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문제 정의
- 따라서 본 연구실에서 수행하고 있는 고감도, 신속성, 재현성을 갖춘 Cronobacter 검출 기술의 예로써 나노자성입자와 항체, 리포좀을 이용하여 개발한 신속, 간편 검출법을 Cronobacter muytjensii (C. muytjensii)와 C. sakazakii 중심으로 정리하고자 한다. 한편, 서론에서 언급한 내용과 이하 방법 및 결과, 결론은 Park 등(2012), Song 등(2015), Shukla 등 (2016)의 연구논문에서 발췌한 것임을 밝혀둔다.
제안 방법
- Borosilicate tube에 C. sakazakii 배양 희석액을 농도별로 1 μL씩 가한 후 각각의 tube에 20 μL의 면역나노자성입자를 주입하여 1시간 동안 반응 시켰다.
- C. muytjensii와 C. sakazakii를 배양 후 cell을 얻고 여기에 formalin을 처리한 후(formalin-killed cell: FKCs), 토끼의 면역에 이용하였다(Park et al., 2012).
- muytjensii)과 주요 병원균인 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, E. coli O157:H7, Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes, 그리고 C. freundii와의 교차반응성을 측정하였다.
- 이 연구는 리포좀, anti-C. muytjensii IgG을 이용하여 C. muytjensii를 검출하는데 있어서 간편성, 신속성, 고감도 검출 방법에 초점을 두었다. 개발된 방법은 순수배양액에서 6.
- 개발된 검출법을 이용하여 C. sakazakii 배양액을 0, 101 -108 CFU/mL의 농도로 조절하여 실험을 수행하였다. 농도별로 희석된 C.
- 개발된 검출법의 교차반응성을 평가하기 위하여 C. sakazakii와 다른 병원성 균들 간의 교차반응을 진행하였다. 결과에서도 C.
- 즉, VRBG agar, Enterobacter sakazakii isolation agar와 Druggan–Forsythe–Iversen agar를 이용한 배지배양 방법은 24시간의 증균 배양 후 선택배양을 통한 균의 분리, 의심균의 생화학적 test, 혈청학적 test, 또는 real-time PCR 같은 분자생물학적 방법을 이용한 확인이 필요하다. 그러나, 현재의 개발된 방법은 간단하고 C. muytjensii를 항원-항체 반응의 원리를 이용하여 검출함으로써 간편성과 신속성을 향상시킨 것이다.
- 농도별로 희석된 C. sakazakii 1 mL 에 20 μL의 면역자성나노입자를 분주한 후 1시간 동안 반응시켜 면역 자성 나노입자에 C. sakazakii 를 선택적으로 결합하게 하였다.
- 리포좀을 이용한 식중독 세균의 검출의 원리는 리포좀에 포집되어 있는 형광물질의 세기를 측정하여 목표세균을 정량적으로 분석하는 것이다. 따라서 리포좀에 형광물질이 온전하게 포집 되었는지 확인하는 것이 필요한데, 이를 위하여 리포좀 희석액에 계면 활성제의 일종인 OG를 넣기 전과 후의 형광도를 측정하였다(Fig. 3). 측정 결과, Fig.
- sakazakii 를 선택적으로 결합하게 하였다. 여기에 면역리포좀을 가하여 C. sakazakii 양과 상관관계를 보이는 형광도를 측정하였다. 그 결과, 103 CFU/mL 부터 시그널을 확인할 수 있었고, 검출한계는 3.
- sakazakii IgG가 나노자성입자에 conjugation 되는 과정을 나타낸 모식도이다. 자성입자와 항체 간의 결합유무를 파악하기 위하여 Bradford assay를 이용하여 각각의 과정마다 항체 농도를 측정하였다. 이 실험에서 반응에 사용한 항체 농도는 8.
대상 데이터
- 다음, 계면 활성제의 일종인 30 mM octyl-β-D-glucopyranoside (OG) 280 μL를 넣고 리포좀을 파괴시켰다. 방출된 SRB는 흡수파장 550 nm, 여기파장 585 nm로 형광도를 측정하였다,
- 02 M TBS buffer로 세척한 다음 계면활성제의 일종인 30 mM OG 280 μL를 넣고 리포좀에 포집된 SRB들을 방출시켰다. 방출된 SRB를 흡수파장 550 nm, 여기파장 585 nm에서 형광도를 측정하였다(Fig. 1).
