본 연구는 천식 생쥐 모델을 이용하여 사이프러스 오일(CS)이 알러지성 천식에 미치는 영향을 평가하기 위하여 수행되었다. Ovalbumin으로 천식을 유발시킨 천식 생쥐 모델을 사용하여 실험군에 0.3% CS를 3 주간, 1주 3회, 1회 30분간 분무기를 이용하여 흡입시켰다. 기도과민성, 백혈구 중 호산구 수, 폐 세포 내 면역세포와 Th2 싸이토카인의 변화를 관찰한 결과 CS를 처리한 실험군에서 기도과민성, 호산구 수 및 폐 세포 내 IL-5,IL-13 수치, 혈청내 IgE 분비량, 폐 세포 내 CCR3, CD3, CD4 세포의 수 등 모든 항목에서 현저한 감소효과를 보였다. 이러한 결과는 CS가 천식 반응의 주요인자인 Th2 싸이토카인과 호산구에 긍정적인 영향력이 있음을 시사한다. 따라서 CS는 천식 치료제로서 가능성이 있을 것으로 사료된다.
본 연구는 천식 생쥐 모델을 이용하여 사이프러스 오일(CS)이 알러지성 천식에 미치는 영향을 평가하기 위하여 수행되었다. Ovalbumin으로 천식을 유발시킨 천식 생쥐 모델을 사용하여 실험군에 0.3% CS를 3 주간, 1주 3회, 1회 30분간 분무기를 이용하여 흡입시켰다. 기도과민성, 백혈구 중 호산구 수, 폐 세포 내 면역세포와 Th2 싸이토카인의 변화를 관찰한 결과 CS를 처리한 실험군에서 기도과민성, 호산구 수 및 폐 세포 내 IL-5,IL-13 수치, 혈청내 IgE 분비량, 폐 세포 내 CCR3, CD3, CD4 세포의 수 등 모든 항목에서 현저한 감소효과를 보였다. 이러한 결과는 CS가 천식 반응의 주요인자인 Th2 싸이토카인과 호산구에 긍정적인 영향력이 있음을 시사한다. 따라서 CS는 천식 치료제로서 가능성이 있을 것으로 사료된다.
This study was aimed to evaluate the effects of Cypress oil(CS) on anti-asthmatic activities in a mouse model of allergic asthma. Using an Ovalbumin-induced allergic asthma mouse model, 0.3% of CS was administered to experimental group using a nebulizer for 3 weeks on a basis of 3 times per week and...
This study was aimed to evaluate the effects of Cypress oil(CS) on anti-asthmatic activities in a mouse model of allergic asthma. Using an Ovalbumin-induced allergic asthma mouse model, 0.3% of CS was administered to experimental group using a nebulizer for 3 weeks on a basis of 3 times per week and 30min each time. The degree of airway hypersensitivity, the number of eosinophil in white blood cells, the number of immune cells and the change of cytokine in lung tissue were evaluated. The degree of airway hypersensitivity, the number of eosinophil, IL-5 and IL-13 levels in lung tissue, IgE in serum, the number of CCR3, CD3, CD4 cells were significantly decreased in experimental group treated with CS. These results suggested that CS may have a positive effects on Th2 cytokine and eosinophils which are major factors of asthma responses. Therefore CS might be of therapeutic value in treating asthma.
This study was aimed to evaluate the effects of Cypress oil(CS) on anti-asthmatic activities in a mouse model of allergic asthma. Using an Ovalbumin-induced allergic asthma mouse model, 0.3% of CS was administered to experimental group using a nebulizer for 3 weeks on a basis of 3 times per week and 30min each time. The degree of airway hypersensitivity, the number of eosinophil in white blood cells, the number of immune cells and the change of cytokine in lung tissue were evaluated. The degree of airway hypersensitivity, the number of eosinophil, IL-5 and IL-13 levels in lung tissue, IgE in serum, the number of CCR3, CD3, CD4 cells were significantly decreased in experimental group treated with CS. These results suggested that CS may have a positive effects on Th2 cytokine and eosinophils which are major factors of asthma responses. Therefore CS might be of therapeutic value in treating asthma.
