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문제 정의
- 2). 또한 분리된 화합 물들 뿐만 아니라 그 유도체들을 합성하여 항산화 활성과 구조적인 관계를 파악하고자 하였다
- 5- diketopiperazine 유도체들 (1-5)을 분리하였다. 이렇게 분리된 화합물들에 대해 여러 가지 항산화 활성 검색을 실시하였다. 전체적인 항산화 활성 검색결과를 보면 분리한 물질들중에서는 화합물 1과 2의 결과가 좋았기 때문에 이 화합물들의 골격 즉 9번과 10번 탄소 사이에 이중결합을 도입하면 conjugation 이 증가되어 항산화과정에서 형성되는 라디칼이 더 안정화되기 때문에 라디칼 소거활성도 증가될 것으로 예상되었다.
제안 방법
- 4-7 이와 같이 젓갈의 높은 저장성과 생리활성들은 염분에 의한 효과일 뿐만 아니라 젓갈 내 미생물에 의한 항산화 효과도 기여하는 것으로 여겨졌지만 아직까지 젓 갈미생물의 항산화물질에 대한 연구는 본 연구팀에 의해 발표된 선행연구를 제외하고는 아직까지 발표된 바가 없 다.8 따라서 본 연구는 이미 뛰어난 항산화활성을 가지는 균주로 분리 보고된 바 있는 Bacillus idriensis를 대량 배양한 후 배양 추출액으로부터 항산화 활성성분을 분리하고 자 하였으며 모두 5개의 diketopiperazine 유도체들을 분리 하여 그 화학구조를 결정하였다 (Fig. 2). 또한 분리된 화합 물들 뿐만 아니라 그 유도체들을 합성하여 항산화 활성과 구조적인 관계를 파악하고자 하였다
- 추출, 분획 및 컬럼 크 로마토그래피에 사용한 모든 용매는 1급 시약을 사용하였다. RI detector^ 장착된 High performance liquid chromatography (HPLC, Dionex P580) system 을 이용하여 화합물을 분리정 제하였으며 화합물의 구조결정은 Varian NMR(300 MHz) 을 사용하였다. 항산화 활성 및 MTT 등의 측정에 UV-Vis spectrophotometer (Thermo Spectronic, England), Multi-detection microplate fluorescence spectrophotometer synergy HT(Bio- TEK instruments, USA) 를 사용하였다.
- Bacillus idriensis 균주를 Marine 배지를 사용하여 pH 7, 25 oC, 200 rpm에서 2일간 진탕 배양하여 얻어진 배양혼합액으로부터 다음과 같은 과정으로 활성물질을 정제하였다. 균체와 배양액의 혼합물에 동량의 EtOAc 를 첨가하여 30분 동안 교반하고 세포내 함유된 물질의 효과적인 추출을 위해 추가적으로 1시간 동안 sonication 한 후에 이 용액의 유기층을 분리하여 EtOAc 추출액을 얻었다.
- 균체와 배양액의 혼합물에 동량의 EtOAc 를 첨가하여 30분 동안 교반하고 세포내 함유된 물질의 효과적인 추출을 위해 추가적으로 1시간 동안 sonication 한 후에 이 용액의 유기층을 분리하여 EtOAc 추출액을 얻었다. 위의 과정을 3회 반복하여 얻어진 추출액을 원심분리하고 상층액만을 진공증발기 (Eyela Japan, N-N series) 로 농축하여 EtOAc 추출물을 얻었다 (EtOAc ext : 30.32 g). 이렇게 얻어진 조추출물을 물층과 n-BuOH 층으로 분획한 후 각각의 분획층을 농축하였다.
- 85 g 에 대하여 silica prep. TLC(20% MeOH in CHCh) 를 실시하여 모두5 개의 분획들을 얻었으며, 각각의 분획들에 대한 reversedphase HPLC(ODS-AM, 50% aq. MeOH) 를 실시하여 순수한 화합물 1-5를 각각 33.5, 18.9, 5.4, 10.2, 9.3 mg 분리하였다.
