회분식반응조 실험을 통한 탄소원(Fumarate) 주입조건에 따른 지하수 중 탈질율 및 탈질 관련 기능성 유전자 분석 Evaluation of Denitrification Efficiency and Functional Gene Change According to Carbon(Fumarate) Concentration and Addition of Nitrate Contaminated-soil in Batch System원문보기
Nitrate is on the most seriou pollutant encountered in shallow groundwater aquifer in agricultural area. There are various remediation technologies such as ion exchange, reverse osmosis, and biological denitrification to recover from nitrate contamination. Biological denitrification by indigenous mi...
Nitrate is on the most seriou pollutant encountered in shallow groundwater aquifer in agricultural area. There are various remediation technologies such as ion exchange, reverse osmosis, and biological denitrification to recover from nitrate contamination. Biological denitrification by indigenous microorganism of the technologies has been reviewed and applied on nitrate contaminated groundwater. In this work, we selected the site where the annual nitrate (NO3−) concentration is over 105 mg/L and evaluated denitrification process with sampled soil and groundwater from 3 monitoring wells (MW4, 5, 6). In the results, the nitrate degradation rate in each well (MW 4, 5, and 6) was 25 NO3− mg/L/day, 6 NO3− mg/L/day, and 3.4 NO3− mg/L/day, respectively. Nitrate degradation rate was higher in batch system treated with 2 times higher fumarate as carbon source than control batch system (0.42M fumrate/1M NO3−), comparing with batch system with soil sample. This result indicates that increase of carbon source is more efficient to enhance denitrification rate than addition of soil sample to increase microbial dynamics. In this work, we also confirmed that monitoring method of functional genes (nirK and nosZ) involved in denitrification process can be applied to evaluated denitrifcation process possibility before application of field process such as in-situ denitrification by push-pull test.
Nitrate is on the most seriou pollutant encountered in shallow groundwater aquifer in agricultural area. There are various remediation technologies such as ion exchange, reverse osmosis, and biological denitrification to recover from nitrate contamination. Biological denitrification by indigenous microorganism of the technologies has been reviewed and applied on nitrate contaminated groundwater. In this work, we selected the site where the annual nitrate (NO3−) concentration is over 105 mg/L and evaluated denitrification process with sampled soil and groundwater from 3 monitoring wells (MW4, 5, 6). In the results, the nitrate degradation rate in each well (MW 4, 5, and 6) was 25 NO3− mg/L/day, 6 NO3− mg/L/day, and 3.4 NO3− mg/L/day, respectively. Nitrate degradation rate was higher in batch system treated with 2 times higher fumarate as carbon source than control batch system (0.42M fumrate/1M NO3−), comparing with batch system with soil sample. This result indicates that increase of carbon source is more efficient to enhance denitrification rate than addition of soil sample to increase microbial dynamics. In this work, we also confirmed that monitoring method of functional genes (nirK and nosZ) involved in denitrification process can be applied to evaluated denitrifcation process possibility before application of field process such as in-situ denitrification by push-pull test.
본 실험은 적정 반응비를 적용하여 오염현장 부지의 관측정별 질산성질소 저감 특성을 도출하기 위하여 실시되었다. Fig.
본 연구에서는, 회분식반응조 실험을 통해서 고농도 질산성질소로 오염된 지하수에 탄소원(Fumarate)주입 및 다양한 조건(토양주입, 탄소원주입 농도, 현장지하수 특성)에서 질산성질소 저감 가능성을 비교 평가하였다. 또한, 탈질화관련 유전자(nirK, nosZ)농도와 질산성질소 저감율과의 상관관계를 분석하였다.
또한, 탈질화관련 유전자(nirK, nosZ)농도와 질산성질소 저감율과의 상관관계를 분석하였다. 이를 통하여 탄소원 주입 등을 통한 조사대상 지하수에서 탈질가능성 및 탈질율을 회분식반응조에서 도출하고, 향후 원위치 탈질공정을 위한 과학적 근거자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
Genomic DNA를 추출한 후 유전자 증폭기기(Mygenie TM 32 Thermal Block, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR분석을 수행하였다. 탈질화 반응에 관여하는 효소를 구성하고 있는 기능성 유전자(nirK, nosZ)를 증폭하기 위해 사용한 primer의 염기서열, PCR산물의 증폭 크기 및 PCR 조건은 Table 1과 같다.
관측정(MW5, MW6)에서 채취된 지하수 및 토양시료를 이용하여 적극적 질산성질소 저감율을 평가하였다. 탄소원(fumarate)은 이론적 반응비의 1.
PCR반응을 수행한 후 전기영동을 수행하였다. 또한, PCR과 동일한 조건으로 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Inc.)을 실시하여 nirK와 nosZ유전자양을 모니터링 하여, 질산성질소 분해율과 비교분석하였다.
