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문제 정의
- 또한 식물체내 중금속 축적에 대해 TgMTP1 유전자를 과발현 시킨 결과, 형질전환체의 세포내 액포에 흡수하여 중금속을 축적하고 있다고 하였다(Gustin 2009). 본 연구는 Gustin과 Kim(2009)에 의해 육성된 형질전환 후대 homo 계통을 이용하여 도입유전자가 안정적으로 발현하는 양상과 생육상 비교 및 세포내 중금속 흡수와 축적을 검토하여 중금속을 제거 할 수 있는 정화용 식물로의 사용 가능성에 대해 실험하였다.
제안 방법
- RT 분석에 사용한 primer set (Fw;5' GAGA-GAAAGCTTATGGAGTCTTAAGGT 3', Rv 5'ATGAATTCT-TAGCGCTCGATTTGTAT3;)을 이용하여 PCR 분석을 수행하였다(Kim et al. 2004).
- 형질전환을 위해 사용한 종자는 70% EtOH로 표면 소독한후, 1% 차염소산 나트륨 용액에 20분간 소독하였다. 그 후, 차염소산 나트륨을 제거하기 위해 멸균수로 5회 세척하고 MS (Murashige and Skoog) 기본배지에 파종하였다. 발아 2주 후, 식물체에서 callus를 유도하였으며, 또한 발아 6주 후 식물체를 형질전환을 위한 재료로 사용하였다.
- 형질전환에 의해 얻어진 T0 종자를 이용하여 Glyphosate ammonium (Pestannal; Sigma-Aldrich)을 처리하여 저항성 유무에 따라 형질전환체를 선발 한 후 T1 종자를 육성하였다. 도입유전자의 copy 수는 T1 종자를 파종하여 BSTA 처리에 의해 저항성을 보인 개체수의 비율을 계산하여 선발하였다. 이렇게 선발된 식물체에서 T2 종자 및 T3 종자를 육성하였다.
- 중금속의 농도 별 식물생육 양상을 알아보기 위해 Cd, Co, Zn, Ni 등을 각각 25, 50, 150, 50 μM 등의 농도가 함유된 MS 배지에서 생육시켰다(Kil and Kim, 2015). 발아 후 2주된 식물체로부터 callus 유도한 후, 중금속이 들어간 callus 유도배지에 계대배양하여 생장양상을 살펴보았다. 중금속 처리에 따른 생육양상을 살펴보기 위해, 미량원소가 함유한 수용액에 중금속을 처리하여 발아 후 6주된 어린 식물체의 2주간 생육상태를 조사하였다.
- 식물 형질전환용 Ti-plasmid 벡터는 pCAMBIA 302-3을 이용하여 TgMTP1 유전자를 CaMV35S 상시 발현 프로모터에 지배되도록 하였으며, 3 말단영역에 mGFP와 mHA를 연결하여 함께 발현 할 수 있도록 구축하였다(Gustin et al.2009). 애기장대에서 형질전환에 사용한 Agrobacterium 균주는 105EHA를 사용하여 floral dipping방법(Weigel and Glazebrook 2002)으로 형질전환 하였다.
- 발아 후 2주된 식물체로부터 callus 유도한 후, 중금속이 들어간 callus 유도배지에 계대배양하여 생장양상을 살펴보았다. 중금속 처리에 따른 생육양상을 살펴보기 위해, 미량원소가 함유한 수용액에 중금속을 처리하여 발아 후 6주된 어린 식물체의 2주간 생육상태를 조사하였다. 이들 실험은 3번 반복하여 실시하였으며 1번 실험에 10개체 이상 식물체를 사용하였다
- 중금속의 농도 별 식물생육 양상을 알아보기 위해 Cd, Co, Zn, Ni 등을 각각 25, 50, 150, 50 μM 등의 농도가 함유된 MS 배지에서 생육시켰다(Kil and Kim, 2015).