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제안 방법
t)하였다. 3주째부터 분무기를 이용하여 1% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3 회씩 2주 동안 비강 및 기도내로 흡입시키고 최종 1주간은 2% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3회씩 흡입시켰다. 이때 대조군에는 PBS 또는 Alum 만을 주사, OVA를 흡입시켰다[Fig.
생쥐의 생명유지기능(vital function)을 담당하는 호흡 기계에서 기도저항수치(Penh)에 미치는 영향을 검토하고 신체기능에 대한 안전성 평가를 목적으로 하는 Plethysmograph (BUXCO Biosystem XA, USA)는 기도 저항수치 측정시험을 무마취의 시험동물을 whole body chamber에 넣어 놓은 상태에서 기도과민성의 측정은 whole body plethysmographs인 Biosystem XA (Buxco research system, Wilmington, NC, USA) 장비를 사용하여 실시하였다. 6주간 2.5% OVA inhallation 24시간 후에, 농도별 Methachololo (Sigma)수용액을 50, 25, 12.5 6.25, 3.125 mg/ml의 농도로 분무하고, 각각의 농도에 대한 기도의 반응성은 10분 동안 연속적으로 모니터링으로 체크하였다.
CS 오일이 OVA로 유도된 천식 생쥐 모델에 미치는 약리적 효능을 알아보기 위해, Balb/c 생쥐에 OVA로 알레르기성 천식을 유발한 후, 기관지 과민성 검사, WBC 내 호산구 세포분화 비율의 변화, 폐세포 수 변화, 폐 세포의 CD3, CD4, CCR3 세포수 변화, 폐 조직 및 혈청 내의 IL-5, IL-13 및 IgE 분비량의 변화를 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
정상군은 천식유발이 잘 되었는지를 비교하기 위한 군으로 아무런 처치를 하지 않았다. 대조군은 약물의 효능을 비교하기 위해 OVA/ALUM을 복강 내 주사하여 전신 감작시킨 후 OVA를 흡입시켰다. 실험군은 아로마 오일을 생리식염수에 cypress(CS) 0.
생쥐의 생명유지기능(vital function)을 담당하는 호흡 기계에서 기도저항수치(Penh)에 미치는 영향을 검토하고 신체기능에 대한 안전성 평가를 목적으로 하는 Plethysmograph (BUXCO Biosystem XA, USA)는 기도 저항수치 측정시험을 무마취의 시험동물을 whole body chamber에 넣어 놓은 상태에서 기도과민성의 측정은 whole body plethysmographs인 Biosystem XA (Buxco research system, Wilmington, NC, USA) 장비를 사용하여 실시하였다. 6주간 2.
대조군은 약물의 효능을 비교하기 위해 OVA/ALUM을 복강 내 주사하여 전신 감작시킨 후 OVA를 흡입시켰다. 실험군은 아로마 오일을 생리식염수에 cypress(CS) 0.3%로 희석한 후 nebulizer (Buxco. USA)를 이용하여 3주간, 1주 3회 100ml씩 30분간 흡입박스 (아크릴제작, 30 cm x 45 cm) 에 분무하였다. 양성대조군으로는 Rolipram을 3 mg/kg 으로 매일 I.
5로 조정하여 상온에서 1시간 동안 방치하고 750 xg에서 5분 동안 원심분리 하였다. 이 OVA/Alum 침전물 (pellet)을 증류수를 가하여 원래의 양으로 용해한 후 100 ㎍ OVA를 0.2 ml로 조정하여 복강 내(i.p)로 주사하여 전신감작을 시켰다. 이후 2주째에 생쥐를 마취한 후 난알부민 (500 ug/ml) 100 ㎕를 기도투여 (i.
4)으로 1회 세척하였다. 이를 PE(phycoer ythrin) 형광물질이 결합된 CD3, CD4, CCR3의 항체를 시료에 가하여 4℃에서 40분간 반응시키고 염색 완충용 액으로 2회 세척한 후 세포 표면 분자들의 발현을 유세포 분석기(FACScan, BD Biosciences)로 분석하였다.