- 9 Hydroxy radical 소거능 측정: Hydroxy radical 소거 측정 실험은 Fenton 반응을 이용한 실험으로 Fenton 반응에서 발생된 hydroxy radical이 DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline- N-oxide) 와 반응하여 라디칼을 가진 DMPO-OH 로 변하기 때문에 ESR을 이용하여 흡수되는 에너지를 측정 할 수 있게 된다. 실험방법은 각 농도별 시료 20 pL 와 0.3 M DMPO 20 pL, 10 mM FeSO4 20 pL, 10 mM H2O2 20 pL 를 넣고 2.5분 간 반응 시킨 후 ESR기기로 측정하였다.10 Superoxide radical 소거능 측정: Superoxide radical 소거 측정 실험은 riboflavin에 UV를 조사하여 생긴 superoxide radical이 DMPO와 반응하여 DMPO-OH로 변하여 ESR로 측정할 수 있게 된다.
- 10 Superoxide radical 소거능 측정: Superoxide radical 소거 측정 실험은 riboflavin에 UV를 조사하여 생긴 superoxide radical이 DMPO와 반응하여 DMPO-OH로 변하여 ESR로 측정할 수 있게 된다. 실험 방법은 각 농도별 시료 20 pL 와 0.8 mM riboflavin 20 pL 와 1.6 mM EDTA 20 pL, 0.8 mM DMPO(20pL) 를 넣고 365 nm 자외선을 1 분간 조사 한 후 ESR 기기로 측정하였다.11 Peroxynitrite 소거 활성 실혐: ONOO- 소거 활성은 dihydrorhodamine 123(DHR 123)의 산화되는 정도를 측정하였다.
- 8 mM DMPO(20pL) 를 넣고 365 nm 자외선을 1 분간 조사 한 후 ESR 기기로 측정하였다.11 Peroxynitrite 소거 활성 실혐: ONOO- 소거 활성은 dihydrorhodamine 123(DHR 123)의 산화되는 정도를 측정하였다. DHR 123(5 mM) 을 dimethylformamide 로 녹여서 stock 용액은 질소로 purge하여 -80 oC에 보관하고, DHR 123 (f.
- ESR을 이용한 radical 소거 활성 실혐: DPPH radical 을 이용하여 화합물의 라디칼 소거 능력을 측정하였으며 시료를 첨가하지 않은 contr이과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다. 분리한 5개의 화합물과 합성한 3개의 유도체를 각각 2, 1, 0.
- ESR을 이용한 radical 소거 활성 실혐: DPPH radical 을 이용하여 화합물의 라디칼 소거 능력을 측정하였으며 시료를 첨가하지 않은 contr이과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다. 분리한 5개의 화합물과 합성한 3개의 유도체를 각각 2, 1, 0.5 mM 농도에서 실험하였다. 분리된 물질들중에는 화합물 2만이 2 mM 농도에서 53%정도의 소거율을 보여 주었다.
- Fenton 반응으로 발생한 hydroxy radical 과 DMPO 를 이용하여 hydroxy radical 소거율을 측정하였다. 2 mM 농도에서는 모든 화합물들이 60% 이상의 높은 소거율을 보였으며 화합물 1, 2, 6, 7, 8 의 경우에는 0.
- Superoxide radical 소거활성 실험은 riboflavin 에 365 nm 의 파장을 비춰주어서 발생하는 superoxide radical과 DMPO 를 이용하여 측정하였다. 2 mM 의 농도에서 화합물 1-8 은 각각 80.
- Peroxynitrite 소거 활성 실험: 형광물질인 DHR 123을 이용하여 ONOO- 소거 활성을 검색하였으며, 시료를 첨가하지 않은 contr이과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다. 분리한 5개의 화합물과 합성한 3개의 유도체를 각각 500, 250, 100, 50 卩M 의 농도에서 authentic perox巧nitrite 와 SIN-1 에서 유도된 peroxynitrite 의 소거율을 검색하였으며, 대조군으로는 500, 250, 100, 50 卩M L-ascorbic acid 와 penicillamine 을 사용하였다.