- 이들 T3 종자(이하 호모계통)를 이용하여 중금속의 생육상을 조사한 결과 Figure 3과 같다. 표현형을 연구하기 위해서 대조 식물인 Col-0과 Ni 및 water에 발현되고 단백질활성이 뛰어난 식물체의 T3 line을 사용하여 여러 실험을 진행하였다. Col-0 애기장대 식물에 아연과 니켈을 처리하였을 때 식물체의 키 크기는 변화가 크게 없었지만 생육상태는 니켈을 처리했을 때 상당히 나빠졌다(Fig.
- 형질전환에 의해 얻어진 T0 종자를 이용하여 Glyphosate ammonium (Pestannal; Sigma-Aldrich)을 처리하여 저항성 유무에 따라 형질전환체를 선발 한 후 T1 종자를 육성하였다. 도입유전자의 copy 수는 T1 종자를 파종하여 BSTA 처리에 의해 저항성을 보인 개체수의 비율을 계산하여 선발하였다.
- 형질전환체의 T2 세대 종자로부터 발현양 및 도입유전자가 확인된 개체를 각각 파종한 후 도입한 유전자가 호모상태인 개체로부터 T3 종자를 육성하였다. 이들 T3 종자(이하 호모계통)를 이용하여 중금속의 생육상을 조사한 결과 Figure 3과 같다.
대상 데이터
- 하지만 57, 116 lines 식물체는 4종류의 중금속에 저항성을 나타내었으며 Zn와 Ni를 처리 했을 때는 식물체 키의 크기가 각기 다른 금속에 다른 결과가 나타났다. 57 ~ 31 line은 본 연구의 116 line과 비교를 위해서 사용되었다(Kil and Kim, 2015). 물만 처리했을 때는 성장상태가 문제가 되지는 않았고 신장 크기가 작았는데 반해 아연을 처리한 과발현 식물에는 성장이 촉진됨을 보인다(Fig.
- 유전자 3말단에 GFP 유전자를 fusion 시켜 발현을 유도하였다. GFP 이미지 촬영에 사용된 현미경은 TE2000 inverted microscope (NiKon Co)를 사용하여 500 nm 와 540 nm 형광 파장에서 촬영하였다.
- 본 실험에 사용한 애기장대 종자(CS6000)은 애기장대 종자은행(http://www.arabidopsis.org)에서 분양 받아 수행하였다. 형질전환을 위해 사용한 종자는 70% EtOH로 표면 소독한후, 1% 차염소산 나트륨 용액에 20분간 소독하였다.
- 중금속 처리에 따른 생육양상을 살펴보기 위해, 미량원소가 함유한 수용액에 중금속을 처리하여 발아 후 6주된 어린 식물체의 2주간 생육상태를 조사하였다. 이들 실험은 3번 반복하여 실시하였으며 1번 실험에 10개체 이상 식물체를 사용하였다
이론/모형
- 이렇게 선발된 식물체에서 T2 종자 및 T3 종자를 육성하였다. 도입유전자의 발현분석은 RT-PCR 분석에 의해 수행하였다. RT 분석에 사용한 primer set (Fw;5' GAGA-GAAAGCTTATGGAGTCTTAAGGT 3', Rv 5'ATGAATTCT-TAGCGCTCGATTTGTAT3;)을 이용하여 PCR 분석을 수행하였다(Kim et al.
- 2009). 애기장대에서 형질전환에 사용한 Agrobacterium 균주는 105EHA를 사용하여 floral dipping방법(Weigel and Glazebrook 2002)으로 형질전환 하였다.
성능/효과
- 2A). 또한 발현된 mRNA가 단백질로 번역되어 안전한 단백질로 되었는지를 western blot 분석을 실시한 결과 Ni 과 H2O에서는 강한 signal을 보였다. 그러나 Zn 과 토양에 자란 처리구에서는 TgMTP1 유전자의 발현량이 현저히 떨어졌다(Fig.