그러나 사이프러스 오일의 알러지성 염증과 그 면역기전에 대한 연구는 싸이프러스, 로즈마리, 마조람 에센셜 오일을 혼합하여 알레르기성 천식 생쥐 모델에 미치는 효과를 조사한 이 등[29]의 연구 외에 사이프러스 오일을 단독으로 사용한 연구는 전무한 실정이다. 이에 본 연구에서는 Balb/c 생쥐에 ovalbumin으로 알레르기성 천식을 유발한 후, 사이프러스 오일을 단독으로 적용하여 기도 과민성, 혈액의 WBC 내 eosinophil의 세포 비율, 총 폐포 수의 변화, CD3, CD4, CCR3의 세포수의 변화, 폐 조직내 IL-5, IL-13 발현량의 변화, 혈청 내 IgE 분비량의 변화를 관찰하였다.
p)로 주사하여 전신감작을 시켰다. 이후 2주째에 생쥐를 마취한 후 난알부민 (500 ug/ml) 100 ㎕를 기도투여 (i.t)하였다. 3주째부터 분무기를 이용하여 1% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3 회씩 2주 동안 비강 및 기도내로 흡입시키고 최종 1주간은 2% 난알부민 용액을 하루에 30 분씩 일주일에 3회씩 흡입시켰다.
천식 생쥐에서 분리한 혈청에서 각 사이토카인량을 측정하기 위해 OVA-IgE (Shibayagi, japan), enzyme-li nked immuno-sorbent assay (Biosource, USA)와 ELIS A kit (R&D system)로 생산량을 측정하였다.
폐를 분리한 세포를 2-5x105세포로 조정하여 염색 완충용액(1% 우 태아 혈청, 0.01% NaN3가 포함된 인산염 완충용액, pH7.4)으로 1회 세척하였다. 이를 PE(phycoer ythrin) 형광물질이 결합된 CD3, CD4, CCR3의 항체를 시료에 가하여 4℃에서 40분간 반응시키고 염색 완충용 액으로 2회 세척한 후 세포 표면 분자들의 발현을 유세포 분석기(FACScan, BD Biosciences)로 분석하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 기기는 Clean bench, Autoclave, Water bath, Vorter mixer(vison scientific,co.,Korea), Micro-pipet(Gilson,co.,France),spectrophotometer(Shim azue, co.,Japan), homogenizer (OMNI.co., USA)등을 사용하였다.
본 실험에 사용된 시약 중 diethyl pyrocarbo nate (DEPC), 2,7-dichlorodihydrofluore-scin diacettate (DCFH-DA), RPMI-1640, isopropano-l, 적혈구용혈액 (RBC lysis solution),dulbecco's pho-sphate buffered sal ine (D-PBS), formaldehyde, lami-de, magnesium, chlori de (MgCl2)는 Sigma 사 (USA) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)는 Hyclone 사 (Log an, USA) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
본 실험에 사용한 오일은 Cypress(Cupressus semper virens : concentration 100%)을 사용하였다. 실험에 쓰는 오일은 Premavera의 essential oil을 구입한 후 정선하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 오일은 Cypress(Cupressus semper virens : concentration 100%)을 사용하였다. 실험에 쓰는 오일은 Premavera의 essential oil을 구입한 후 정선하여 사용하였다. 양성대조군으로는 항염증제인 Rolipram을 사용하였다.
암컷 8주령의 SPF(specific pathogen-free) BALB/c 생쥐 (18 ∼ 20 g)는 오리엔트바이오(Korea)사에서 공급 받아 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 1-2 시간 (lig ht-dark cycle)의 환경에서 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
USA)를 이용하여 3주간, 1주 3회 100ml씩 30분간 흡입박스 (아크릴제작, 30 cm x 45 cm) 에 분무하였다. 양성대조군으로는 Rolipram을 3 mg/kg 으로 매일 I.P 하였다.
실험에 쓰는 오일은 Premavera의 essential oil을 구입한 후 정선하여 사용하였다. 양성대조군으로는 항염증제인 Rolipram을 사용하였다. 본 실험에 사용된 시약 중 diethyl pyrocarbo nate (DEPC), 2,7-dichlorodihydrofluore-scin diacettate (DCFH-DA), RPMI-1640, isopropano-l, 적혈구용혈액 (RBC lysis solution),dulbecco's pho-sphate buffered sal ine (D-PBS), formaldehyde, lami-de, magnesium, chlori de (MgCl2)는 Sigma 사 (USA) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)는 Hyclone 사 (Log an, USA) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 Mean±Standard Error로 기록하였고, 유의성 검증은 Independent T-test 분석방법을 이용하였다.