- Peroxynitrite 소거 활성 실험: 형광물질인 DHR 123을 이용하여 ONOO- 소거 활성을 검색하였으며, 시료를 첨가하지 않은 contr이과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다. 분리한 5개의 화합물과 합성한 3개의 유도체를 각각 500, 250, 100, 50 卩M 의 농도에서 authentic perox巧nitrite 와 SIN-1 에서 유도된 peroxynitrite 의 소거율을 검색하였으며, 대조군으로는 500, 250, 100, 50 卩M L-ascorbic acid 와 penicillamine 을 사용하였다.
- 세포내 ROS 측정: 세포내 활성 산소와 반응하여 형광물질을 만들어 내는 DCFH-DA를 사용해 세포내 존재하는 활성 산소종을 DCF fluorescence 로 측정하였다. HT 1080세포를 500 剛의 H2O2 로 처리한 후 0, 30, 60, 90, 120분마다 활성을 측정하였다.
- 세포내 ROS 측정: 세포내 활성 산소와 반응하여 형광물질을 만들어 내는 DCFH-DA를 사용해 세포내 존재하는 활성 산소종을 DCF fluorescence 로 측정하였다. HT 1080세포를 500 剛의 H2O2 로 처리한 후 0, 30, 60, 90, 120분마다 활성을 측정하였다. 모든 화합물들은 각각 500, 250, 100, 50 剛의 농도로 측정하였으며, 대조군으로는 시료를 넣지 않고 H2O2 를 처리한 contr이과 시료와 H2O2 를 모두 처리 하지 않은 blank 를 사용하여 비교하였다.
- HT 1080세포를 500 剛의 H2O2 로 처리한 후 0, 30, 60, 90, 120분마다 활성을 측정하였다. 모든 화합물들은 각각 500, 250, 100, 50 剛의 농도로 측정하였으며, 대조군으로는 시료를 넣지 않고 H2O2 를 처리한 contr이과 시료와 H2O2 를 모두 처리 하지 않은 blank 를 사용하여 비교하였다. H2O2 를 처리한 well 에서는 시간에 따라 DCF flourescence 값이 급격히 증가하였으며, H2O2를 처리하지 않은 blank는 시간에 따른 DCF flourescence 값의 변화가 거의 없었다.
- Bacillus idriensis를 대량 배양한 후에 여러 가지 크로마토그래피 기법으로 배양액의 EtOAc 추출액으로부터 5개의 2.5- diketopiperazine 유도체들 (1-5)을 분리하였다. 이렇게 분리된 화합물들에 대해 여러 가지 항산화 활성 검색을 실시하였다.
- 또한 문헌조사에서도 이와 유사한 conjugation 구조를 가진 천연물 golmaenone 이 좋은 항산화 활성을 보였다.21 따라서 보다 많은 conjugation을 가진 유도체들이 더 좋은 항산화 효과를 가질 것으로 예측 되어 2,5-diketopiperazine 의 3번과 6번 위치에 이중결합을 가진 화합물 6-8 을 합성하여 이들의 활성을 검색하였다.
대상 데이터
- 화합물의 분리에 사용한 컬럼충전물질은 RP18(YMC- GEL ODS-A, 12 nm, S-75 皿)을 사용하였으며 , TLC plate는 Silica F254s(Merck) 를 사용하였다. 추출, 분획 및 컬럼 크 로마토그래피에 사용한 모든 용매는 1급 시약을 사용하였다.
- Authentic peroxynitrite 대신에 SIN-1 을 첨가하는 경우는 동일한 방법으로 실온에서 1 시간 후에 측정하였다. ONOO- (f.c. 10 pM) 의 바팅용액은 0.3 N NaOH 를 사용하였고, excitation 파장은 485 nm, emission 파장은 530 nm 로 하였으며 실온에서 측정하였다. 그리고 실험은 triplicate 로 행하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율로 계산하였다.
