 0.5M EDTA, Triton X-100, 1.0 M dithiothreitol (DTT), 80% glycerol and dH2O 200 µl를 사용하여 총 단백질을 추출 하였다.
TaqMan probe PCR 검사로 증폭된 산물은 nos terminator의 특이적인 labeling한 probeprimer를 이용하여 분석되었다. 각 T0 형질전환 식물체들로부터 선발된 single copy 개체들을 이용하여 도입 유전자의 삽입위치를 확인하기 위해 Thole et al. (2009)이 보고한 adapter PCR 방법을 개량하여 FSTs (flanking sequence tags) 분석을 수행하였다(Jung et al. 2015). 일차 PCR 분석은 RB인접서열 분석을 위하여 Barcode adaptor Fw (F1) 및 D35sP Rv (R1) primers를 이용하여 95°C에서 5 분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 30초, 67°C에서 1분, 72°C에서 1분간을 총 20 cycles로 증폭하였으며, 72°C에서 10분간 extension을 실시하였다.
감미단백질 brazzein 관련 유전자 (EU883595)를 벼 게놈에 도입시키고자, 먼저 식물형질전환용 Ti-plasmid에 2 x CaMV 35S 프로모터에 의해 지배되어 발현하도록 하고, 선발 마커로 bar 유전자가 삽입된 식물발현 벡터를 구축하여 A. tumefaciens EHA105에 형질전환시켜 벼 캘러스에 도입하였다(Fig. 1). 감염된 캘러스로부터 얻어진 재분화 식물체는 총 17개체였으며, 이들 잎을 이용하여 DNA를 추출한 후, 유전자 도입 여부를 확인하기 위하여 bar 유전자와 nos 터미네이터 영역의 프라이머를 작성하여 PCR 분석을 수행하였다(Fig.
1). 감염된 캘러스로부터 얻어진 재분화 식물체는 총 17개체였으며, 이들 잎을 이용하여 DNA를 추출한 후, 유전자 도입 여부를 확인하기 위하여 bar 유전자와 nos 터미네이터 영역의 프라이머를 작성하여 PCR 분석을 수행하였다(Fig. 2). 그 결과 wild-type (WT)에 비하여 17개의 재분화 식물체에서 PCR 밴드가 보였다.
이들 5개체를 이용하여 western blot 분석에 의해 단백질 발현량을 분석한 결과 선발된 모든 개체에서 발현 밴드를 확인하였다. 그 중 brazzein 단백질의 발현량이 높은 개체를 TG11으로 계통화하여 후대 종자를 육성하였다. TG11 계통은 천연 감미료 brazzein을 생산하는 새로운 벼 품종을 개발하기 위한 육종 소재로 활용 가능하다고 시사된다.
4). 따라서 brazzein 유전자가 벼 게놈에 single copy 도입되고, intergenic으로 삽입된 개체를 선발하여 western blot 분석을 실시하였다(Fig. 5). 형질전환하여 얻어진 17개체중 TG4, TG8, TG10, TG11, TG12 등 5개체 모두 도입한 brazzein 유전자가 전사 및 번역과정을 걸쳐 단백질 생산을 하고 있는 것으로 나타났다.
그러나 이 감미단백질은 재배가 어렵고 생산 비용이 높아서 brazzein 단백질의 이용 가능성을 높이기 위한 대체 생산 시스템으로 형질전환 식물체 육성 하고자 하였다. 본 연구에서는 brazzein 관련 유전자를 벼에 도입하기 위하여 식물형질전환용 Ti-plasmid에 2 x CaMV 35S 프로모터에 의해 지배되어 발현하도록 하고, 선발 마커로 bar 유전자가 삽입된 식물발현 벡터를 구축하여 A. tumefaciensEHA105에 형질전환시켜 17개의 재분화 식물체를 육성하였다. 17개 재분화 식물체는 PCR 및 RT-PCR 분석을 통하여 유전자 도입 및 발현을 확인하였으며, TaqMan PCR을 통해 single copy로 도입된 T0 세대 9개체를 선발하였다.