이론/모형
실험 종료 후 생쥐는 10% Chloral Hydrate (Fluka, USA)을 복강 내에 투여한 후 혈액을 심장 채혈법으로 포집하고, 원심분리 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리 하여 혈청을 얻었으며, -70℃에 보관하면서 실험에 사용 하였다. 혈액성분과 효소들의 활성도 측정은 바이오톡스텍 (주) (Republic of Korea)에 의뢰하였다.
성능/효과
1. CS 투여군의 기도 과민성은 OVA 유발 천식 대조군에 비해 유의성 있게 억제되었다.
2. CS 투여군에서 폐 세포수, 호산구 수가 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되었다.
3. CS 투여군에서 대조군에 비해 CD3+ T세포, CD4+ T 세포, CCR3+의 유의성 있게 감소를 보였다.
4. CS 투여군에서 폐 조직 내의 IL-5, IL-13과 혈청 내의 IgE가 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다.
FACS로 폐에 침윤된 세포들을 분석한 결과, CD3+세포는 Nr 4.70 ± 0.48, OVA-CT 17.5 ± 2.72, OVA-Rolipra m 7.4 ± 0.28, OVA-CS 13.5 ±0.86로 나타나 OVA-CT 군에 비하여 OVA-CS 군이 유의성(P<0.05)있게 감소하였다[Fig. 5].
본 연구에서 WBC수중 호산구의 비율을 분석한 결과, Nr 1.8 ± 1.0, OVA-CT 7.72 ± 1.52, OVA-Rolipram 3.03 ± 0.73, OVA-CS는 3.15 ± 0.37로 나타나 OVA-CT군에서는 정상군에 비해 호산구의 비율이 현저히 증가하고, 이에 반해 OVA-CS군에서는 호산구의 비율이 유의성 있게 감소됨을 확인하였다[Fig. 3].
알러지성 과민반응에 의해 나타나는 기관지 수축에 미치는 CS오일의 효과를 확인하기 위하여 정상군, 대조군, 양성대조군, 실험군에 Methacholine(MCH) 농도를 점차 증가시켜 그에 대한 기도저항값(Penh)을 측정한 결과, 대조군에서는 MCH의 농도 증가에 따라 Penh값이 증가하는 소견을 보이며, 이에 반해 양성대조군인 Rolipr am은 2.736 ± 0.219, 실험군인 CS은 4.573 ± 0.32로 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다[Fig. 2].
3]. 알러지성 천식에 호산구의 증가가 영향을 주는 것으로 확인되는 것인데, 천식에서 주요한 역할을 하는 호산구의 비율이 CS투여군 에서 유의성 있게 감소된 것은 CS오일이 기도 염증의 주요인자인 호산구의 증식의 억제를 통하여 천식에 유의한 효과를 가지는 것으로 해석된다.
이러한 결과를 종합할 때[Fig. 5-7] 폐 세포와 OVA-C T 군에서 T세포와 호산구의 증가를 확인할 수 있었으며, 이는 증가된 T세포에 의한 싸이토카인 분비로 B 세포 활성과 IgE 분비가 증가하여 비만세포와 호산구의 영향으로 염증반응이 일어난 것으로 보인다. OVA-CS 군에서 이들 세포의 현저한 감소가 이루어진 것은 CS가 T세포의 활성화를 억제하고 호산구의 기도 내 침윤을 억제할 가능성이 있음을 시사한다.
이상의 결과, CS는 OVA로 감작하여 천식을 유발시킨 천식 모델 생쥐의 기관지 과민반응 감소, 호산구 증식 억제, T 세포 감소, IgE 생성량 감소, IL-5, IL-13의 발현량 감소로 천식 유발관련 인자의 억제능이 있음을 확인하였다. 이를 근거로 CS는 천식억제에 유효한 것으로 사료되며, 알러지성 천식의 치료보조제로 가능성이 있을 것으로 판단된다.