채취된 심도별 토양의 입자크기, 자갈의 함유율, 토양의 색상을 목측하고, 수분함량, pH, EC를 분석하였다. 또한, 유기물함량, 암모니아성질소, 질산성질소, 치환성 Ca, 치환성 Mg, 치환성 K, 치환성 Na, 유효인산, 가비중 진비중, 공극률을 분석함으로서 심도별 토양 물리·화학적 특성을 조사하였다. 지하수 시료는 현장수질측정항목(EC, pH 등)의 측정값이 안정될 때까지 지하수를 양수한 후 채취 하였다.
본 연구에서는, 회분식반응조 실험을 통해서 고농도 질산성질소로 오염된 지하수에 탄소원(Fumarate)주입 및 다양한 조건(토양주입, 탄소원주입 농도, 현장지하수 특성)에서 질산성질소 저감 가능성을 비교 평가하였다. 또한, 탈질화관련 유전자(nirK, nosZ)농도와 질산성질소 저감율과의 상관관계를 분석하였다. 이를 통하여 탄소원 주입 등을 통한 조사대상 지하수에서 탈질가능성 및 탈질율을 회분식반응조에서 도출하고, 향후 원위치 탈질공정을 위한 과학적 근거자료를 마련하고자 하였다.
농·축산지역 주변은 축사에서 배출되는 가축분뇨 및 경작지에서 사용되는 비료 등 잠재적인 오염원이 토양층을 통과하여 지하수로 유입되고, 유입된 질산성질소는 이동성이 매우커서 광범위한 오염을 야기하고 있다. 본 연구에서는 오염원 주변 고농도 질산성질소가 머물러 있는 hot-source zone 지하수를 대상으로 물리·화학적 방법대신에 다량의 질산성질소를 저비용으로 제거할 수 있는 탈질화를 질산성질소 오염지하수 및 토양을 이용한 회분식 반응조 실험을 통하여 진행하였다. 그 결과는 아래와 같다.
관측정 설치 시 천공장비를 이용하여 심도 1 m 간격으로 토양시료를 채취하였다. 채취된 심도별 토양의 입자크기, 자갈의 함유율, 토양의 색상을 목측하고, 수분함량, pH, EC를 분석하였다. 또한, 유기물함량, 암모니아성질소, 질산성질소, 치환성 Ca, 치환성 Mg, 치환성 K, 치환성 Na, 유효인산, 가비중 진비중, 공극률을 분석함으로서 심도별 토양 물리·화학적 특성을 조사하였다.
대상 데이터
혐기성조건의 실험을 위해 반응조는 500 ml 배양병(wheaton, Millville, New Jersey)으로, 뚜껑은 테플론 부틸 고무와 플라스틱 septum으로 구성하였으며 150℃에서 20분 동안 고압 멸균한 후 사용하였다. 또한 탄소원으로는 이전의 연구에서 탈질효율이 가장 높은 것으로 확인된 Fumarate를 사용하였다(Kim et al., 2005). 고농도로 오염된 지하수시료를 배양병의 헤드스페이스를 최대한 줄이기 위하여 전체부피의 90%인 630 ml를 각각 주입하고 탄소원(fumarate)과 질소의 이론적 반응비(0.
관측정(MW5, MW6)에서 채취된 지하수 및 토양시료를 이용하여 적극적 질산성질소 저감율을 평가하였다. 탄소원(fumarate)은 이론적 반응비의 1.5배인 0.63M fumarate/1M NO3와 이론적 반응비의 2배인 0.84M fumarate/1M NO3를 적용하였으며, 0.63M fumarate/1M NO3를 주입한 시료에는 미생물증대를 위해 토양 10 g을 추가로 주입하였다. 기타 조건들(반응조와 시료 주입량, 운전조건, 시료채취 주기, 채수 방법, 분석기기 등)은 현장부지 지하수의 질산성질소 저감 가능성 평가실험과 동일하게 진행하였다.
데이터처리
또한, RT-PCR을 이용해 관련 유전자와 탈질반응과의 상관관계를 분석하였다
이론/모형
1 mM H2SO4를 사용하였다. Fumarate분석을 위해서 SIMADZU사의 HPLC시스템(LC-30AD, SIL-30AC auto sampler)을 이용하였다. 분석 조건은 9 mM H2SO4을 이동상으로 하여 1 mL/min의 유속으로 Dr.
지하수 시료는 현장수질측정항목(EC, pH 등)의 측정값이 안정될 때까지 지하수를 양수한 후 채취 하였다. 현장수질측정값의 안정화 여부는 미국지질조사국(USGS)의 자료(USGS, 2008)를 기준으로 판단하였다.
성능/효과
3 mg/L NO3−가 검출된 지점에 10 m(내경 0.1 m)깊이 관측정 3공(MW4, MW5, MW6)을 기존 관측정(MW2, 3) 주변에 추가적으로 설치하였다(Fig. 1).
사용설명서에 따라 처음에 용해완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100, 20 mg/mL lysozyme)에 균을 부유한 후 37℃에서 30분간 반응, Proteinase K를 넣고 70℃에서 30분간 반응 과정을 순차적으로 진행하였다.