데이터처리
- 3 N NaOH 를 사용하였고, excitation 파장은 485 nm, emission 파장은 530 nm 로 하였으며 실온에서 측정하였다. 그리고 실험은 triplicate 로 행하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율로 계산하였다.12세포내 활성산소종 (ROS) 소거활성 측정: 세포의 활성산소종의 생성은 DCFH-DA assay 로 측정하였다.
이론/모형
- RI detector^ 장착된 High performance liquid chromatography (HPLC, Dionex P580) system 을 이용하여 화합물을 분리정 제하였으며 화합물의 구조결정은 Varian NMR(300 MHz) 을 사용하였다. 항산화 활성 및 MTT 등의 측정에 UV-Vis spectrophotometer (Thermo Spectronic, England), Multi-detection microplate fluorescence spectrophotometer synergy HT(Bio- TEK instruments, USA) 를 사용하였다. DPPH radical, superoxide radical, hydroxy radical의 측정에는 Fourier transform electron spin resonance spectrometer JES PX2300(JEOL, Japan) 을 사용하였다.
- 그리고 실험은 triplicate 로 행하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율로 계산하였다.12세포내 활성산소종 (ROS) 소거활성 측정: 세포의 활성산소종의 생성은 DCFH-DA assay 로 측정하였다. DCFHDA( fluorescence probe 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, Sigma) 는 세포내 활성산소와 반응하여 형광물질을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는 형광을 측정함으로써 세포내의 활성 산소 농도를 측정할 수 있다.
성능/효과
- 530 nm 에서 형광 분석기로 측정하였다. 결과 및 고찰 Bacillus 泌7ensis에서 분리된 3,5-Diketopiperazines 의 구조 결정화합물 1은 흰색의 고체로 분리되었으며 13C NMR과 DEPT NMR 스펙트럼을 통하여 2개의 amide groups (-CONH-) 를 포함하는 4개의 quaternary carbons (8 169.4, 165.0, 155.3, 127.1), 4개의 methine carbons(8 130.2, 116.1, 59.2, 56.3) 및4 개의 methylene carbons(8 45.5, 36.0, 22.6, 28.4) 신호들이 관측되었다. 또한 1H NMR 스펙트럼의 aromatic region 인 87.
- 이 화합물의 屯과 13C NMR 스펙트럼은 방향족 영역을 제외하고는 화합물 1과 매우 유사하였다. 화합물 1에서는 13C NMR 스펙트럼에서 4개의 신호가 관측된 반면에 화합물 2 에는 5개의 방향족 신호가 관측되어 화합물 1 의 parahydroxyphenyl 기가 hydroxy 기가 제거된 phenyl 기로 존재 함을 알 수 있었다. 1H NMR 에서도 유사한 변화가 관측되어 6 7.
- 이러한 결과는 화합물 2에 존재하던 benzyl group 대신에 isopropyl group이 존재할 경우에 잘 설명되었다. 따라서 화합물 3은 L-valine 과 L-proline 이 cyclization 을 통하여 결합된 cyclo(L-Pro-L-Val)로 확인되었으며 NMR 데이터는 문헌치와 잘 일치하였다.15,17,18
- 마지막으로 화합물 5 또한 흰색의 고체로 분리되었으며 이 화합물의 13C NMR 스펙트럼은 화합물 4와 유사하였으며 DEPT 스펙트럼에서도 화합물 4와 동일하게 2개의 quaternary carbons, 3개의 methines, 4개의 methylenes, 2개의 methyls가 관측되었다. 하지만 1H NMR 스펙트럼에서 화합물 4와는 다르게 1개의 methyl 기가 삼중선을 나타내어 화합물 4의 측쇄 인 isobutyl 기가 sec-butyl 기로 치 환되 었을 것으로 추측되었다.