- 실험에 사용한 리포좀은 Table 1에서 보는 바와 같이 206 nm의 직경을, 리포좀을 이루는 이중 지질막 안쪽의 부피는 4.06 × 10-12 μL, 리포좀 입자 1개당 4.06 × 10-13 μmol의 SRB를 포집하는 것으로 나타났다.
데이터처리
- 나노자성입자를 이용한 C. sakazakii 분석 결과를 INC-ELISA assay와 비교하였다(Song and Kim, 2013).
이론/모형
- New Zealand산 흰색 암컷토끼를 이용하여 Canadian Council on Animal Care의 표준과 규격에 따라 면역을 실시하였다(Canadian Council on Animal Care, 2002). FKCs에 Freund’s incomplete adjuvant를 1:1의 비율로 혼합한 후 토끼에 접종하였다(Park et al.
- 리포좀은 Shukla 등(2011)의 방법에 따라 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE, 7.2 μmol), 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC, 14.3 μmol), 1, 2-dipalmitoyl-sn–glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (DPPG, 40.3 μmol), cholesterol (40.9 μmol), 그리고 100 mM sulforhodamine B(SRB)를 이용하여 제조하였다.
- 리포좀의 크기는 Malvern Nano-Zs particle size analyzer (Malvern, Worcestershire, UK)을 이용하여 측정하였다.
- 유아용 조제분유를 식품시료 적용시험을 위한 sample matrix로 이용하였다(Cho and Irudayaraj, 2013).
- 원심분리 후 얻어진 상등액에 caprylic acid와 ammonium sulfate 침전을 이용하여 토끼 혈액에서 분리한 혈청에서 IgG 항체를 정제하였다(McKinney and Parkinson, 1987). 정제된 항체의 역가를 측정하기 위하여 indirect noncompetitive enzyme-linked immu- nosorbent assay(INC-ELISA: 간접비경합효소면역 분석법)를 실시하였다(Song and Kim, 2013).
성능/효과
- 01 mg/mL 이었다. 1시간 반응 후 자성입자와 항체가 결합하여 만들어진 면역자성 입자를 확인한 결과 반응에 참여하지 않은 항체는 1.15 mg/mL 임을 알 수 있었다. 초기 항체농도에서 결합하지 않고 남은 항체의 농도를 빼준 결과, 나노자성입자와 결합한 항체의 농도는 7.
- 4). C. muytjensii 검출에 필요한 시간은 13시간으로 sandwich ELISA와 비교하여 더 빠르고 간단하게 검출되는 것을 알 수 있었다. 하룻밤 동안의 코팅, 6시간의 분석시간으로 0.
- C. muytjensii, C. sakazakii에 대한 항원을 면역한후 12주까지 항혈청의 역가를 INC-ELISA로 측정한 결과, 면역기간에 따른 항혈청 역가는 두 균종 모두 면역 8-9주까지 증가하는 것으로 나타났다 (Fig. 2).
- muytjensii IgG-tagged 리포좀을 이용하여 순수배양에서 C. muytjensii를 검출한 결과, 검출감도가 6.3 × 104 CFU/mL로 나타났다(Fig. 4).
- 이 방법은 순수배지와 조제분유에서 약 103 CFU/mL 의 검출한계를 나타내었다. 개발된 방법은 다른 검출법과 비교하였을 때 고가의 장비 없이 실험이 가능하며, 실험이 빠르고 간단하다는 장점이 있다. 따라서이 기술을 산업화에 응용한다면 식품의 모니터링 단계에서 오염이 의심되는 시료를 빠르게 제거함으로써 신속한 위기 대처가 가능해질 것이며, 모니터링 이후의 분석단계를 거치는 시료의 수를 현저하게 감소시킬 수 있으므로 분석에 소요되는 경비와 노동력을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.
- 개발된 방법은 순수배양액에서 6.3 × 104 CFU/mL의 검출한계를 가지며 C. muytjensii에 대하여 높은 특이성을 나타내었다.
- 개발된 측정법의 검출한계는 3.3 × 103 CFU/mL 이고, C. sakazakii를 2시간 30분 만에 검출할 수 있었으며 적정 검출범위는 103 –107 CFU/mL로 나타났다.