연평균 105.3 mg/L NO3−가 검출된 지점에 10 m(내경 0.1 m)깊이 관측정 3공(MW4, MW5, MW6)을 기존 관측정(MW2, 3) 주변에 추가적으로 설치하였다(Fig.
이러한 결과는, 일반적으로 원위치 생물학적 정화를 위해서 사용되는 주입-추출기술(Push-pull test) 적용시 사전 실내실험을 통해 높은 효율의 관측정 위치를 확인하는 것이 필요함을 나타낸다. 관측정별 탈질율은 상이하였으나, 주입된 탄소원 비율(0.63M fumarate/1M NO3−, 이론적비율의 1.5배) 질산성질소를 제거하기에 충분함을 확인하였다.
탈질과정에서 아질산성질소를 질소로 환원시키는 효소를 구성하는 유전자(nosZ)를 현장시료 MW2부터 MW6까지 모두 확인할 수 있었다. 또한 realtime PCR을 이용하여 탄소원을 주입 여부에 따른 nosZ를 상대적으로 정량한 결과 탄소원을 주입한 경우 활성이 보다 크게 나타남을 알 수 있었다.
3. 또한, 지하수 중 질산성질소 저감율을 향상하기 위해서는 fumarate의 주입 농도가 토양주입을 통한 미생물군집 다양성 및 미생물 양을 증가하는 것 보다 중요함을 확인할 수 있었다. 탈질과정에서 아질산성질소를 질소로 환원시키는 효소를 구성하는 유전자(nosZ)를 현장시료 MW2부터 MW6까지 모두 확인할 수 있었다.
본 실험을 통해, 기능성유전자 분석을 이용해 지하수 중 탈질을 통한 질산성질소 저감 가능성을 현장실험 적용 전에 검증할 수 있다는 것이 확인되었다.
2. 오염지하수 채취시료에 대한 최적조건의 배치실험에서 관측공별 질산성질소 평균분해속도는 MW4 시료에서 10일 동안 25 mg/L/day, MW5 시료에서 25일 동안 6.2 mg/L/day, MW6 시료에서는 55일 동안 3.4 mg/L/day로 나타났다. 즉, 동일한 지점에 설치된 관측정 간격이 1m이 내일 지라도 관측정 위치에 따라 탈질화율은 다른 것으로 확인되었다.
4 mg/L/day로 나타났다. 즉, 동일한 지점에 설치된 관측정 간격이 1m이 내일 지라도 관측정 위치에 따라 탈질화율은 다른 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 일반적으로 원위치 생물학적 정화를 위해서 사용되는 주입-추출기술(Push-pull test) 적용시 사전 실내실험을 통해 높은 효율의 관측정 위치를 확인하는 것이 필요함을 나타낸다.
지하수 중에서 고농도 질산성질소가 검출된 지점의 토양층에서도 고농도 암모니아성질소 및 질산성질소가 검출되었다. 즉, 오염지하수 주변에 축산분뇨 등 잠재오염원으로 부터 유출된 암모니아성질소가 토양층에 흡착되고, 유입된 지하수 혹은 강우에 의해 토양층 암모니아성질소가 산화되어 지속적으로 질산성질소를 배출하는 것으로 사료된다.
1. 지하수 중에서 고농도 질산성질소가 검출된 지점의 토양층에서도 고농도 암모니아성질소 및 질산성질소가 검출되었다. 즉, 오염지하수 주변에 축산분뇨 등 잠재오염원으로 부터 유출된 암모니아성질소가 토양층에 흡착되고, 유입된 지하수 혹은 강우에 의해 토양층 암모니아성질소가 산화되어 지속적으로 질산성질소를 배출하는 것으로 사료된다.
또한, 지하수 중 질산성질소 저감율을 향상하기 위해서는 fumarate의 주입 농도가 토양주입을 통한 미생물군집 다양성 및 미생물 양을 증가하는 것 보다 중요함을 확인할 수 있었다. 탈질과정에서 아질산성질소를 질소로 환원시키는 효소를 구성하는 유전자(nosZ)를 현장시료 MW2부터 MW6까지 모두 확인할 수 있었다. 또한 realtime PCR을 이용하여 탄소원을 주입 여부에 따른 nosZ를 상대적으로 정량한 결과 탄소원을 주입한 경우 활성이 보다 크게 나타남을 알 수 있었다.
후속연구
즉, 동일한 지점에 설치된 관측정 간격이 1m이 내일 지라도 관측정 위치에 따라 탈질화율은 다른 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 일반적으로 원위치 생물학적 정화를 위해서 사용되는 주입-추출기술(Push-pull test) 적용시 사전 실내실험을 통해 높은 효율의 관측정 위치를 확인하는 것이 필요함을 나타낸다. 관측정별 탈질율은 상이하였으나, 주입된 탄소원 비율(0.
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