- 하지만 1H NMR 스펙트럼에서 화합물 4와는 다르게 1개의 methyl 기가 삼중선을 나타내어 화합물 4의 측쇄 인 isobutyl 기가 sec-butyl 기로 치 환되 었을 것으로 추측되었다. 이러한 측쇄사슬의 구조는 1H COSY, HMQC 및 HMBC 실험에 의해서 확인되어 이 화합물의 구조는 cyclo(L-Pro-L-Ile)로 결정되었으며 NMR 데이터는 문헌치와 잘 일치하였다.20
- Fenton 반응으로 발생한 hydroxy radical 과 DMPO 를 이용하여 hydroxy radical 소거율을 측정하였다. 2 mM 농도에서는 모든 화합물들이 60% 이상의 높은 소거율을 보였으며 화합물 1, 2, 6, 7, 8 의 경우에는 0.5 mM 농도에서도 75.2, 76.7, 79.7, 79.9, 84.6%의 높은 hydroxy radical 소거율을 나타내었다 (Fig. 3(B)).
- 먼저 authentic peroxynitrite 에 대한 소거 활성을 측정한결과 authentic peroxynitrite 를 처리하지 않은 contr 이과 비교하여 모든 시료에서 peroxynitrite 소거효과를 나타냈으며, 그 중에서 화합물 8이 가장 큰 소거효과를 보여 500, 250, 100, 50 卩M 의 농도에서 각각 92.2, 80.6, 77.3, 75.6%의 소거율을보였다. 1, 2, 6도 비교적 좋은 효과를 나타내어 500 卩M 의 농도에서 각각 62.
- 6%의 소거율을보였다. 1, 2, 6도 비교적 좋은 효과를 나타내어 500 卩M 의 농도에서 각각 62.8, 72.9, 68.7%의 소거율을 보였다 (Fig. 4). SIN-1 으로부터 유도된 ONOO- 소거활성 검색에서도 500, 250, 100, 50 卩M 의 농도에서 모든 시료가 SIN-1 을 처리하지 않은 contr이보다 높은 소거 활성을 나타내었다.
- SIN-1 으로부터 유도된 ONOO- 소거활성 검색에서도 500, 250, 100, 50 卩M 의 농도에서 모든 시료가 SIN-1 을 처리하지 않은 contr이보다 높은 소거 활성을 나타내었다. 가장 큰 소거 효과를 보인 시료는 화합물 1이며 각각의 농도에서 90.4, 90.9, 84.5, 80.5%의 소거율을 보였다. 다음으로 화합물 3 이 효과가 좋았으며 역시 각각의 농도에서 76.
- 5%의 소거율을 보였다. 다음으로 화합물 3 이 효과가 좋았으며 역시 각각의 농도에서 76.7, 73.5, 67.3, 59.5%의 소거율을 보였다. 이 외에도 화합물 2의 비교적 좋은 소거 활성을 보였으며 500 卩M 농도에서 74%의소거율을 보였다.
- 이 외에도 화합물 2의 비교적 좋은 소거 활성을 보였으며 500 卩M 농도에서 74%의소거율을 보였다. 합성 유도체인 경우에 화합물 8이 좋은 효과를 나타내어 500, 250 100 卩M 의 농도에서 각각 88.3, 78.5, 56.3%의 소거율을 보였다 (Fig. 5).
- 이렇게 분리된 화합물들에 대해 여러 가지 항산화 활성 검색을 실시하였다. 전체적인 항산화 활성 검색결과를 보면 분리한 물질들중에서는 화합물 1과 2의 결과가 좋았기 때문에 이 화합물들의 골격 즉 9번과 10번 탄소 사이에 이중결합을 도입하면 conjugation 이 증가되어 항산화과정에서 형성되는 라디칼이 더 안정화되기 때문에 라디칼 소거활성도 증가될 것으로 예상되었다. 또한 문헌조사에서도 이와 유사한 conjugation 구조를 가진 천연물 golmaenone 이 좋은 항산화 활성을 보였다.