본 연구에서는 brazzein 감미단백질을 벼에 도입하여 얻어진 형질전환 벼로부터 유전자의 안정적 발현 및 후대 육성에 대하여 기술 하였다. 선발된 형질전환 계통은 single copy이면서 intergenic 계통을 선발하여 도입 유전자 brazzein 단백질의 발현이 가장 높은 TG11 계통을 선발하고 후대 종자를 확보하였다. 이들 계통은 brazzein 단백질의 높은 생산을 위한 대량 생산 시스템을 구축하는데 이용 가능 할 것으로 생각된다.
이때 사용한 primerset는 table 1과 같이 bar-fw 및 nos-rv로 제작하여 95°C에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 30초간 denaturation,58°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 수행하였으며, 마지막으로 72°C에서 5분간 extension을 실시하여 분석하였다(Fig. 2).
이차 PCR은 일차 PCR 생성물 1 µl을 주형으로 하여 Nos T Fw (F2) 및 Common adaptor Rv (R2) primers를 이용하여 95°C에서 5 분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 1분 30초간을 총 40 cycles로 증폭하였으며, 마지막으로 72°C에서 10분간 extension을 실시하였다.
일차 PCR 분석은 RB인접서열 분석을 위하여 Barcode adaptor Fw (F1) 및 D35sP Rv (R1) primers를 이용하여 95°C에서 5 분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 30초, 67°C에서 1분, 72°C에서 1분간을 총 20 cycles로 증폭하였으며, 72°C에서 10분간 extension을 실시하였다.
2017). 재분화 식물체 잎으로부터 brazzein 유전자의 도입을 확인하기 위해 genomic DNA를 분리하여 PCR분석을 실시하였다. 이때 사용한 primerset는 table 1과 같이 bar-fw 및 nos-rv로 제작하여 95°C에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 30초간 denaturation,58°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension 과정을 30 cycles로 수행하였으며, 마지막으로 72°C에서 5분간 extension을 실시하여 분석하였다(Fig.
증폭된 DNA 밴드는 HiYield™Gel/PCR DNA Extraction Kit (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)를 이용하여 정제하였으며 LB 2 또는 RB 2 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열 정보는 RAP-DB program과 NCBI의 Blast 프로그램(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/)을 이용하여 분석되었다.
이차 PCR은 일차 PCR 생성물 1 µl을 주형으로 하여 Nos T Fw (F2) 및 Common adaptor Rv (R2) primers를 이용하여 95°C에서 5 분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 1분 30초간을 총 40 cycles로 증폭하였으며, 마지막으로 72°C에서 10분간 extension을 실시하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 1% agarose gel에 전기영동 하여 ethidium bromide 로 10 분간 염색하여 band를 확인하였다. 증폭된 DNA 밴드는 HiYield™Gel/PCR DNA Extraction Kit (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)를 이용하여 정제하였으며 LB 2 또는 RB 2 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열 정보는 RAP-DB program과 NCBI의 Blast 프로그램(http://blast.
합성된 brazzein 유전자는 총 239 bp로 제한효소 BamHI 및 XhoI을 사용하여 pPZP-3’PinII-Bar Ti-plasmid 벡터에 클로닝 하였다.
형질전환 벼로부터 brazzein 유전자의 발현량과 단백질 축적 여부를 확인하기 위하여 RT-PCR과 western blot 분석을 수행하였다. Total RNA는 FavorPrepTM Plant Total RNA Mini Kit(Favorgen, Korea)를 사용하여 분리하였고, IncloneTM One-step RT-PCR kit (Inclone Biotech, Korea)를 사용하여 total RNA로부터 cDNA를 합성 하였다.
대상 데이터
17개 재분화 식물체는 PCR 및 RT-PCR 분석을 통하여 유전자 도입 및 발현을 확인하였으며, TaqMan PCR을 통해 single copy로 도입된 T0 세대 9개체를 선발하였다. 또한 FST 분석을 통하여 도입 유전자가 intergenic으로 삽입된 개체 5개를 선발하였다. 이들 5개체를 이용하여 western blot 분석에 의해 단백질 발현량을 분석한 결과 선발된 모든 개체에서 발현 밴드를 확인하였다.