- 결과에서도 C. sakazakii 제외한 6종 모두 107 –108 CFU/mL의 높은 농도에서도 blank의 시그널과 거의 유사한 시그널을 나타냈고, C. sakazakii에서만 높은 시그널이 나타났다 (Fig. 7).
- 그 결과, 103 CFU/mL 부터 시그널을 확인할 수 있었고, 검출한계는 3.3 × 103 CFU/mL(Fig. 7)인 것을 확인할 수 있었다.
- 기존의 다른 검출법의 검출 한계가 1 × 105 CFU/mL 인 점을 감안한다면 새롭게 개발된 면역리포좀 기반의 면역자성 분리법은 분유 시료 내의 경쟁물질에 영향을 받지 않고 C. sakazakii를 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 증명할 수 있었다(Fig. 8).
- 나노자성입자를 이용하여 개발된 분석법과 기존에 사용되고 있는 검출법의 성능을 비교하기 위해 신속검출법으로 알려진 INC-ELISA와의 검출감도를 비교한 결과, 순수한 배지에서의 검출시 INC-ELISA는 6.2 × 105 CFU/mL에서부터 signal 이 나타났고(Fig. 7), 새롭게 개발된 면역 리포좀 기반의 면역자성분리법은 3.3 × 103 CFU/mL의 검출한계를 보여 100배 정도 민감한 것을 확인하였다.
- 나노자성입자를 이용한 검출법을 식품 시료에 적용하기 위하여 10% 조제분유를 준비하여 C. sakazakii 검사를 실시한 결과, 분유 시료 안에서 C. sakazakii 검출한계는 3.5 × 103 CFU/mL 인 것을 확인할 수 있었다.
- 이 분석법은 면역자성비드로 C. sakazakii를 선택적 분리 후 면역리포좀을 이용하여 시그널을 얻는 방법으로, 조제분유에서 C. sakazakii의 정확한 검출을 위한 고감도, 재현성, 신속, 특이성을 보유한다는 것을 확인하였다. 이 방법은 순수배지와 조제분유에서 약 103 CFU/mL 의 검출한계를 나타내었다.
- 5). 즉, C. muytjensii 이외의 균들에 대한 교차반응 없이 C. muytjensii 만을 검출하는 높은 효율성을 나타내었다.
- 7). 즉, C. sakazakii에만 특이적으로 반응하는 특이성을 확인할 수 있었다.
- 초기 항체농도에서 결합하지 않고 남은 항체의 농도를 빼준 결과, 나노자성입자와 결합한 항체의 농도는 7.20±0.01 mg/mL 이었으며, 결합률은 86.23±0.59% 임을 알 수 있었다(Table 2).
- 3). 측정 결과, Fig. 3에서 보는 바와 같이 1:103 으로 희석한 리포좀 용액에서 OG를 넣기 전과 후에 10배정도의 형광도 차이가 있는 것으로 나타났다. 리포좀 내부에 높은 농도로 포집되어 있는 SRB가 quenching effect로 인해 낮은 형광도를 보이다가 OG 첨가 후 리포좀이 깨지면서 포집되었던 SRB가 수용액 상에 분산되어 높은 형광도를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 하룻밤 동안의 코팅, 6시간의 분석시간으로 0.4-14.4 × 105 CFU/mL의 검출한계를 나타낸 Hochel과 Skvor(2009) 의 간접경합효소면역분석법과 비교해 볼 때, 여기에서 개발한 분석법은 민감도와 시간에서 더향상된 결과를 보였다.
후속연구
- 개발된 방법은 다른 검출법과 비교하였을 때 고가의 장비 없이 실험이 가능하며, 실험이 빠르고 간단하다는 장점이 있다. 따라서이 기술을 산업화에 응용한다면 식품의 모니터링 단계에서 오염이 의심되는 시료를 빠르게 제거함으로써 신속한 위기 대처가 가능해질 것이며, 모니터링 이후의 분석단계를 거치는 시료의 수를 현저하게 감소시킬 수 있으므로 분석에 소요되는 경비와 노동력을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.
- 즉, VRBG agar, Enterobacter sakazakii isolation agar와 Druggan–Forsythe–Iversen agar를 이용한 배지배양 방법은 24시간의 증균 배양 후 선택배양을 통한 균의 분리, 의심균의 생화학적 test, 혈청학적 test, 또는 real-time PCR 같은 분자생물학적 방법을 이용한 확인이 필요하다.
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