- 전체적인 항산화 활성 검색결과를 보면 분리한 물질들중에서는 화합물 1과 2의 결과가 좋았기 때문에 이 화합물들의 골격 즉 9번과 10번 탄소 사이에 이중결합을 도입하면 conjugation 이 증가되어 항산화과정에서 형성되는 라디칼이 더 안정화되기 때문에 라디칼 소거활성도 증가될 것으로 예상되었다. 또한 문헌조사에서도 이와 유사한 conjugation 구조를 가진 천연물 golmaenone 이 좋은 항산화 활성을 보였다.21 따라서 보다 많은 conjugation을 가진 유도체들이 더 좋은 항산화 효과를 가질 것으로 예측 되어 2,5-diketopiperazine 의 3번과 6번 위치에 이중결합을 가진 화합물 6-8 을 합성하여 이들의 활성을 검색하였다.
- 2.5- Diketopiperazine 의 ESR을 이용한 DPPH radical 소거활성 실험에서는 화합물 6과 8 이 각각 2 mM 농도에서 75%, 84%의 소거율을 보였으며 hydroxy radical 소거 활성 실험에서는 화합물 6-8 모두가 매우 뛰어난 활성을 나타내어 0.05 mM 농도에서도 80% 이상의 소거율을 보였다. Authentic peroxynitrite 활성검색의 경우 화합물 8이 매우 좋은 소거 효과를 나타내었으며 50 卩M에서도 약 80%의 소거율을보였다.
- HT 1080 세포내에서 ROS 소거활성을 검색했을 경우 화합물 6-8 이 500 卩M 에서 모두 70% 이상의 좋은 소거효과를 나타내었다. 이상과 같이 3,5-diketopiperazine 의 화학구조를 변화시 켰을 때 괄목한 만한 항산화활성의 증가가 확인되었다. 2D,i5k-etopiperazine 은 현재 알려진 가장 작은 고리형 다이 펩타이드 구조 화합물로써 두 개의 아미노산이 이중 펩타이드 결합으로 연결되어 있다.
- 1H COSY 실험을 통하여 지방족 수소들 사이의 correlation 관계가 관측되었다. 8 4.20 (1H, dd, J = 10.3, 3.9 Hz) 신호는8 3.48 (1H, dd, J = 14.4, 11.0 Hz) 와 8 2.74 (1H, dd, J = 14.4, 10.3 Hz)에 나타난 신호들과 서로 짝지음을 보여 주었으며 HMQC 및 TOCSY correlation들과 같이 고려할 때 8 4.08 (1H, t, 7.6), 3.58 (2H, m), 2.34 (1H, m), 1.97(3H, m) 의 신호들도 서로 연결되어 있음이 확인되었다. 따라서 다음과 같은 부분구조가 제안되 었으며 이 러한 부분구조들은 (Fig.
- Superoxide radical 소거활성 실험은 riboflavin 에 365 nm 의 파장을 비춰주어서 발생하는 superoxide radical과 DMPO 를 이용하여 측정하였다. 2 mM 의 농도에서 화합물 1-8 은 각각 80.3, 36.9, 45.7, 51.1, 40.3, 46.1, 36.6, 45.9%의소거율을 보였으며 화합물 1 의 경우에는 0.5 mM 농도에 서도 77.2% 의 소거율을 보였다 (Fig. 3(C)).
후속연구
- 2D,i5k-etopiperazine 은 현재 알려진 가장 작은 고리형 다이 펩타이드 구조 화합물로써 두 개의 아미노산이 이중 펩타이드 결합으로 연결되어 있다. 이 화합물은 포유류를 포함하여 해양 미생물 등 많은 생명체에서 이차 대사산물로 분리되며 자연계에 광범위하게 존재한다끄 이전에는 다이펩타이드들이 단지 폴리펩타이드들을 생성하는 과정에 만들어 지는 부산물로 생각되었으나 그 이후 주목할 만한 생리활성을 가진 유도체들이 계속적으로 발견되었다끄23 따라서 2,5-diketopiperazine이 젓갈 미생물에서 발견된 것은 매우 흥미있는 결과라고 할 수 있으며 이러한 측면에서 젓갈 미생물에 대한 계속적인 연구가 진행된다면 항산화 기능을 포함한 여러 가지 생리활성을 가지는 물질을 개발하는 좋은 소재가 될 수 있을 것이다.
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