식물 발현용 플라스미드 벡터를 구축하기 위하여 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로 부터 brazzein 유전자 정보(EU883595)를 확보하여 제한 효소 XhoI 및 BamHI을 포함하는 염기서열의 합성을 ㈜바이오니아(https://www.bioneer.co.kr/index.php/)에 의뢰하여 진행하였다(Shahina et al. 2016). 합성된 brazzein 유전자는 총 239 bp로 제한효소 BamHI 및 XhoI을 사용하여 pPZP-3’PinII-Bar Ti-plasmid 벡터에 클로닝 하였다.
형질전환 벼 육성을 위하여 농촌진흥청으로부터 분양 받은 동진 벼(Oryza sativa L. var. Japonica cv. Dongjinbyeo) 종자를 70% EtOH 및 2.5% sodium hypochlorite, 멸균된 증류수를 이용하여 소독 한 후 2 mg/L 2,4-D가 포함된 N6 고체배지에 파종하여 28°C에서 4주간 암 배양하였다.
4). 형질전환체의 RB와 LB 인접서열을 이용하여 FST 분석을 수행한 결과 T-DNA가 intergenic으로 확인된 식물체를 5개체(TG4, TG8, TG10, TG11, TG12) 선발하였다. 이들 식물체는 염색체 Os02g0672250과 Os02g0672300, Os04g0548500과 Os04g0548700, Os03g0672400과 Os03g0672500 및 Os07g0481000과 Os07g0481200사이의 영역에 안정적으로 삽입된 것을 확인하였다(Fig.
이론/모형
세포 분쇄액을 4°C에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하고 상층액을 수집하여 추가 분석에 사용 하였다. 총 단백질은 Bradford (1976)에 따라 소혈청알부민을 표준으로 사용하는 Bio-Rad 단백질 염색을 사용하여 검출되었다. 각각의 T0 라인으로부터 동일한 양의 총 단백질 20 µg/lane을 12% SDS polyacrylamide gels에서 분리하고(Laemmli, 1970), semi-dry transfer (5 mA /m2, 15분)에 의해 PVDF membrane (Bio-Rad, Korea)으로 옮겼다.
성능/효과
2). 그 결과 wild-type (WT)에 비하여 17개의 재분화 식물체에서 PCR 밴드가 보였다. 따라서 재분화 식물체들은 brazzein유전자가 벼 게놈에 안정적으로 도입된 것을 확인하였다(Fig.
5 kDa과 일치하였다. 따라서 본연구에서 개발한 형질전환 벼에서 brazzein 단백질이 안정적으로 발현하여, 후대 호모 종자를 육성하였다.
그 결과 wild-type (WT)에 비하여 17개의 재분화 식물체에서 PCR 밴드가 보였다. 따라서 재분화 식물체들은 brazzein유전자가 벼 게놈에 안정적으로 도입된 것을 확인하였다(Fig. 2).
2). 유전자가 안정적으로 발현하는 형질전환 17개체로부터 후대 육성을 위하여 single copy로 도입된 형질전환체를 선발하고자TaqMan PCR 분석을 수행한 결과 17 개의 형질전환 T0 세대의 개체들 중 9개체에서 도입유전자가 single copy로 삽입되어 있었다(Fig. 3). Single copy로 선발된 9개의 형질전환체로부터 intergenic 개체를 선발하여 후대 육성을 하기 위해 FST 분석을 수행하였다(Fig.
또한 FST 분석을 통하여 도입 유전자가 intergenic으로 삽입된 개체 5개를 선발하였다. 이들 5개체를 이용하여 western blot 분석에 의해 단백질 발현량을 분석한 결과 선발된 모든 개체에서 발현 밴드를 확인하였다. 그 중 brazzein 단백질의 발현량이 높은 개체를 TG11으로 계통화하여 후대 종자를 육성하였다.