10]. 이상의 결과는 IL-4, IL-5, IL-13의 발현량 감소를 통해 알러지원에 의한 천식성 기도염증과 기도과 민성을 완화시켰다고 보고한 선행연구[48]의 결과와도 일치하는 것으로서 CS가 Th2 경로의 항진에 관여하는 사이토카인인 IL-5, IL-13의 발현량 감소를 통해 IgE 생성을 억제하여 천식의 주요병리기전인 염증반응을 억제하는 것으로 생각된다.
01) 있게 감소되었다[Fig 4]. 천식 유발군에서 각종 면역 관련세포를 포함하는 총폐 세포수가 증가되었고, CS 오일 처리군에서 total 폐세포수가 유의성 있게 감소된 이 결과는 차[37]의 마우스 모델을 이용한 비파엽의 알레르기성 천식 억제 효과의 결과와도 부합되는 소견으로 CS오일이 기도내 염증 세포의 증가를 억제하여 염증성 면역세포의 이주 및 침윤을 억제하는 것으로 추정된다. 이는 CS오일이 백혈구내 호산구 수를 감소시킨[Fig.
총 폐 세포수(×107)를 측정한 결과 Nr 0.95 ± 0.05, OVA-CT 2.00 ± 0.10, OVA-Rolipram 1.305 ± 0.10, OVA-CS 1.65 ± 0.25 으로 나타나 OVA-CT 군에 비하여 OVA-CS군이 유의성(P<0.01) 있게 감소되었다[Fig 4].
후속연구
이상의 결과, CS는 OVA로 감작하여 천식을 유발시킨 천식 모델 생쥐의 기관지 과민반응 감소, 호산구 증식 억제, T 세포 감소, IgE 생성량 감소, IL-5, IL-13의 발현량 감소로 천식 유발관련 인자의 억제능이 있음을 확인하였다. 이를 근거로 CS는 천식억제에 유효한 것으로 사료되며, 알러지성 천식의 치료보조제로 가능성이 있을 것으로 판단된다. 향후 사이프러스 오일의 성분별 약리효능 및 농도별 약물 독성 평가 등 성분분석 및 안정성에 관한 좀 더 세심한 연구가 필요하리라 사료된다.
이를 근거로 CS는 천식억제에 유효한 것으로 사료되며, 알러지성 천식의 치료보조제로 가능성이 있을 것으로 판단된다. 향후 사이프러스 오일의 성분별 약리효능 및 농도별 약물 독성 평가 등 성분분석 및 안정성에 관한 좀 더 세심한 연구가 필요하리라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
천식은 무엇인가?
산업화가 빠른 속도로 진행됨에 따른 대기 오염의 가속화, 흡연 인구의 증가, 새로운 항원의 출현 등이 원인으로 작용하여 천식의 발생은 그 이전에 비해 두 배 이상 증가되는 양상을 띠고 있으며[1], 천식으로 인한 사망률 또한 증가하고 있다. 기관지 과민성과 기도 내 염증에 의한 가역적인 기도 폐쇄가 특징적인 호흡기계 질환인 천식은 기도 내로 흡입된 여러 가지 항원에 의하여 T 세포, B 세포, 호산구, 호중구 및 비만세포 등의 염증세포들에 의해 유발되는데 이 중 호산구가 가장 주요한 유발세포로 알려져 있다[2].
천식의 치료제로 스테로이드를 장기적으로 사용할 때 어떤 부작용이 발생하는가?
천식의 치료제는 항염증 효과를 목표로 하는 스테로이드와 같은 증상 조절제와 기관지 확장제와 같이 속효성을 보이는 증상완화제가 있으며 현재까지 가장 효과적인 치료제는 스테로이드이다[6]. 그러나 장기적으로 사용될 경우, 부신기능억제, 골다공증, 골절, 성장지연, 혈압상승 등의 부작용들이 보고되고 있다. 따라서 장기적인 적용이 가능하면서 부작용이 없고, 근본적으로 천식을 치료할 수 있는 천연물 성분을 이용한 천식치료제의 개발이 요구되고 있다.
싸이토카인은 무엇인가?
싸이토카인은 생체의 면역 조절 및 방어에 중요한 역할을 담당하는 생리 활성물질로, Th2 세포의 분화, IgE 생산 또는 호산구의 증식 등의 알러지성 염증에 관여하고 있다.
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