- 2004). 선별한 116-2 line의 식물체에서 잎을 사용하여서 성공적으로 callus를 유도하였고, MS media에 Cd, Co, Zn, Ni을 여러 농도를 첨가한 중금속 저항성 실험에서 116-2 호모계통 유래 callus는 4종류의 중금속에 저항성을 나타내었으며, 그 중에서 Ni은 다른 금속에 비해 저항성이 높았다. 이런 callus 실험결과는 식물의 초기 성장 단계에서 중금속의 저항성은 식물 성장을 연구하는데 도움을 줄 수 있다.
- 식물발현용 Ti-plasmid 벡터(pCAMBIA 302-3)에 TgMTP 유전자를 재조합하여 형질전환체를 육성하고 GFP 발현 양상을 살펴본 결과, 형질전환체 잎에서 GFP 발현이 세포 내에 아주 잘 발현하고 있었다(Fig. 1A). 또한 TgMTP1 유전자가 homo 상태로 삽입되어 과발현하고 있는 T3 종자를 이용하여 Ni, Zn, H2O, 토양에서 처리된 것에, 유전자의 발현분석을 실시한 결과는 Figure 2와 같다.
- 2). 이 결과들은 중금속의 스트레스로 잘 자라지 못하는 Col-0 애기장대 식물에 비해서 형질전환체가 저항성을 보임을 입증하고 있다.
- 1999, 2000, 2004). 이러한 결과로부터 TgMTP1유전자가 꽃잎, 열매, 잎 등에서 되었음을 알 수 있다. 이들 중에서 다른 어느 기관보다 잎에서 많은 양이 관찰되었다(Fig.
- 하지만, 식물정화공정을 위해서는 식물체에 축적되는 중금속의 농도가 높을수록 토양정화식물의 효율성을 높인다. 이상의 결과로부터 MTP1유전자가 안정적으로 도입되어 발현된 형질전환 애기장대 식물체는 중금속에 의해서 발생되는 스트레스에 내성이 있음이 확인되었고 또한 중금속이 축적됨을 확인하였다. 여러 MTP family 유전자들이 안정적으로 도입되어 발현된 형질 전환체를 만드는 전략으로 사용된다면 부족한 식물정화공정의 효율적 적용식물로 활용 될 수 있을 것이다.
후속연구
- 여러 MTP family 유전자들이 안정적으로 도입되어 발현된 형질 전환체를 만드는 전략으로 사용된다면 부족한 식물정화공정의 효율적 적용식물로 활용 될 수 있을 것이다. 결론적으로 본 연구는 토양환경을 정화하여 환경을 보존하기 위한 유용한 유전자원으로 고려하면 미래의 중요한 관련 기술로써 활용 가능성이 있다. 이런 결과에 생태학적 연구결과를 보강하고, 자연상태로 유출되었을 경우를 잘 고려해서 실제환경에 적용하는 실험을 철저히 할 수 있다면 자연 속에 무분별한 중금속 유출 문제에 대한 해결방법 및 식물정화공정으로 활용가치가 있다고 사료된다.
- 이상의 결과로부터 MTP1유전자가 안정적으로 도입되어 발현된 형질전환 애기장대 식물체는 중금속에 의해서 발생되는 스트레스에 내성이 있음이 확인되었고 또한 중금속이 축적됨을 확인하였다. 여러 MTP family 유전자들이 안정적으로 도입되어 발현된 형질 전환체를 만드는 전략으로 사용된다면 부족한 식물정화공정의 효율적 적용식물로 활용 될 수 있을 것이다. 결론적으로 본 연구는 토양환경을 정화하여 환경을 보존하기 위한 유용한 유전자원으로 고려하면 미래의 중요한 관련 기술로써 활용 가능성이 있다.
- 결론적으로 본 연구는 토양환경을 정화하여 환경을 보존하기 위한 유용한 유전자원으로 고려하면 미래의 중요한 관련 기술로써 활용 가능성이 있다. 이런 결과에 생태학적 연구결과를 보강하고, 자연상태로 유출되었을 경우를 잘 고려해서 실제환경에 적용하는 실험을 철저히 할 수 있다면 자연 속에 무분별한 중금속 유출 문제에 대한 해결방법 및 식물정화공정으로 활용가치가 있다고 사료된다.
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