형질전환체의 RB와 LB 인접서열을 이용하여 FST 분석을 수행한 결과 T-DNA가 intergenic으로 확인된 식물체를 5개체(TG4, TG8, TG10, TG11, TG12) 선발하였다. 이들 식물체는 염색체 Os02g0672250과 Os02g0672300, Os04g0548500과 Os04g0548700, Os03g0672400과 Os03g0672500 및 Os07g0481000과 Os07g0481200사이의 영역에 안정적으로 삽입된 것을 확인하였다(Fig. 4). 따라서 brazzein 유전자가 벼 게놈에 single copy 도입되고, intergenic으로 삽입된 개체를 선발하여 western blot 분석을 실시하였다(Fig.
5). 형질전환하여 얻어진 17개체중 TG4, TG8, TG10, TG11, TG12 등 5개체 모두 도입한 brazzein 유전자가 전사 및 번역과정을 걸쳐 단백질 생산을 하고 있는 것으로 나타났다. 그 중 TG11 개체에서 단백질의 발현이 가장 높았다(Fig.
확인된 17개 형질전환 벼에서 brazzein 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여 각각의 잎으로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR 분석을 수행한 결과 WT과 mock control (MC)에 비하여 유전자가 높게 발현 되고 있음을 확인하였다(Fig. 2). 유전자가 안정적으로 발현하는 형질전환 17개체로부터 후대 육성을 위하여 single copy로 도입된 형질전환체를 선발하고자TaqMan PCR 분석을 수행한 결과 17 개의 형질전환 T0 세대의 개체들 중 9개체에서 도입유전자가 single copy로 삽입되어 있었다(Fig.
후속연구
2016). 따라서 식품, 음료 및 의약품에 안전하게 사용할 수 있는 저칼로리 및 천연 감미료의 연구가 시급하며, 그 중 감미단백질 brazzein이 저칼로리감미료로써 잠재적인 대안이 될 수 있을 거라 생각되어진다. 이와 관련하여 재조합 단백질 생산 시스템으로 형질전환 식물체의 개발과 생물 반응기를 이용하여 유용한 물질 생산에 관련된 연구가 보고된다(Howard and Hood 2005; Hood and Jilka 1999; Yoshida and Shinmyo 2000; Daniell et al.
이들 계통은 brazzein 단백질의 높은 생산을 위한 대량 생산 시스템을 구축하는데 이용 가능 할 것으로 생각된다. 향후 본 계통을 이용하여 블라인드 테스트 분석에 의해 재조합 brazzein 단백질의 단맛 정도의 평가 및 육종 소재로 활용 가능할 것으로 시사된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
당은 무엇인가?
당은 다양한 음식에 필요한 대중적인 감미료지만 당의 섭취가 높아짐에 따라 고혈압, 당뇨병, 비만 및 치아 우식증과 같은 수많은 복잡성질환을 유발할 수 있다. 이러한 유형의 질병을 앓고 있는 환자는 저칼로리 인공 감미료인 아세설팜칼륨, 아스파탐, 사이클러메이트 및 사카린 등을 사용해왔다.
인공 감미료는 무엇을 야기하는가?
이러한 유형의 질병을 앓고 있는 환자는 저칼로리 인공 감미료인 아세설팜칼륨, 아스파탐, 사이클러메이트 및 사카린 등을 사용해왔다. 그러나 이들 인공 감미료는 방광암, 뇌종양, 심부전 및 정신적 질환과 같은 몇 가지 다른 복합성 질환을 야기한다고 하였다(Kant 2005). 따라서 인공 감미료나 설탕 대신에 단맛의 특성을 발휘하거나 미각을 수식할 수 있는 안전하고 건강한대체 감미료의 연구가 필수적이다.
복잡성질환을 앓고 있는 환자들은 무엇을 사용해왔는가?
당은 다양한 음식에 필요한 대중적인 감미료지만 당의 섭취가 높아짐에 따라 고혈압, 당뇨병, 비만 및 치아 우식증과 같은 수많은 복잡성질환을 유발할 수 있다. 이러한 유형의 질병을 앓고 있는 환자는 저칼로리 인공 감미료인 아세설팜칼륨, 아스파탐, 사이클러메이트 및 사카린 등을 사용해왔다. 그러나 이들 인공 감미료는 방광암, 뇌종양, 심부전 및 정신적 질환과 같은 몇 가지 다른 복합성 질환을 야기한다고 하였다(Kant 2005).
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